Extracto
Las acuaporinas (AQP) son proteínas de los canales de agua que juegan un papel importante en el movimiento del agua transcelular y transepitelial. Recientemente, el papel de AQPs en la carcinogénesis humana se ha convertido en un área de gran interés. Aquí, mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC), hemos encontrado una expresión de la proteína AQP5 en el 35,3% (IHC-score: ≥1, 144/408) de las muestras de tejido de NSCLC resecado. Los casos con AQP5 positivo de estado (IHC-score: ≥2) muestran una mayor tasa de recurrencia del tumor que negativos en NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005) y la supervivencia libre de enfermedad peor (p = 0,033; OR = 1,52; IC del 95%: 01.04 a 02.23). Más
in vitro
ensayo de invasión en el uso de células BEAS-2B y NIH3T3 transfectadas de forma estable con construcciones de sobreexpresión de larga duración de tipo salvaje (AQP5 AQP5) y sus dos mutantes, N185D que bloquea el tráfico de membrana y S156A que la fosforilación de Ser156 bloques , mostró que AQP5 inducida invasiones de células mientras que los dos mutantes no lo hicieron. En las células BEAS-2B, la expresión de AQP5 provocó un cambio y las pérdidas de los contactos célula-célula y la polaridad celular morfológico-husillo y como fibroblástica. Sólo las células con AQP5, no cualquiera de los dos mutantes, exhibieron una pérdida de marcadores de células epiteliales y una ganancia de marcadores de células mesenquimales. En un SH3-dominios array proteína humana, extractos celulares de BEAS-2B con AQP5 mostraron una actividad de unión a SH3 robusto-dominios de la c-Src, Lyn, y Grap2 C-terminal. Además, en el ensayo de inmunoprecipitación, activado c-Src, fosforilados en Tyr416, mostró una actividad de unión más fuerte a los extractos celulares de BEAS-2B con AQP5 en comparación con N185D o S156A mutante. La fluorescencia en el análisis de hibridación in situ (FISH) no mostró evidencia de la amplificación genómica, lo que sugiere la expresión de AQP5 como un evento secundario. Sobre la base de estas observaciones clínicas y moleculares, se concluye que AQP5, a través de su fosforilación en Ser156 y la posterior interacción con c-Src, juega un papel importante en NSCLC invasión y, por lo tanto, puede proporcionar una oportunidad única para el desarrollo de una nueva diana terapéutica, así como marcador pronóstico en CPNM
Visto:. Chae YK, J Woo, Kim MJ, Kang SK, Kim MS, Lee J, et al. (2008) La expresión de acuaporina 5 (AQP5) promueve la invasión tumoral en no humano del cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 3 (5): e2162. doi: 10.1371 /journal.pone.0002162
Editor: José Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2008; Aceptado: March 13, 2008; Publicado: 14 de mayo de 2008
Derechos de Autor © 2008 Chae et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por la subvención SPORE CA96784-01 P50 (CM), Cancer Research beca de Pyung-Ya Fundación (CM), y la beca de investigación KOSEF R01-2004-000-10670-0 y la Fundación de investigación Corea subvención KFR- 2004-041-E00064 (a SJJ)
Conflicto de intereses:. DS es un consultor pagado a Cangen Biotecnología
Introducción
Las acuaporinas (AQP) representan una familia de. proteínas de los canales de agua transmembrana ampliamente distribuidos en varios tejidos de todo el cuerpo y desempeñan un papel importante en el movimiento transcelular y agua transepitelial [1], [2]. Hasta ahora, al menos diez AQPs distintas se han caracterizado en los seres humanos y no ha habido una comprensión cada vez mayor de su papel en la fisiopatología humana [2]. Sin embargo, sólo recientemente ha surgido datos sobre el papel de AQPs humanos (hAQPs) como uno de los elementos clave que participan directamente en la carcinogénesis humana [3]. Expresión de hAQP1 está frecuentemente relacionada con el cáncer de colon, cáncer pancreático, tumor cerebral, carcinoma de células renales, y microvasos de (MM), en paralelo con la angiogénesis [4] - [8]. Del mismo modo, la expresión de AQP5 se incrementó en el cáncer de páncreas y cáncer de ovario [7], [9]. Por otra parte, hemos informado anteriormente de la inducción de la expresión AQP5 en su mensaje durante el desarrollo precoz del cáncer de colon [5].
A nivel funcional, AQP1 se demuestra que es uno de los genes de respuesta temprana retardados y también participa en la migración celular y la angiogénesis [10], [11], y la expresión de AQP1, AQP3 y AQP5 fueron inducidos durante la activación de linfocitos [12]. Anteriormente, hemos proporcionado evidencia de nuevas propiedades oncogénicas de AQP1 y su expresión en muestras de tejido resecado de cáncer de pulmón no microcítico. Otra prueba de la función de AQP5 en la carcinogénesis humana también fue proporcionado por nuestro grupo [13], [14]. La expresión ectópica de AQP5 en las células NIH3T3 inducida por muchos fenotípica cambios característicos de la transformación tanto
e in vitro
in vivo
por la promoción de vías de señalización activadas por Ras, que es inducida por la fosforilación del sitio consenso PKA de AQP5.
en este estudio, se investigó el papel de AQP5 en el cáncer de pulmón. AQP5 fue elegido sobre la base de una serie de estudios: En primer lugar, nuestro estudio preliminar mostró que, entre AQP1, 3, y 5, AQP5 mostró el potencial oncogénico más robusto en la línea celular NIH3T3. En segundo lugar, aunque ambos mostraron AQP1 y AQP5 propiedad oncogénico con la línea celular NIH3T3, la expresión AQP5 inducida por la activación de ERK [13], mientras que la expresión AQP1 no [15]. En tercer lugar, la expresión de AQP5, no AQP1, o AQP3, fue encontrado para ser asociado con Ras /ERK /activación de la vía Rb en las líneas celulares de cáncer de colon y fue ligado con metástasis de hígado en pacientes con cáncer de colon [16]. Hemos demostrado previamente la expresión de AQP1 en tejidos de cáncer de pulmón primario humanos; 18 de las 44 muestras de pacientes con cáncer no pequeñas de pulmón de células mostraban expresión de la proteína AQP1 positivo. Sin embargo, se ha demostrado que la AQP5 mostró más robusto potencial oncogénico de AQP1 así como AQP3 en el ensayo de agar blando, se centran ensayo de formación, y la proliferación celular (MTT) ensayo [13] - [15], que nos lleva a elegir AQP5 para su papel en la carcinogénesis de pulmón no sólo para estudio de validación clínica, sino también para los estudios en sus mecanismos moleculares subyacentes
.
a continuación, presentamos tanto evidencia molecular y clínica que AQP5 puede jugar un papel en la progresión de cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC). En primer lugar, basado en el análisis inmunohistoquímico de tejidos hAQP5 con 408 NSCLC, hemos investigado si el perfil de expresión de AQP5 en el cáncer de pulmón humano se correlaciona con la progresión de la enfermedad y la supervivencia. A continuación, hemos llevado a cabo la invasión de ensayo y estudio de marcador de transición epitelio-mesenquimal de las células epiteliales bronquiales humanas que sobreexpresan AQP5 contra sus mutantes, además de falso control, seguido de más estudios de interacciones moleculares para dilucidar vía mediada AQP5. Por otra parte, se realizó el análisis FISH para identificar los mecanismos moleculares de expresión hAQP5 subyacente.
Métodos
Cultivo de células
Todas las líneas celulares se obtuvieron de la Colección de Tejidos Tipo Americano (Rockville, MD ). La línea celular de fibroblastos murinos NIH3T3 se cultivaron en DMEM en presencia de 10% de FBS. La línea celular de pulmón normal BEAS-2B se cultivó en LHC-9 medio en presencia de 0,5 factor de ng /ml de crecimiento epidérmico recombinante (EGF), 500 ng /ml de hidrocortisona, 0,005 mg /ml de insulina, 0,035 mg /ml de extracto de pituitaria bovina , 500 nM etanolamina, 500 nM fosfoetanolamina, 0,01 mg /ml de transferrina, 6,5 ng /ml de 3,3 ', 5-triyodotironina, 500 epinefrina ml /ng, 0,1 ácido ml /ng retinoico (Clonetics Corporation, Walkersville, MD). Todas las células se cultivaron en 5% de CO
2 equilibrada del aire a 37 ° C.
Construcciones de plásmidos y la producción de líneas celulares estables
ADNc humano de células HEK 293 se amplificó por cadena de la polimerasa de reacción (PCR) usando cebadores para la de tipo salvaje AQP5 (AQP5) y luego insertado en el sitio EcoR I y XhoI de pcDNA 3.1 (+). Los clones fueron confirmados por análisis de restricción y por secuenciación del ADN de ambas cadenas. Serina 156 o asparagina 185 se sustituyó por alanina o ácido aspártico, respectivamente, por mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR para producir el mutante S156A o N185D AQP5 basado en la AQP5 pcDNA3.1 constructo como se describe anteriormente [13]. AQP5 WT y dos mutantes se insertaron en los sitios EcoR I y BamH I de p3XFLAG-CMV-14 (Sigma) y se verificaron por secuenciación del ADN de ambas cadenas de los mutantes. Las construcciones de expresión se transfectaron en células NIH3T3 y BEAS2B con FuGENE 6 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todos los transfectantes se seleccionaron con 800 g /ml G418 durante 3 semanas y los clones seleccionados se cribaron con transferencia Western utilizando anticuerpo AQP5 y /o RT-PCR. Cuando la confluencia, las células se subcultivaron por tripsinización (0.05% de tripsina, EDTA 0,53 mM en solución salina equilibrada de Hanks). Las imágenes que muestran la morfología de varias células estables que expresan diferentes construcciones fueron tomadas a través de microscopía de contraste de fase (ECLIPSE TE300, Nikon Co., Tokio, Japón).
Invasión de ensayo
ensayo de invasión de Matrigel fue realizado con células NIH3T3 y BEAS2B. BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) que se reconstituye la membrana basal fue adquirido para evaluar la invasión de células. fueron re-hidratado 24 pocillos insertos de placas de cultivo de tejidos recubiertos con Matrigel durante 2 horas en 37 ° C medios de comunicación. Medios (0,6 ml) que contenía suero bovino fetal al 5% se añadieron a cada placa así como un quimioatrayente, y se añadió a cada inserto de 0,2 ml (2 × 10
4 células) de suspensión celular. Después de la incubación durante 24 horas, las células no invasoras se eliminaron de la cara superior de la membrana mediante lavado. Para minimizar el efecto de la proliferación celular en el ensayo de invasión, hemos confirmado que, en las primeras 24 horas, las células BEAS-2B sufren una división mínima celular y no muestran ninguna diferencia notable en la proliferación celular entre las células que expresan AQP5 y células que expresan vectores maqueta (Fig. S1). La invasión de las células a la parte inferior de la membrana recubierta con Matrigel se detectó por tinción de las células con una solución de hematoxilina de Mayer y la visualización de las células bajo un microscopio. Después de la tinción, las células se contaron con un microscopio en cuatro campos seleccionados al azar (aumento x 100) y los resultados se expresaron en forma de un gráfico de barras. Los ensayos se realizaron con los pocillos por triplicado para cada condición.
inmunotransferencia e inmunoprecipitación
lisados de células y tejidos cultivados se prepararon en tampón de lisis enfriado en hielo NP-40 (mM Tris-HCl 10 (pH 7,4), NaCl 137 mM, 10% de glicerol y 0,1% Nonidet P-40) que contiene un cóctel de inhibidores de 10 mM de fosfato de β-glicerol, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, mM NaF 10, Na 10 mM ortovanadato, 4,5 U /ml de aprotinina ( Sigma), y 1 mg /ml de leupeptina (Sigma). lisados de proteína bruta (30 g) se separaron por 12% SDS-PAGE (BioRad), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad), y se bloquearon durante 1 hora con 5% de leche descremada en polvo en solución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween 20. La tras anticuerpos comerciales se utilizaron para el análisis Western blot anti-AQP5 (1:200, Alpha Diagnostic), anticuerpo anti-α-catenina (1:1000, Señalización celular) anticuerpo anti-γ-catenina (1:1000, Señalización celular) , anticuerpo anti-fibronectina (1:1000, Señalización celular), anti-vimentina anticuerpo (1:1000, la señalización celular), anticuerpo anti-E-cadherina (1:1000, la señalización celular), anticuerpo anti-Src c (1 :1000, Señalización celular), anticuerpo anti-fosfato Src (1:1000, Señalización celular), anticuerpo anti-Lyn (1:1000, Señalización celular), anticuerpo anti-grap2 (1:1000, Señalización celular), y anti- β anticuerpo actina (1:5000; Sigma). Se usó primer anticuerpo fosfo-Src; Las transferencias entonces fueron despojados y volver a inmunotransferencia con anti-src y anticuerpos beta-actina. Se utilizaron; adecuada anti-conejo y rábano picante anti-ratón de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Amersham 1:3000). Las bandas inmunorreactivas se detectaron por un aumento de quimioluminiscencia (Pierce).
dominio SH3
gama vinculante de dominio
TranSignal SH3 III manchado de péptidos que representan 34 dominios SH3 humanos diferentes, incluyendo Grb2 y Src, se adquirieron de Panomics y probado para su unión a los segmentos de AQP5 y AQP5 WT mantener topología natural según las instrucciones del fabricante. Las proteínas que contienen el dominio SH3-de la matriz fueron vistos por duplicado. Brevemente, filtros de membrana se incubaron con proteína /ml 30 g durante la noche. Después del lavado, la proteína de unión se visualizó por incubación con HRP conjugado anticuerpo-His o anticuerpo FLAG. Este ensayo se realizó al menos dos veces con cada proteína.
Identificación de proteínas y la interacción
Para los ensayos de pull-down, proteínas de fusión GST (proteínas que contienen el dominio SH3-GST) y se adquirieron de Panomics. Las células se lisaron en tampón de lisis NP-40, y los lisados se incubaron a continuación con cualquiera de GST o proteína de fusión GST a 4 ° C durante 2 horas, seguido de la adición de 20 perlas de glutatión-Sepharose 4B mu l. Después de 30 minutos de mezcla, las perlas se lavaron cuatro veces. Las proteínas se eluyeron en tampón de muestra de Laemmli y se analizaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados.
El tejido canceroso microarrays
microarrays de tejidos (TMA) se construyeron usando fijado en formol, parafina tejidos embebidos de 419 NSCLC obtenidos del Departamento de Patología del Centro Médico Asan bajo la aprobación de la Junta de Revisión interna (número IRB: 2.006-0.019). Las muestras de pulmón se obtuvieron a partir de 1996 hasta 1999. El original H & amp; E manchadas diapositivas fueron examinados por patólogos de estudio y áreas representativas de cada tumor fueron desplegadas a los bloques triplicado para minimizar la pérdida de tejido y superar la heterogeneidad de los tumores
.
la inmunohistoquímica
los procedimientos de inmunotinción se realizaron utilizando el dispositivo de inmunotinción automática de referencia (Sistema de Ventana Medical, Tucson, AZ, EE.UU.) con anticuerpo de cabra purificado por afinidad producido contra la secuencia de 19 aminoácidos (aa 251- 269) de los grupos COOH-terminal de AQP5 humano (Alpha Diagnostic, San Antonio, Texas) a una dilución 1:50. secciones de matriz de tejido (4 micras de espesor) se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en alcoholes graduados, y se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol a temperatura ambiente para bloquear la actividad peroxidasa endógena. El anticuerpo AQP5 se visualizó utilizando la técnica de avidina-biotina-peroxidasa (kit DAKO LSAB; DAKO Cytomation, Carpinteria, CA) y seguido por la detección de cromógeno con diaminobencidina (DAB). Se realizaron controles negativos omitiendo la etapa de incubación de anticuerpo primario.
Scoring de inmunohistoquímica
inmunotinción en el TMA se calificó semicuantitativamente teniendo en cuenta tanto la intensidad de la tinción y el porcentaje de células tumorales positivas por dos patólogos estudio (SJJ y MJK) cegado a las variables clínico-patológicas. La intensidad de la tinción se puntuó en una escala de cuatro grados: 0, no tinción de las células cancerosas; 1, tinción débil; 2 tinción moderada; 3, la tinción fuerte. El porcentaje de células tumorales teñidas se clasifica en una escala de 2 grados: 0, & lt; 10% y 1, & gt; 10%. expresión AQP5 en el tejido de cáncer se definió como positiva cuando el producto de la puntuación de intensidad de porcentaje de puntuación es 1 o más. Tanto el tipo histológico y grado fueron confirmados en hematoxilina y eosina (H & amp; E). Manchadas TMA diapositivas
fluorescencia hibridación in situ análisis
Sesenta y nueve NSCLC que tenían una expresión de AQP5 (puntuación = 2 o 3) se montarlo de nuevo en dos bloques de TMA para el análisis FISH, cada uno. Secciones (5 micras de espesor) de las TMA diapositivas se deparaffinized y pretratadas para FISH. La sonda para la detección AQP5 se derivó de Homo sapiens 12 RP11-469H8 BAC que contiene el gen completo AQP5 (GenBank adhesión no. AC025154), y se marcó con rodamina (Macrogen, Seúl, Corea). Dos clones de ADN genómico de 91 kb y 68 kb tamaños de franqueo 12p13.31 región marcada con FITC fueron utilizados como sondas de control (Macrogen, Seúl, Corea). FISH se realizó utilizando reactivos Vysis de acuerdo con los protocolos del fabricante (Vysis, IL, EE.UU.). Las diapositivas se counterstained con 4, 6-diamino-2 fenilindol para microscopía. La señal se sumará en 1.000 aumentos.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de chi-cuadrado con el software SPSS (SPSS 12.0K Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.). la edad y el tamaño medio del tumor de los pacientes se evaluaron mediante la prueba t. Las curvas de supervivencia se produjeron utilizando el modelo de riesgos proporcionales de Cox para evaluar el riesgo de muerte por cáncer. Los factores pronósticos fueron examinados por ambos análisis univariados y multivariados. En el análisis multivariado, la edad, el sexo, el grado histológico y el estadio del tumor han sido valoradas. Nosotros no controlamos por los métodos de tratamiento ya que la mayoría de los pacientes fueron sometidos a cirugía y el estadio TNM basado en el que se deciden las modalidades de tratamiento, demostró ninguna asociación con la expresión AQP5. Todos los valores de p fueron de dos caras, y las diferencias en p & lt;. 0,05 se consideraron estadísticamente significativas
Resultados
sobreexpresión AQP5 se asocia con un peor pronóstico en CPNM
Una significativa se observó expresión de la proteína AQP5 en 16,9% (69/408) de las muestras de NSCLC (TMA inmunotinción puntuación de 2+; definidos como positiva) (Tabla 1, figura 1A). Como se muestra en la figura 1A, sólo las células cancerosas, linfocitos no tumorales infiltrantes, mostraron expresión AQP5. Incluyendo casos con expresión débil (immnunostaining puntuación de 1+), que era tan alta como el 35,3% (144/408, Tabla 1). Curiosamente, se observó la sobreexpresión AQP5 predominantemente en adenocarcinomas de pulmón (p & lt; 0,001, Tabla 2). Sin embargo, ningún otro correlación estadísticamente significativa se encontró en NSCLCs entre la expresión AQP5 y los factores demográficos y patológicos, tales como la edad, el sexo, la diferenciación histológica, y etapa del tumor (Tabla 2). Debido al tamaño insuficiente de la muestra de los casos metastásicos (n = 4), se realizó ninguna otra estadística estudio de correlación sobre la metástasis.
Las microfotografías de AQP5 inmunotinción en el cáncer de pulmón de células pequeñas no puso en orden tejidos (NSCLC). Ejemplos de débil (1), moderada (2), y fuertes (3) inmunoreactividad en NSCLC (A a C, respectivamente) Aumento original × 200. (B) Curva de Kaplan-Meier en pacientes con CPNM. AQP5 casos positivos mostraron una tasa de supervivencia libre de enfermedad menos favorable (log rank p = 0,011) que los casos AQP5-negativo.
Para nuestra sorpresa, los casos positivos con AQP5 estado que se muestra una mayor tasa de recurrencia del tumor que negativos en el CPNM (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Aunque AQP5 sobreexpresión no fue estadísticamente significativa relacionada con la supervivencia global, notablemente, los que tienen NSCLC mostraron una tasa de supervivencia libre de enfermedad peor (rank test, p = 0,011 log) (fig. 1B). Incluso después de ajustar por el grado histológico y el estadio tumoral, AQP5 sobreexpresión en el CPNM fue todavía significativamente asociado con la progresión de la enfermedad antes (p = 0,033, OR = 1,52; IC del 95%: 1.4 a 2.23). Por lo tanto, el estado de AQP5 parece ser un marcador molecular independiente asociado a peores resultados clínicos.
AQP5 Humano promueve la invasión de células
A partir de los hallazgos clínicos, hemos planteado la hipótesis de que la AQP5 puede inducir la invasión celular, una paso necesario para la metástasis tumoral. Con el fin de investigar si la sobreexpresión AQP5 promueve la invasión celular en las células epiteliales bronquiales humanas y, al mismo tiempo, para determinar qué componentes de la proteína AQP5 juega un papel en el proceso, ensayo de invasión de Matrigel que primero realizó en líneas de células BEAS-2B que expresan establemente AQP5 y sus dos mutantes, N185D que bloquea el tráfico de membrana y S156A que bloquea la fosforilación en S156 sitio de la molécula de AQP5 [13], [14], [17]. Curiosamente, las células con AQP5 demostraron el más alto grado de la invasión de células entre los cuatro grupos (Fig. 2A, 2C). Aunque más alta que la maqueta, el grado de invasión de células en las células con N185D y S156A mutantes era claramente menor que la de las células con AQP5 (Fig. 2A, 2C). Estos hallazgos sugieren que tanto la expresión de AQP5 membranosa y su fosforilación en S156, el sitio consenso PKA, son importantes para AQP5 inducida por la invasión de células en células BEAS-2B. Para excluir la posibilidad de que este fenómeno no es único a las células epiteliales bronquiales humanas, se realizó el mismo ensayo utilizando fibroblastos de ratón líneas de células NIH3T3, que fueron transfectadas con las mismas construcciones de expresión [13] hallazgos similares y han observado (Fig. 2B, 2D) .
ensayo de invasión de Matrigel se llevó a cabo con cada una de las células BEAS-2B (a, C) y células NIH3T3 (B, D) que expresan AQP5 o cada uno de dos mutantes. AQP5 inducida por la migración celular y la invasión en BEAS-2B, inmortalizado las células epiteliales bronquiales humanas, así como células NIH3T3. Por el contrario, tanto del mutante N185D (alteraciones de tráfico de membrana) y el mutante S156A (alteración de la fosforilación en Ser 156 por la PKA) no inducen la migración celular y la invasión en células BEAS-2B o células NIH3T3 en comparación con Mock.
AQP5 expresión conduce a tipo fibroblasto cambio morfológico en las células epiteliales bronquiales
y, a continuación, decidió evaluar los cambios morfológicos acompañados de AQP5 sobreexpresión. Las morfologías de las células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B llevando uno de estos vectores bandera simulada o FLAG /AQP5 fueron examinadas por microscopía de contraste de fase. Como era de esperar, las células BEAS-2B transfectadas de manera simulada mostraron adherencia altamente organizada de célula a célula y mantienen la polaridad celular, que es la típica morfología de las células epiteliales normales (Fig. 3). Sin embargo, la expresión de AQP5 provocó un cambio de huso como y fibroblástica marcada en la morfología celular y una pérdida de contacto de célula a célula y la polaridad celular (Fig. 3). Estas alteraciones morfológicas pueden implicar que AQP5 juega un papel en la transición epitelio-mesenquimal (EMT).
Las morfologías de las células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B que expresan el vector de la bandera simulada o FLAG /AQP5 fueron revelados por contraste de fase microscopía. células BEAS-2B mantenidos altamente organizados la adhesión célula a célula y la polaridad celular como una morfología epitelial típica. La expresión de AQP5 causó una morfología de huso como y fibroblástica y la pérdida de los contactos célula-célula y la polaridad celular. Las barras de escala, 50 micras.
AQP5 expresión se asocia con marcadores moleculares de la transición epitelio-mesenquimal
Con el fin de confirmar si realmente AQP5 induce EMT en células epiteliales bronquiales humanas, se realizó El análisis de Western blot para verificar los marcadores de proteínas para la EMT. Es de destacar que entre las células BEAS-2B expresan de forma estable AQP5 (clon#1 y#2), N185D, mutantes S156A y vectores maqueta, sólo las células que expresan AQP5 exhibió una pérdida de marcadores de células epiteliales, tales como E-cadherina, catenina α y catenina γ, y una ganancia de marcadores de células mesenquimales incluyendo fibronectina y vimentina (Fig. 4). Tanto los cambios en la morfología y el perfil molecular de las células que sobreexpresan AQP5 una prueba tangible de que AQP5 estimula las células epiteliales bronquiales a someterse a EMT.
La expresión de proteínas epiteliales incluyendo E-cadherina, α-catenina y γ-catenina, y proteínas mesenquimales incluyendo fibronectina y vimentina fue examinado por inmunotransferencia de las cuatro celdas separadas BEAS-2B, cada uno de los cuales lleva la sobreexpresión de la construcción de AQP5 (clon#1 y#2), N185D, S156A y Mock. Sólo las células con AQP5 mostraron una pérdida de marcadores epiteliales y una ganancia de marcadores de células mesenquimales. 1, AQP5 clon#1; 2, AQP5 clon#2; 3, N185D; 4, S156A; 5, Mock basa en líneas de células BEAS-2B.
AQP5 interactúa con el c-Src, un potente desencadenante EMT
A continuación, se investigó el posible mecanismo molecular detrás de la EMT promover característica de AQP5. AQP5 humano lleva una secuencia de péptido diproline (RTSPVGSP) en el bucle D [18], [19], que tiene una similitud de secuencia con el sitio consenso de unión a SH3. Por lo tanto, es posible que este segmento de AQP5 se puede unir con el dominio SH3 de una molécula adaptadora [18]. Por lo tanto, hemos realizado una serie de proteínas dominios SH3 humana para examinar el potencial de varias proteínas que contienen dominio SH3 de unirse a AQP5 humano. En particular, la AQP5 purificada a partir de células BEAS-2B estables mostró actividad de unión al dominio SH3 de c-Src, Lyn, y Grap2 C-terminal (Fig 5A). El segmento de AQP5 que contiene un bucle D fosforilada (88 aa través de 182 aa) también fue capaz de unirse al dominio SH3 de c-Src, Lyn, y Grap2 C-terminal (Fig. 5A). El segmento de AQP5 que contiene un no fosforilado Loop D, sin embargo, era incapaz de unirse a los dominios SH3 de tres proteínas (Fig. 5A). El estado de fosforilación de cada proteína se confirmó.
(A) Se utilizó una matriz de proteínas dominios SH3 humana para examinar las posibles actividades de unión de varias proteínas que contienen el dominio SH3-a AQP5. No sólo AQP5, pero también segmento AQP5 que contiene un fosforilada Loop D (88 aa través de 182 aa) se encontraron para unirse al dominio SH3 de la c-Src, la Lyn, y la proteína Grap2. El segmento de AQP5 que contiene un no fosforilado Loop D, sin embargo, no fue capaz de unirse al dominio SH3 de cualquiera de estas proteínas. desplegable ensayo GST (B) se llevó a cabo con tres proteínas de fusión GST diferentes: un dominio de c-Src SH3, un dominio SH3 Lyn, y una proteína de dominio SH3 Grap2 C-terminal. Las células que expresan establemente AQP5 en las células epiteliales bronquiales humanas, BEAS-2B, revelaron una fuerte interacción con la proteína del dominio de c-Src SH3, la proteína de dominio SH3 Lyn y la proteína de dominio SH3 Grap2 C-terminal. (C) AQP5 es co-inmunoprecipitado con c-Src en las células BEAS-2B transfectadas de forma estable con constructo de expresión de AQP5. Además, sólo una forma activada de c-Src, fosforilados en Tyr 416, es co-inmunoprecipitó con AQP5. 1, Cuello; 2, N185D; 3, S156A; 4, AQP5; M, marcador de peso molecular.
Además, se realizó un ensayo de GST pull-down para verificar una interacción directa entre AQP5 y las moléculas de la familia Src. En este ensayo, se utilizó tres proteínas de fusión GST diferentes: un dominio de c-Src SH3, un dominio SH3 Lyn, y una proteína de dominio SH3 Grap2 C-terminal, que se identificaron para interactuar con AQP5 en SH3 arrays de proteínas de dominio. En consonancia con el resultado de SH3 arrays de proteínas de dominio, AQP5 expresa de forma estable en células epiteliales bronquiales humanas BEAS-2B mostraron una fuerte interacción con la c-Src, Lyn y proteínas del dominio SH3 Grap2 C-terminales (Fig. 5B).
por último, para confirmar nuestro hallazgo
in vivo
, se realizó un ensayo de inmunoprecipitación en la línea celular epitelial bronquial humana, BEAS-2B. Esta vez, nos centramos en c-Src, una molécula conocida por su promoción de la actividad de EMT [20]. Como era de esperar, AQP5 co-inmunoprecipitado con c-Src en células que expresan de forma estable AQP5 (Fig. 5C). Curiosamente, c-Src co-immunprecipitated con AQP5 resultó ser una forma activada de c-Src, que está fosforilada en Tyr416 (Fig. 5C). También observamos que las células que expresan AQP5 han activado más de c-Src de las células que llevan N185D o S156A mutante (Fig. 5C), lo que sugiere que la interacción con AQP5 puede ser un paso importante en la activación de c-Src.
AQP5 no puede estar asociado con la amplificación genómica
Para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la sobreexpresión AQP5, hemos investigado la presencia de amplificación genómica mediante el análisis FISH. De los 69 casos de NSCLC interpretables TMA, no se detectó un único patrón claro de amplificación genómica (Fig. S2), lo que sugiere que la expresión ectópica de AQP5 podría ser un evento molecular secundaria.
Discusión
Hemos demostrado anteriormente que la sobreexpresión de AQP5 en fibroblastos de ratón, células NIH3T3, induce la proliferación celular secundaria a la activación de Ras, que está mediada por la fosforilación de AQP5 en su sitio consenso de PKA (S156) y este estudio claramente proporcionado una asociación entre AQP5 y la transducción de señales vía Ras [13], [14]. Además, se ha informado recientemente un estudio que describe una expresión de la proteína inducida AQP5 durante la carcinogénesis colorrectal vías moleculares y cómo la expresión de proteínas AQP5 puede influir en el desarrollo del cáncer de colon en su interacción con el Rb vía Ras /ERK /señalización [16].
a diferencia de estos informes anteriores, aquí, nos han perseguido el papel de AQP5 en la progresión del NSCLC. Esto se basa en parte en nuestro informe anterior, que no sólo mostró la propiedad oncogénico de AQP1 en las células NIH3T3, sino que también describe el perfil de expresión de AQP1 en NSCLC [15]. Este informe, a pesar de cierta visión proporcionada en relación con el papel de AQPs en el CPNM, no demostró ni su implicación clínica o vías moleculares relacionados. En nuestro estudio preliminar para AQP5 en el CPNM, nos dimos cuenta de una serie de expresión AQP5 en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo H1975, H1838, H1650, H1437, H838 y. Además, similar a nuestras observaciones con células de fibroblastos NIH3T3 de ratón [13], [14], se ha identificado recientemente que AQP5 sobreexpresión en células BEAS-2B induce la activación de la vía de ERK que conduce a la estimulación de la proliferación celular (Kang et al., manuscrito en preparación); células epiteliales bronquiales humanas transfectadas de forma estable con AQP5 demostraron significativamente mayor tasa de proliferación de células establemente transfectadas con mock (Fig. S1). Sobre la base de estos resultados preliminares y las observaciones que se tenían previamente con AQP1 en CPNM y AQP5 en el estudio del cáncer colorrectal, hemos examinado el perfil de expresión de AQP5 en un gran panel de muestras clínicas.
Mientras que la expresión de AQP5 en su mensaje nivel se informó en ciertas partes del bronquial humano normal y tejidos alveolares [21], hasta el momento, AQP5 perfiles de expresión en muestras de tejido de NSCLC, en su nivel de proteínas, no han sido reportados. Con el fin de encontrar implicaciones clínicas de AQP5 sobreexpresión en CPNM, nos hemos reunido tejidos humanos de NSCLC resecado con un promedio de cinco años de seguimiento, en la que se realizó la inmunoquímica para examinar el nivel de expresión de la proteína AQP5. Si bien hemos encontrado expresión AQP5 en las células cancerosas, no vimos ninguna evidencia de inmunorreactividad AQP5 entre los linfocitos infiltrantes de tumor, lo cual es contrario a nuestros hallazgos anteriores que muestran una expresión inducida de mensajes AQP5 durante la activación de linfocitos [12]. Aunque esta discrepancia puede ser el resultado de múltiples razones, es posible que la expresión de AQP5 durante la activación de los linfocitos puede ser un evento temporal y que, una vez que los linfocitos se activan, se puede regular a la baja la expresión de AQP5.
Hemos identificado tres interesante perfiles de expresión de la proteína AQP5 en el CPNM con correlación clínica. En primer lugar, una expresión de la proteína AQP5 se nota en el 35,3% (144/408, Tabla 1.) de las muestras de tejido de NSCLC resecado. En segundo lugar, los casos de NSCLC con estado AQP5-positivas muestran una mayor tasa de recurrencia del tumor que los negativos (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). En tercer lugar, la sobreexpresión AQP5 en el CPNM se asoció significativamente con la progresión de la enfermedad antes (p = 0,033, OR = 1,52; IC del 95%: 01.04 a 02.23) y la supervivencia libre de enfermedad peor. Creemos que esta es la primera evidencia clínica que indica una fuerte correlación entre la expresión AQP5 y el resultado de los pacientes con cáncer que se sometió a la cirugía, y aún más sugerimos que hAQP5 es un potencial marcador pronóstico independiente. Yang et al.