Extracto
MUC17 es un tipo 1 glicoproteína unida a la membrana que se expresa principalmente en el tracto digestivo. Estudios recientes han demostrado que la sobreexpresión aberrante de MUC17 se correlaciona con el potencial maligno de adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC); Sin embargo, el mecanismo de regulación exacta de la expresión de MUC17 aún no se ha identificado. Aquí, proporcionamos el primer informe del mecanismo de regulación MUC17 en condiciones de hipoxia, una característica esencial del microambiente del tumor y una fuerza impulsora de la progresión del cáncer. Nuestros datos revelaron que MUC17 fue significativamente inducida por la estimulación hipóxica través de un factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) ruta dependiente en algunas células de cáncer de páncreas (por ejemplo, AsPC1), mientras que otras células de cáncer de páncreas (por ejemplo, BxPC3) mostraron poca respuesta a la hipoxia . Curiosamente, estas células de baja sensible tienen motivos CpG altamente metilados dentro del elemento de respuesta a hipoxia (HRE, 5'-RCGTG-3 '), un sitio de unión para HIF1α. Por lo tanto, se investigaron los efectos de desmetilación de CpG en la EDH en la inducción hipóxica de MUC17. El tratamiento de células de baja sensible, con 5-aza-2 'desoxicitidina seguido de incubación hipóxica adicional dio como resultado la restauración de hipóxico MUC17 inducción. Además, la metilación del ADN de la EDH en tejidos pancreáticos de pacientes con PDAC mostró mayor estado de hipometilación en comparación con los de tejidos no cancerosos, y la hipometilación también se correlaciona con la expresión de MUC17 mRNA. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la vía de señalización mediada por hipoxia HIF1α contribuye a MUC17 expresión, y la metilación del ADN de la EDH podría ser un factor determinante de la capacidad de inducción hipóxica de MUC17 en las células de cáncer de páncreas
Visto:. Kitamoto S, Yokoyama S, Higashi M, Yamada N, Matsubara S, S Takao, et al. (2012) La expresión de MUC17 está regulada por las respuestas hipóxicas mediados por HIF1α y requiere un grado de metilación-Responsable libre hipoxia en el cáncer pancreático. PLoS ONE 7 (9): e44108. doi: 10.1371 /journal.pone.0044108
Editor: Sharmila Shankar, Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Febrero, 2012; Aceptado: July 30, 2012; De publicación: septiembre 10, 2012
Copyright: © Kitamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por Princes Cancer Research Fund Takamatsu a S. Yonezawa; Subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica de la Investigación Científica (B) 23.390.085 a S. Yonezawa; Investigación Científica (C) 21590399 para M. Higashi; Los científicos jóvenes (B) 24701008 a S. Yokoyama; La investigación científica en las áreas prioritarias 239349 a S. Kitamoto (JSP Fellowship) del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes, Cultura y Tecnología, Japón; una Fundación de Investigación del páncreas Japón para S. Yokoyama; y la Fundación Memorial Kodama, Japón, para M. Higashi. S. Batra es apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones CA78590 (, CA163120, CA133944 y CA111294). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una de las formas más agresivas de cáncer. Debido a sus propiedades de crecimiento y metástasis agresivas, la tasa de supervivencia global de los pacientes con cáncer de páncreas es de 3-5% [1]. morfología avascular es una característica importante de cáncer de páncreas, resultando en una mala sangre y el suministro de oxígeno. En consecuencia, el cáncer de páncreas contiene células tumorales que están en bajas tensiones de oxígeno, una condición llamada hipoxia. La acumulación de pruebas indica que el microambiente hipóxico del tumor se correlaciona íntimamente con características de tumores sólidos incluyendo invasión, metástasis, y la mala respuesta a los tratamientos contra el cáncer [2], [3]. A este respecto, la hipoxia-inducible factor de 1α (HIF1α) se ha identificado como un regulador clave de la respuesta hipóxica, la activación de varios genes relacionados con el cáncer, tales como VEGF, CAIX, y GLUT1.
Las mucinas son fuertemente
proteínas O
-glycosylated encuentran en la capa de moco, y que se expresan diferencialmente en la superficie celular de muchos epitelios. Son los responsables de las propiedades físicas de los geles de moco y están implicados en la protección de las células epiteliales y el mantenimiento del microambiente molecular local de [4], [5], [6], [7]. Por el contrario, también hay evidencia creciente de que las mucinas se expresan de manera aberrante en diversos tipos de cáncer, y que han sido implicados en la transformación maligna así como la proliferación de células tumorales, la supervivencia, la invasión y la metástasis [8], [9], [10]. En este contexto, los estudios recientes revelaron que ciertos mucinas unidas a la membrana son suficientes para inducir la transición epitelio-mesenquimal y por lo tanto representan objetivos atractivos para el tratamiento contra el cáncer [11], [12].
La glicoproteína fue MUC17 caracterizado como una mucina unidas a la membrana [13]. análisis de transferencia de ARN indicó que
MUC17
se expresa principalmente en el tracto digestivo, incluyendo el duodeno, íleon y colon transverso [13], [14]. En condiciones fisiológicas, se ha sugerido que endógeno MUC17 desempeña un papel importante en los procesos de restitución celular y contribuye a la protección de colon-mucosa [15], [16]. Moniaux et al. informó que MUC17 se expresa de manera aberrante en los adenocarcinomas ductales pancreáticas (PDAC), en comparación con su falta de expresión en el páncreas o pancreatitis [17] normal. Además, Hirono et al. también informó de que MUC17 es un factor pronóstico independiente asociado con metástasis en los ganglios linfáticos en el PDAC [18]. Estos hallazgos sugieren que MUC17 puede tener un papel importante en la progresión del cáncer de páncreas. En cuanto al mecanismo de regulación de MUC17, nuestro estudio anterior sugiere que los cambios epigenéticos, incluyendo la metilación de las histonas y modificaciones CpG de ADN en H3-K9 en el promotor proximal MUC17 son determinantes clave de MUC17 expresión [19]. Sin embargo, todavía no está claro qué tipo de factores de transcripción son reclutados al promotor MUC17 y participa en la regulación de la expresión de MUC17
.
En el presente estudio, proporcionar la primera evidencia que describe el mecanismo de regulación de MUC17 en el microambiente del tumor hipóxico. Nuestros resultados muestran que MUC17 es inducida por HIF1α mediación de la respuesta hipóxica, y la metilación del ADN específico determina la capacidad de inducción hipóxica de MUC17 en las células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
declaración Ética
tejidos tumorales pancreáticas humanas se obtuvieron del hospital Universitario de Kagoshima, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes en el estudio. Este estudio fue aprobado por el comité ético del Hospital de la Universidad de Kagoshima.
líneas celulares de cáncer de páncreas y muestras de tejidos humanos
Las líneas celulares de carcinoma pancreático humano AsPC1, BxPC3, HPAFII, y se adquirieron de Panc1 la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE.UU.). células BxPC3 y AsPC1 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.).. células HPAFII se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle (Sigma). células Panc1 se cultivaron en D-MEM (Sigma). Todos los medios se complementaron con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) y 100 U /ml de penicilina /100 g /ml de estreptomicina (Sigma). condiciones de cultivo hipóxicas se lograron con una incubadora de multi-gas que contiene una mezcla de gases compuesta de 94% N
2, 5% de CO
2, y 1% O
2 (ASTEC, Japón). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces menos que se indique lo contrario.
La extracción de RNA y RT-PCR
El ARN total fue extraído utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) y se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, dE, EE.UU.). Para RT-PCR, el ARNm obtenido se inverso-transcrito a cDNA con la alta capacidad de RNA a cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la PCR subsiguiente se muestran en la Tabla S1. PCR se realizó con los AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo del fabricante.
extracción de proteínas y Western blotting
Las células se cultivaron en placas de 6 cm en condiciones de hipoxia para su los horarios establecidos. Lisados de células totales se prepararon usando tampón RIPA que contiene cóctel inhibidor de la proteasa (Nacalai Tesque, Japón). Después de la cuantificación por el ensayo BCA (Thermo Scientific), cantidades iguales se resolvió por 3-8% SDS-PAGE y se electrotransfirieron a membranas de PVDF. Para el análisis de la expresión de MUC17, los lisados de proteínas se resolvieron en geles de agarosa al 2% que contenían SDS y pasivamente transferidos sobre membranas de PVDF y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Las membranas se bloquearon con 1% de leche descremada /PBST durante 2 h y se sometieron al procedimiento de inmunodetección estándar usando anticuerpos primarios específicos. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: MUC17 anti-humano (conejo pAb, 1:1000, generada por uno de los autores, el Dr. Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Omaha, NE, EE.UU.); HIF1α anti-humano (mAb de ratón, 1:1000, H1alpha67, Novus Productos Biológicos), y anti-humana α-tubulina (mAb de ratón, DM1A, Sigma).
ARN de interferencia
En el ARN de interferencia (RNAi), los experimentos,
HIF1A
expresión fue silenciada usando On-Target además siRNA (Dharmacon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. se utilizó en el blanco más siCONTROL no siRNA dirigidos como control. células AsPC1 se sembraron en placas de 6 cm, y en 50 a 60% de confluencia, se transfectaron con 13,6 nmol /L siRNA usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
Dual-Luciferase reportero de ensayo
La secuencia flanqueante 5 '(-687 a 53) de MUC17 humano se amplificó usando ADN genómico aislado de células AsPC1. El fragmento de PCR se digirió con NheI y XhoI y se clonó en el vector pGL4.17 (Promega). Para generar mutantes de EDH de la MUC17 promotor humano, se utilizó un kit de mutagénesis QuikChange Site-Directed relámpago (Stratagene). Los conjuntos de cebadores se muestran en la Tabla S1. Para el ensayo dual reportero de luciferasa, las células AsPC1 se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se transfectaron transitoriamente con 75 ng del plásmido indicador de luciferasa usando JetPEI (Polyplus transfección) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, la actividad luciferasa en los lisados de células totales se ensayó después de 24 h utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) en un lector de microplacas multimodo Tristar LB 941 (Berthold Technologies). El gen indicador de luciferasa de Renilla expresada en un vector pGL4.74 se transfectó simultáneamente como control interno.
inmunoprecipitación de la cromatina
La inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayo se realizó utilizando un kit Shearing-chip y un kit OneDay chip (Diagenode, Filadelfia, PA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En breve, los complejos de nucleoproteínas se sometieron a ultrasonidos para reducir los tamaños de los fragmentos de ADN de 300 a 500 pb mediante el uso de un Bioruptor (Cosmo Bio). Un microgramo de IgG de ratón normal se usó como el control negativo, y anticuerpo de ratón anti-humano HIF1α se utilizó para cada inmunoprecipitación. ADN inmunoprecipitado fue amplificado por PCR como se describió anteriormente. Los cebadores de chip fueron diseñados para apuntar el sitio HRE del promotor MUC17. Los cebadores para la PCR subsiguiente se muestran en la Tabla S1. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 5 min, 34 ciclos a 96 ° C durante 5 s, 59 ° C durante 5 s, y 68 ° C durante 7 s, y una reacción de extensión final a 72 ° C durante 1 min. Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%.
metilación del ADN análisis
Para el análisis de CpG desmetilación, las células se incubaron con AsPC1 1 M 5-azadC (Sigma) durante 7 días. Al final del tratamiento, el ADN y las proteínas se extrajeron para la PCR específica de metilación (MSP) y transferencia Western. Extracción de ADN y MSP se realizaron de acuerdo con los métodos estándar. En breve, el ADN total a partir de líneas de células y tejidos se extrajeron utilizando un Sistema de DNeasy Tissue (Qiagen). modificación con bisulfito del ADN genómico (2 g) se realizó utilizando un Kit de bisulfito Epitect (Qiagen), y cantidades iguales de ADN modificado se amplificaron por PCR usando el AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems). La especificidad de los cebadores MSP está influenciada en gran parte por las características termodinámicas del extremo 3 'del cebador propuesto. Por lo tanto, hemos creado el residuo citidina de CpG dentro de la EDH como el extremo 3 'del cebador MSP. El cebador de U está diseñado para la amplificación de bisulfito de sodio convierte ADN en una condición de no metilado, mientras que el cebador M es específico para bisulfito de sodio convierte ADN metilado. Los pares de cebadores dirigidos-HRE se muestran en la Tabla S1. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 96 ° C durante 5 s, 59 ° C durante 5 s, y 68 ° C durante 5 s, y una reacción de extensión final a 72 ° C durante 1 min. Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%.
Para investigar más la correlación de la expresión de MUC17 con el estado de metilación en muestras biológicas, los tejidos tumorales pancreáticas se obtuvieron de las muestras de páncreas resecado quirúrgicamente de 10 pacientes con PDAC . tejidos pancreáticos normales se obtuvieron de los mismos pacientes de las zonas distantes del tumor. Todas las muestras de tejido se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Para llevar a cabo MSP y RT-PCR, el ADN total y ARN fueron aisladas de los tejidos y se analizaron como se ha descrito previamente. Las bandas obtenidas a partir de MSP y RT-PCR se cuantificaron por Image J mercancías suaves, y el nivel relativo de no metilación en cada muestra se calculó como un índice de estado de no metilación usando la ecuación (%) = U /(U + M). La correlación de la expresión de ARNm MUC17 con el estado de metilación de la EDH se analizó mediante el test de Spearman.
Análisis estadístico
En los ensayos de reportero de la luciferasa y el chip, se determinaron las diferencias estadísticas utilizando una doble cara estudiante de
t-test
. Para investigar la correlación entre el estado de metilación de EDH y expresión MUC17 en muestras de tejido, se realizó la prueba de Spearman utilizando el software estadístico R versión 2.12.2. P & lt; 0,05 se consideró significativo un
Resultados
La expresión de MUC17 se incrementa en condiciones de hipoxia en las células de cáncer de páncreas
Para examinar el efecto de la exposición hipóxica en la expresión de MUC17, nos cultivadas. células pancreáticas cancerosas humanas AsPC1 bajo condiciones de cultivo hipóxicas (1% O
2) durante 2 días. En el análisis de RT-PCR, la expresión de MUC17 y CAIX, un marcador de hipoxia, se incrementó significativamente, mientras que los niveles de mRNA fueron HIF1α estable bajo condiciones de hipoxia, lo que confirma la regulación postranscripcional ya se ha informado de HIF1α [20]. También se empleó la transferencia Western para examinar el nivel de proteína MUC17, y reveló una inducción destacada de expresión MUC17 y HIF1α de una manera dependiente del tiempo (Figura 1A y 1B). Hasta la fecha, HIF1α es conocido como un regulador clave de la respuesta hipóxica en muchos tipos de cáncer. HIF1α se une al elemento de respuesta a hipoxia (HRE, 5'-RCGTG-3 '), un sitio de unión para HIF1α, y transactivates muchos genes sensible a la hipoxia, incluyendo VEGF, GLUT1 y CAIX. Se realizó análisis de la secuencia del promotor MUC17 aproximadamente 3,0 kb con el software MatInspector (Genomatix) y encontramos un HRE putativa (+ 37 /+ 41) en la región promotora proximal de MUC17. Por lo tanto, la hipótesis de que la sobreexpresión de MUC17 en condiciones de hipoxia está mediada por HIF1α. Para examinar el efecto de la hipoxia sobre la actividad transcripcional del promotor de MUC17, se construyó un vector reportero MUC17 promotor de luciferasa que contiene el sitio HRE. Bajo condiciones de hipoxia, las células AsPC1 transfectadas con este constructo exhibido aumentado significativamente la actividad de reportero (Figura 1C), lo que sugiere que el aumento de la expresión MUC17 en condiciones de hipoxia se debe a un aumento de la actividad transcripcional.
células (A) AsPC1 fueron cultivadas en condiciones hipóxicas (1% O
2) durante los tiempos indicados. expresión MUC17 mRNA fue examinado por RT-PCR en cada punto de tiempo. (B) células AsPC1 se cultivaron en condiciones de normoxia o condiciones hipóxicas durante los tiempos indicados. Los lisados celulares se probaron con anti-MUC17, HIF1α, y los anticuerpos a-tubulina mediante análisis de transferencia Western. Las intensidades de las bandas se cuantificaron por barrido densitométrico, y la relación de MUC17 para alfa-tubulina expresión se muestra debajo de cada banda como la intensidad relativa en comparación con la obtenida en las células AsPC1 de normoxia. (C) MUC17 la actividad del promotor se midió por una luciferasa Dual-reportero de ensayo. Después de la transfección del plásmido reportero MUC17, las células AsPC1 se incubaron bajo condiciones de normoxia o hipoxia durante 24 h. Los lisados celulares se analizaron utilizando un kit de ensayo de luciferasa en un lector de microplacas multimodo Tristar LB941 (Berthold Technologies). Eficacia de la transformación se normalizó sobre la base de la actividad de luciferasa de Renilla. La actividad promotora en condiciones de normoxia se le dio un valor de 1. Los valores de p se determinaron utilizando de Student
t-test
. * P & lt;. 0,05
hipóxico inducción de MUC17 está regulada por la HIF1α dependiente de la vía de señalización
Con el fin de investigar si HIF1α está realmente implicado en la inducción hipóxica de MUC17, nos examinado el efecto de silenciamiento HIF1α en la inducción hipóxica MUC17 en las células AsPC1 mediante el uso de siRNAs. Bajo hipoxia, el control de siRNA no tuvo ningún efecto sobre la transcripción de MUC17, HIF1α, CAIX, y ß-actina. Por el contrario, el tratamiento con siRNAs dirigidos HIF1α llevó a una disminución importante de hipóxico MUC17 inducción, así como CAIX (Figura 2B). El mismo resultado se observó a nivel de proteínas (figura 2B), lo que indica la implicación de HIF1α en hipóxica MUC17 inducción.
(A) Después de la transfección de siRNAs HIF1A, las células AsPC1 se cultivaron bajo normoxia (N) o hipoxia (h) durante 24 h. El nivel de mRNA se midió mediante RT-PCR. lisados (B) celulares a partir de células tratadas con siRNAs AsPC1 HIF1A se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. α-tubulina sirve como control de carga. (C) Las densidades de las bandas adquiridas de análisis de transferencia de Western se cuantificaron y se expresó como veces en relación aumenta en comparación con la obtenida a partir de células de simulacro de las condiciones de cultivo hipóxicas. ns: no significativo. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0.005
La hipoxia aumenta el reclutamiento de HIF1α a HRE y activa la transcripción MUC17
Para evaluar la participación de HIF1α en MUC17 regulación transcripcional, nos chip ensayos realizados. El resultado reveló que el anticuerpo anti-HIF1α enriquecido significativamente los fragmentos de promotor MUC17 que albergan HRE en condiciones de hipoxia, pero no bajo condiciones de normoxia (Figura 3A y 3B). Además, hemos probado si la EDH fue de hecho esencial para la inducción de la hipoxia-transactivación MUC17. vectores indicadores que albergan mutaciones en el sitio de HRE se construyeron y se transfectaron en células AsPC1 en condiciones de hipoxia. Como se muestra en la Figura 3C, las células transfectadas con cualquiera de los vectores mutantes exhibieron reducción significativa de transactivación en comparación con la de las células de constructos transfectados promotor de tipo salvaje, lo que indica el papel esencial del sitio HRE en la inducción hipóxica MUC17.
(a) la unión de HIF1α a la cromatina se confirmó mediante un ensayo de chIP. células AsPC1 se cultivaron bajo normoxia o hipoxia durante 24 h. Se realizó la PCR con cebadores específicos que cubren HRE. (B) Las densidades de las bandas adquiridas en el panel (a) se cuantificaron utilizando la imagen J (NIH) y se normalizó a la Entrada incluida en cada experimento. (C) Para evaluar la actividad de transactivación de HIF1α través de la EDH, se llevó a cabo un ensayo de luciferasa dual. células AsPC1 fueron transfectadas con los de tipo salvaje o mutante HRE construcciones del promotor MUC17 en condiciones de hipoxia durante 24 h. Los valores de p se determinaron utilizando de Student
t-test
. ns: no significativo. * P & lt; 0,01, ** P & lt;. 0.001
patrón de expresión diferencial de MUC17 inducida por la hipoxia en varias líneas celulares de cáncer de páncreas
Además, se evaluó si la inducción hipóxica de MUC17 es un evento universal en células de cáncer pancreático. líneas celulares adicionales (BxPC3, HPAFII, y Panc1) se cultivaron en condiciones de hipoxia durante 2 días, y se monitorizaron los niveles de expresión de ARNm. Los resultados revelaron que los niveles de expresión en MUC17 AsPC1 y células HPAFII se incrementaron significativamente en condiciones de hipoxia. Por el contrario, sólo se observó un ligero aumento de la BxPC3 y las células Panc1 (Figura 4A). En este contexto, se informó recientemente de que la hipometilación del ADN es un factor clave para la expresión MUC17 en el cáncer pancreático (Figura 4B). Curiosamente, AsPC1 y HPAFII células, que exhiben prominente MUC17 inducción en condiciones de hipoxia, muestran una HRE casi completamente no metilado (Nº 13) dentro del promotor MUC17, mientras que BxPC3 y células Panc1 habían HREs [19] altamente metilado. Por lo tanto, la hipótesis de que el estado de metilación del ADN de la EDH determina la inducción MUC17 en respuesta a la hipoxia.
(A) Diferencial patrón de expresión de MUC17 inducida por la exposición hipóxica en líneas celulares de cáncer de páncreas. Cada línea celular pancreática se cultivó en condiciones (N) o hipoxia (H) de normoxia. Nivel de ARNm se determinó mediante RT-PCR en cada punto de tiempo. (B) La secuencia promotora humana MUC17 gen, que abarca las posiciones -687 a +302 con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Los números de los sitios CpG están subrayados. El sitio de HRE contiene el sitio CpG (Nº 13).
estado de metilación del ADN de la EDH determinó la capacidad de inducción de la expresión de MUC17 hipoxia
Para investigar la implicación de la metilación del ADN de la EDH en expresión MUC17 en condiciones de hipoxia, se trataron células BxPC3 y Panc1 con 5-AzadC (un agente de desmetilación de ADN) durante 7 días, y se incubaron las células durante otras 24 h bajo normoxia o hipoxia. En primer lugar, se confirmó el efecto desmetilación del tratamiento con 5-AzadC la EDH por MSP (Figura 5A). A continuación, se analizó la expresión de MUC17 en las células tratadas con 5-AzadC en condiciones de hipoxia, lo que resulta en la restauración de la expresión de MUC17 sólo en las células tratadas con 5-AzadC tratamiento en condiciones de hipoxia (Figura 5B).
(A) La desmetilación de los sitios CpG en el promotor de MUC17 en las células BxPC3 y Panc1 después del tratamiento 1 M 5-azadC. MUC17-negativos líneas /bajos de células se trataron con o sin 5-azadC durante 7 días. El estado de metilación del promotor de MUC17 albergar HRE fue examinado por MSP. Los productos de PCR marcados M (metilado) se amplificaron mediante cebadores específicos de metilación, y los U marcado (no metilado) se amplificaron mediante cebadores específicos para el ADN no metilado. (B) La restauración de la expresión de MUC17 en líneas celulares de cáncer de páncreas en tratamiento con 5-azadC. Las células fueron tratadas con o sin 5-azadC durante 7 días. Durante las últimas 24 horas, cada grupo se cultivó en condiciones (N) o hipoxia (H) de normoxia. expresión de MUC17 fue examinado por Western Blot.
MUC17 expresión se correlaciona con la hipometilación en la EDH dentro de la región promotora
Además, para evaluar la importancia biológica de la EDH metilación en la expresión de MUC17, hemos examinado expresión MUC17 y estado de metilación en tejidos normales y tumorales pancreáticas de pacientes con PDAC por RT-PCR y MSP, respectivamente. En consonancia con los informes anteriores [17], [18], MUC17 ARNm y proteínas se sobreexpresa en PDAC (Figura 6 A y B). En el análisis de MSP utilizando 10 muestras apareadas PDAC (tejidos no cancerosos, n = 10, los tejidos cancerosos, n = 10), las señales no metiladas se observaron significativamente en los tejidos con PDAC en comparación con los de tejidos no cancerosos (de dos colas Student de
t-test
, P = 0,007). También se investigó la correlación entre la expresión de MUC17 mRNA y el estado de metilación de la EDH. El nivel de ARNm MUC17 fue fuertemente correlacionada con el estado hipometilación de la EDH dentro del promotor MUC17 en el cáncer de páncreas (Figura 6C).
(A) la expresión de MUC17 ARNm y el estado de metilación de EDH en el páncreas normal (N) y los tejidos tumorales pancreáticas (t) se examinó por RT-PCR y MSP, respectivamente. (B) los datos representativos de tinción inmunohistoquímica para MUC17 en un paciente con PDAC. Barra de escala, 100 micras. (C) Correlación de la expresión de MUC17 mRNA y el estado de metilación HRE se analizó mediante la prueba de Spearman. Las densidades de las bandas adquiridas se cuantificaron utilizando Image J, y la cantidad relativa de no metilación en cada muestra se calculó como índice del estado de no metilación aberrante utilizando la ecuación (%) = U /(U + M).
Discusión
estudios recientes han identificado MUC17 humano, que se sobreexpresa en PDAC, como un factor pronóstico independiente de la metástasis de los ganglios linfáticos [17], [18]. Aunque poco se sabe sobre el papel funcional de MUC17 en el cáncer, la comprensión del mecanismo de regulación de MUC17 puede ser un paso clave en el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico y tratamiento del cáncer.
En el presente estudio, se investigó la regulación hipóxica de MUC17 en las células de cáncer de páncreas. Nuestros resultados demuestran que MUC17 se induce de manera significativa por la hipoxia en una manera dependiente del tiempo, y esta regulación al alza está mediada directamente por HIF1α. Por otra parte, el uso de cuatro líneas celulares con diferentes MUC17 inducibilities hipóxicas nos ha permitido proponer un modelo para la regulación epigenética de MUC17 en el cáncer de páncreas. Proponemos que la metilación del ADN de la EDH inhibe la transactivación mediada por HIF1α MUC17 en células con baja capacidad de inducción hipóxica MUC17, mientras que la hipometilación progresiva de la EDH permite un aumento importante en la expresión de MUC17 en condiciones de hipoxia en las células con alta capacidad de inducción hipóxica. Hay evidencia creciente de que la metilación de sitios CpG en regiones promotoras afecta a la inducción de la expresión génica por HIF1α, presumiblemente mediante la limitación del acceso de los factores de transcripción de
cis-actuando elementos
[21], [22]. Como se muestra en la Figura 6, la hipometilación de HRE dentro del promotor MUC17 es un evento frecuente en los tejidos pancreáticos de pacientes con PDAC. Aunque se necesitan más estudios para dilucidar los otros factores que intervienen en la expresión de MUC17, esto podría explicar por qué MUC17 se sobreexpresa en el cáncer de páncreas. En cuanto a la falta de inducción CAIX en las células Panc1, se ha demostrado que la expresión CAIX es, al menos en parte, regulada por sitio específico hipometilación CpG en -74 pb en el promotor en el carcinoma de células renales y otros tipos de células del cáncer [23] , [24], [25]. Por lo tanto, esta respuesta también puede verse afectada por el estado de metilación del ADN de la EDH dentro del promotor CAIX.
Hay algunas implicaciones para considerar el papel funcional de MUC17 en el desarrollo del cáncer. En tumores sólidos, debido a la proliferación sin restricciones de las células cancerosas y la vascularización inadecuada, la falta de oxígeno (hipoxia) y la privación de nutrientes se reconocen como características esenciales de la microambiente tumoral y una fuerza impulsora de la progresión del cáncer. Recientemente, se ha informado de que MUC1, que también se identifica como una mucina inducible por hipoxia, podría promover la autofagia, proporcionando una ventaja de supervivencia en el microambiente de baja glucosa-tensado a través de la supresión de la glucosa aumenta de privación inducida de los niveles de ROS en el cáncer de colon [26]. Además, también se ha informado de que la transfección estable de pequeños ARN de horquilla de orientación endógena MUC17 en las células de cáncer de colon LS174T dado lugar a la reducción de la agregación de células, la adhesión reducida célula-célula y la migración, y la mayor susceptibilidad a la apoptosis [15]. Estos hallazgos indican que MUC17 podría tener algunas funciones, como la migración celular, invasión, la resistencia a la apoptosis y la adaptación a microambientes estresados en la progresión del cáncer de páncreas
.
Las alteraciones de la metilación del ADN es uno de los más notables cambios epigenéticos en el cáncer humano . La evidencia acumulada sugiere que la metilación del ADN aberrante se observa con frecuencia incluso en las etapas tempranas y precancerosas de la carcinogénesis humana y puede ser un indicador de riesgo de carcinogénesis, un marcador de diagnóstico precoz del cáncer, y un predictor biológica de las neoplasias malignas del cáncer [27], [ ,,,0],28]. Se ha informado de que las modificaciones epigenéticas incluyendo la metilación del ADN contribuyen en gran medida a la expresión de genes de la familia de mucina humanos en el cáncer [19], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. Zhu et al. han informado de un aumento aberrante en tanto la expresión como la hipometilación del MUC4 durante PanIN-PDAC progresión [35]. Además, hemos desarrollado un nuevo método para la detección de patrones de metilación del ADN llamados MSE, lo que permitió la detección de metilación alterada en el jugo pancreático y reveló la significativamente diferentes patrones de metilación en el promotor MUC1 entre neoplasia papilar mucinosa intraductal y PDAC, indicando su uso potencial de diagnóstico [36]. Aunque se necesitan más estudios para aclarar la importancia clínico-patológico y mecanismos precisos de la expresión de MUC17, estos resultados plantean la posibilidad de que el estado de metilación del promotor MUC17 es un marcador epigenético para el diagnóstico de riesgo carcinogénico y la predicción de los resultados de los pacientes con PDAC. Tomados en conjunto, nuestro estudio demuestra por primera vez que la expresión de MUC17 se ve reforzada por la respuesta hipóxica mediada por HIF1α y que la metilación del ADN de la EDH es un factor determinante de la capacidad de inducción hipóxica de MUC17 en el cáncer de páncreas. En el futuro, se exploró la importancia de estos hallazgos en la patogénesis del cáncer de páncreas.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
oligonucleótidos sintéticos utilizados en este estudio. Los oligonucleótidos sintéticos que figuran con el número de posición con respecto al sitio de inicio de la transcripción. En el análisis de MSP, * indica el cebador U para alelos metilados. ** Indica el cebador M para los alelos metilados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044108.s001 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores agradecen a la Sra Izumi Hojo y Yukari Nishimura por su excelente asistencia técnica.