Extracto
Objetivos
El cáncer de pulmón es la principal causa de cáncer relacionados muertes en el mundo. La supervivencia global a los 5 años ha mostrado poca mejoría en las últimas décadas. Siete de las proteínas homólogas absentia (SIAH) son ubiquitina ligasas E3 que median proteasomal la degradación de proteínas por poli-ubiquitinación. A pesar de que las proteínas Siah desempeñan un papel fundamental en diversos procesos biológicos, su papel en el cáncer humano sigue siendo controvertido. El objetivo del estudio fue documentar patrón de expresión SIAH2 a diferentes niveles (mRNA, el nivel de proteína e inmunohistoquímica) en el cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM) muestras en comparación con el tejido sano circundante del mismo paciente, y para analizar la asociación con características clinicopatológicas.
Materiales y Métodos
ciento cincuenta y dos muestras de una cohorte de pacientes tratados quirúrgicamente por cáncer de pulmón primario se obtuvieron para el estudio. Génicas y los niveles de proteína de expresión de SIAH2 fueron analizados y comparados con variables clínico-patológicos.
Resultados
El presente estudio es el primero en analizar el patrón de expresión SIAH2 a distintos niveles (ARN, expresión de proteínas e inmunohistoquímica) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Hemos encontrado que la expresión de proteínas SIAH2 es significativamente mayor en el adenocarcinoma de pulmón humano (ADC) y cáncer de pulmón de células escamosas (SCC). Paradójicamente, no se encontraron cambios no significativos a nivel de ARN, lo que sugiere un mecanismo de regulación postraduccionales. Más importante aún, se detectó un aumento de la correlación entre la expresión SIAH2 y el grado del tumor, lo que sugiere que esta proteína podría ser utilizado como un biomarcador de pronóstico para predecir la progresión del cáncer de pulmón. Del mismo modo, la expresión de proteínas SIAH2 mostró una fuerte correlación positiva con fluorodeoxiglucosa (2-desoxi-2 (
18 F) fluoro-D-glucosa) la absorción en el CPNM primario, que puede ayudar a los médicos en la estratificación de los pacientes con mayor riesgo global de supervivencia de los pobres. Además, hemos descrito una correlación inversa entre la expresión de SIAH2 y los niveles de uno de sus sustratos, la quinasa DYRK2 serina /treonina.
Conclusiones
Nuestros resultados proporcionan información sobre el uso potencial de SIAH2 como una nueva diana para el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Moreno P, Lara-Chica M, Soler-Torronteras R, T Caro, Medina M, Álvarez a, et al. (2015) La expresión de la ubiquitina ligasa SIAH2 (Siete
In absentia
Homólogo 2) se incrementa en cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 10 (11): e0143376. doi: 10.1371 /journal.pone.0143376
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Centro Médico de Niños de Cincinnati, Estados Unidos |
Recibido: 6 Julio, 2015; Aceptado: 4 de noviembre de 2015; Publicado: 18 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Moreno et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Economía y Competitividad MICINN (SAF2010-17122) para MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0650- 2010) para MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0246 a 2013) para MAC, y el Instituto de Salud Carlos III, Número de adjudicación:. PIE14 /00005 (FLEXI-MET) para Mac de prueba
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas:. Siah, siete de cada homólogo absentia; Doctores, prolil; DYRK2, tirosina de doble especificidad (Y) -phosphorylation regulada quinasa 2; SCC, carcinoma de células escamosas; ADC, adenocarcinoma; NSCLC, cáncer de pulmón de células no pequeñas; PET /TC, tomografía por emisión de positrones (PET
) /tomografía computarizada (TC);
18 FDG, 2-desoxi-2 - (
18 F) fluoro-D-glucosa
Introducción
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, representando casi 1,4 millones de muertes al año [1]. Al contrario de los cánceres de mama o próstata, en el que la supervivencia ha mejorado significativamente, la supervivencia global a los 5 años para el cáncer de pulmón se ha mostrado muy poca ventaja sobre las dos o tres últimas décadas. Por lo tanto, la tasa de supervivencia relativa a los 5 años es del 11-15% [2, 3], lo que significa que el 90% de los pacientes morirán de la enfermedad.
resección pulmonar con intención curativa ofrece la mejor oportunidad para la curación cuando los tumores se localizan dentro del pulmón [4]. Desafortunadamente, la mayoría de los pacientes presentan una enfermedad avanzada (estadios III y IV), siendo la terapia sistémica con quimioterapia y /o terapia de radiación la modalidad de tratamiento más beneficioso. En la última década, se han descrito varias nuevas dianas terapéuticas moleculares, pero su eficiencia y el impacto clínico sigue siendo poco clara [5]. En conjunto, estos datos subrayan la necesidad de nuevas y más eficaces terapias.
Siete de cada homólogo abstentia (Siah) son proteínas de anillo (realmente interesante nuevo gen) ubiquitina ligasas E3 dedo, que median proteasomal la degradación de proteínas por poli-ubiquitinación [6]. Estructuralmente, la familia SIAH presentar un dominio divergente N-terminal, un dominio RING catalítica altamente conservada, dos dominios de dedo de zinc y un dominio de unión al sustrato [7-9]. Los ratones expresan tres miembros de la familia, Siah1a, Siah1b y Siah2. Dos proteínas Siah se han identificado en seres humanos, y SIAH1 SIAH2 [10, 11], que pueden ejercer funciones distintas en los procesos celulares, incluyendo el control del ciclo celular, la respuesta de daño del ADN, la tumorigénesis y la metástasis [12]. Varios sustratos Siah se han descrito hasta la fecha, incluida la familia hipoxia de regulación de prolil hidroxilasas (PHDs), PML, TRAF2, PPAR, AKAP121, HDAC3, DCC, HIPK2 y DYRK2 [13-15]. En consecuencia, las proteínas Siah son actores clave en procesos biológicos como la respuesta al daño del ADN, hipoxia vía, señalización de estrógenos, la inflamación, la apoptosis y la supresión de tumores [12, 15].
El papel de las proteínas en el cáncer humano Siah sigue siendo controvertido . En la actualidad, el número de estudios que relacionan la expresión de SIAH con el desarrollo del cáncer humano es muy limitado, la presentación de pruebas contradictorias que clasifica proteínas Siah, ya sea como un oncogén o como un supresor de tumor. Por un lado, varios grupos han demostrado un papel oncogénico para proteínas Siah, especialmente SIAH2, en cáncer de mama [16 a 18], de próstata [19, 20] y el cáncer de hígado [21]. Por el contrario, se han encontrado proteínas Siah (especialmente SIAH1) para actuar como un supresor de tumores en el cáncer de mama [22], tumores gástricos [23] y el cáncer de hígado [24]. Esto podría explicarse como consecuencia de la especificidad de cada subunidad para degradar diferentes sustratos. Por lo tanto, podemos concluir que cada subunidad tiene un papel diferente en el control de la tumorigénesis, que ha sido recientemente revisado por Wong y SF Moller A [25]
.
Debido principalmente a la función oncogénica de SIAH2 en algunos tipos de el cáncer, los objetivos de nuestro estudio fueron documentar por primera vez el patrón de expresión SIAH2 a distintos niveles (ARNm, el nivel de proteína e inmunohistoquímica) en el cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM) muestras comparadas con el tejido sano circundante de la mismo paciente, y analizar su asociación con las características clínico-patológicas. Por otra parte, también se exploró la correlación con la expresión de un sustrato SIAH2, el DYRK2 serina /treonina quinasa (doble especificidad de la fosforilación de la tirosina-quinasa regulada 2) [26].
La novedad de este trabajo se basa en la análisis de patrón de expresión SIAH2 a diferentes niveles (ARN, expresión de proteínas y de inmunohistoquímica) en NSCLC humano en comparación con pulmón sano del mismo paciente. Los resultados observados anuncian el posible uso de SIAH2 como un biomarcador pronóstico de cáncer de pulmón.
Material y Métodos
Pacientes y muestras
muestras de tejido pulmonar de los pacientes intervenidos quirúrgicamente para primaria se obtuvieron cáncer de pulmón en el hospital Universitario Reina Sofía (Córdoba, España) desde enero de 2011 hasta diciembre de 2012. la colección, uso y almacenamiento de muestras de tejido fue aprobado por el Comité de Investigación clínica del hospital Universitario Reina Sofía de Ética y. Todos los pacientes firmaron un documento de consentimiento informado por escrito con indicación de su donación voluntaria. En paralelo, se recogieron prospectivamente los datos clinicopatological, incluyendo: datos demográficos, comorbilidades, historia de neoplasias, el tamaño del tumor, SUV (máx) del tumor (el máximo valor de captación estándar, como medida de
captación de 18 FDG), pTNM, el grado del tumor, y el desarrollo de metástasis durante el seguimiento. Las muestras de tejido fueron congelados inmediatamente con RNALater
® (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y se almacenaron a -80 ° C hasta que se realizó la extracción de RNA y análisis de proteínas. El espécimen restante fue fijado en formol e incluido en parafina para estudios de diagnóstico convencionales y análisis inmunohistoquímico. Todas las muestras incluidas en este estudio se examinaron histológicamente y se clasifican como adenocarcinoma (n = 36) o cáncer de pulmón de células escamosas (n = 40). Además, el tejido de pulmón normal adyacente también fue tomado de todos los pacientes. Ninguno de los pacientes habían recibido quimioterapia o radioterapia antes de la operación. muestras biológicas humanas utilizadas fueron recogidos, almacenados y gestionados por el nodo de Córdoba perteneciente al Biobanco del Servicio Andaluz de Salud (Servicio Andaluz de Salud-SAS).
Se realizó un análisis histológico
La tinción inmunohistoquímica en los tumores de pulmón, humanos incluidos en parafina fijado en formol. La tinción de las células de cáncer se anotó y se compara con el tejido pulmonar normal periférica. secciones de cinco micrómetros de muestras de tumores se prepararon para el tejido diapositivas. Las secciones se deparaffinised en xileno, y rehidratada en una serie de etanol y agua destilada. La tinción con hematoxilina-eosina (H & amp; E) y el ratón SIAH mAb 24E6H3 (Novus Productos Biológicos, Cambridge, UK) a una dilución de 1:40 o el anticuerpo policlonal de conejo anti-DYRK2 (AP7534a; Abgent, San Diego, California) en 1 : 50 dilución se realizó la noche a 4 ° C. la recuperación de antígeno para las secciones que se tiñeron con el mAb anti-SIAH o el anticuerpo policlonal anti-DYRK2 se realizó mediante la incubación de los portaobjetos en 1 mM EDTA pH 8,0 en un vapor de 98 ° C-100 ° C durante 30 minutos. SIAH2 IHC tinción se evaluó de la siguiente manera: 0, sin tinción o tinción citoplásmica débil en menos de 10% de las células tumorales; 1+, débil tinción citoplásmica en más moreno 10% de las células tumorales; 2+, débil o moderada tinción citoplásmica en más de 10% de las células tumorales; 3+, más de 10% de fuerte tinción citoplásmica. Como se informó anteriormente, 0 o 1+ intensidad de la tinción se consideró como DYRK2 negativo, mientras que 2+ o 3+ se consideró como DYRK2 positivo.
extracción de ARNm y qPCR
ARN total fue extraído a partir de tejidos almacenado en RNAlater
® utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se trató con 1 l (1 unidad /l) ADNasa-1 (Sigma, EE.UU.). La concentración total de ARN y la integridad se analizaron mediante Experion
® estación de electroforesis automatizado (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Todas las muestras analizadas mostraron un valor RIN (ARN Número Integridad) superior a 9. La transcripción inversa se realizó con el Kit iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad). PCR en tiempo real se empleó con GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en un sistema de detección de ICycler (Bio-Rad). El perfil de amplificación consistió en una desnaturalización inicial de 5 min a 95 ° C y luego 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, recocido durante 10 s a una temperatura de 61,4 (gen SIAH2) ° C o 56 ° C (gen DYRK2) , 30 segundos a 72ºC para la extensión y una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 97 ° C. eficiencias de amplificación fueron validados y normalizado contra β-actina y HPRT, y se pliegan cambio en la expresión génica se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt. Se utilizaron los siguientes cebadores:
SIAH2-forward: 5'-CTATGGAGAAGGTGGCCTCG-3 '
SIAH2-inversor: 5'-CGTATGGTGCAGGGTCAGG-3'
DYRK2-forward: 5'-GTGGTCAAGGCCTACGATCACA-3 '
DYRK2-inversa: 5'-CCGCAGGTGTTCCAGGATTC-3'
HPRT-forward: 5'-ATGGGAGGCCATCACATTGT-3 '
HPRT-inversor : 5'-ATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3 '
β-actina-forward: 5'-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3'
β-actina-inversor: 5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 '
Blot y anticuerpos WESTERN Hotel
total de extractos de proteínas de las muestras de cáncer de pulmón y de pulmón normal adyacente emparejado se extrajeron de RNAlater
® tejido conservado. Las membranas se incubaron primero durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (anti-SIAH2: sc-5507, dilución 1: 500, Santa Cruz; anti-DYRK2: AP7534a, dilución 1: 500, Abgent; contra β-actina: C4 clon, dilución 1: 1000, Santa Cruz). Las membranas lavadas se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados acoplados a peroxidasa de rábano picante. SIAH2 intensidades de señal de proteínas en las transferencias Western se analizaron y cuantificaron utilizando el software ImageJ v1.45 (http://rsbweb.nih.gov/ij/), intensidad de la señal después de la normalización de ß-actina.
BEAS-2B modelo de la diferenciación de células escamosas
BEAS-2B células fueron adquiridos de Sigma (Sigma;. Colección Europea de cultivos celulares, Salisbury, Reino Unido 95102433) y se mantuvieron en medio libre de suero LHC-9 (Life Technologies, Carlsbad, CA , EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2. diferenciación escamosa fue adquirida después de cultivar en medio LHC-9 enriquecido con FBS al 10% durante 7 días.
Análisis estadístico
prueba de chi-cuadrado de Pearson y la prueba exacta de Fisher se utilizaron para evaluar las diferencias entre categórica variables. Se utilizó la prueba t no pareada para comparar las medias entre dos variables cuantitativas con distribución normal de los datos, y la prueba de Mann-Whitney para datos no distribuidos normalmente. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para las variables con más de dos categorías. Se realizaron análisis de regresión lineal para evaluar la relación entre dos variables continuas. Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar. Las variables categóricas se expresan como recuentos y proporciones. Las diferencias con valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS (SPSS 20.0 para Mac: SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
La expresión de mRNA SIAH2 no se ve alterado en el cáncer de pulmón humano
se examinaron Setenta y seis resecado quirúrgicamente especímenes de cáncer de pulmón humano con diferentes muestras de tejido pulmonar normal adyacente (n = 36 ADC, n = 40 SCC). Las características clínico-patológicas de toda la cohorte de pacientes se resumen en la Tabla 1. Cambios en la expresión de SIAH2 en muestras de tumores en comparación con las muestras de pulmón normal se expresan como un factor de cambio. Como se muestra en la figura 1, se encontraron diferencias sutiles en la expresión génica en muestras de SIAH2 tanto ADC y SCC, aunque no significativo.
ARN total fue extraído a partir de tejidos, la integridad evaluado (todas las muestras incluyen mostró una RIN encima de 9 ) y cambios en la expresión de SIAH2 en muestras tumorales en comparación con muestras de pulmón normal del mismo paciente analizado por qPCR y se expresó como un factor de cambio. eficiencias de amplificación fueron validados y normalizado contra β-actina y HPRT, y se pliegan cambio en la expresión génica se calculó utilizando el método 2
-ΔΔCt. Los resultados representan la media ± SD.
SIAH2 los niveles de proteína se sobreexpresa en el cáncer de pulmón humano
A continuación se investigó si la expresión de la proteína SIAH2 está alterado en el cáncer de pulmón humano. Para este propósito, las proteínas totales se extrajeron de los mismos especímenes de cáncer de 76 pulmón utilizados anteriormente, y la expresión de proteínas SIAH2 en tejido de cáncer de pulmón en comparación con el tejido pulmonar normal se examinó por transferencia de Western. expresión de la proteína SIAH2 en muestras de cáncer de pulmón se comparó con la del tejido sano correspondiente después de la normalización de las intensidades de señal de actina, y se expresó como la expresión relativa OD (gel Representante en S1 Fig). Como se muestra en la figura 2, se encontró que la expresión de proteínas SIAH2 fue significativamente mayor en ambos ADC y las muestras de SCC en comparación con el tejido pulmonar normal (Fig 2A y 2B). Por otra parte, después de analizar la veces de inducción de SIAH2 en muestras tumorales en comparación con muestras de pulmón normal del mismo paciente, la expresión de la proteína SIAH2 más alta se encontró en ADC, en el que la expresión se aumentó en 4 veces en comparación con SCC, que mostró un 2 aumento -fold en los niveles de proteína SIAH2 (Fig 2C).
(a, B) las proteínas totales se extrajeron de ADC o especímenes SDC y el correspondiente tejido pulmonar normal, la expresión de proteínas SIAH2 analizado por transferencia de western y las bandas cuantificó por densitometría después de la normalización de las intensidades de señal de actina. Los resultados se expresan como OD expresión relativa y representan la media ± SD. **
p Hotel & lt; 0.001. (C) Doble representación inducción de SIAH2 en muestras tumorales en comparación con muestras de pulmón normal del mismo paciente. Los resultados representan la media ± SD. (D) Los resultados de los 16 pacientes (8 ADC y 8 SCC) seleccionados para representar una gama de la expresión de ARNm diferencial entre el tejido normal de pulmón (N) y el tumor (T). expresión de la proteína se analizó por SIAH2 inmunotransferencias (panel superior) y la expresión de ARNm por qPCR (panel inferior). Los datos son la media ± desviación estándar de n = 3 experimentos. **
p Hotel & lt; 0,001 *** y
p Hotel & lt; 0,0001.
Debido a la diferencia en la inducción observada entre SIAH2 mRNA y los niveles de proteína, hemos decidido analizar con más detalle una serie de 16 muestras (8 ADC y 8 SCC). Se seleccionaron estas muestras para representar una amplia gama de SIAH2 mRNA expresión diferencial entre el tumor y los tejidos normales. Como se muestra en la figura 2D, en la mayoría de los casos la expresión de proteínas SIAH2 es elevada en los tumores con independencia de la expresión de ARNm. Estos resultados indican claramente la existencia de un cambio o alteración en los mecanismos de control a nivel post-transcripcional en las células tumorales en comparación con el tejido sano.
expresión SIAH2 se incrementa en los carcinomas de pulmón de alto grado
con el fin de probar si la expresión SIAH2 podría estar correlacionada con la carcinogénesis de pulmón, decidimos evaluar la expresión SIAH2 y su patrón de localización en el cáncer de pulmón mediante inmunohistoquímica en la cohorte completa del paciente. Hemos observado que la expresión SIAH2 fue altamente detectable en ambos tipos principales de cáncer de pulmón humano, siendo la expresión predominantemente nuclear (Fig 3). Moderado a fuerte tinción homogénea fue identificado en muestras de cáncer de pulmón en comparación con el tejido pulmonar normal, que mostró aisladas y eventuales tinción celular.
Imágenes representativas de tumor de pulmón y el tejido normal adyacente se tiñeron con anticuerpos SIAH2 y hematoxilina-eosina (HE ) (x100).
a fin de examinar si la expresión de la proteína endógena SIAH2 cambia con la agresividad del tumor de pulmón, analizamos la expresión SIAH2 en diferentes tipos de cáncer de pulmón humano, incluyendo ADC bien diferenciado, mal diferenciado ADC y SCC. Como se muestra en la figura 4, el porcentaje de células tumorales que expresa SIAH2 aumentó con el grado histológico del tumor, siendo la más alta en muestras de cáncer de pulmón pobremente diferenciados. Por otra parte, se detectó una diferencia de expresión entre SIAH2 SCC y ADC, con SCC ser más intensamente teñidos para SIAH2 comparación con ADC.
Imágenes representativas de análisis inmunohistoquímico de SIAH2 en pulmón normal, así y adenocarcinoma pobremente diferenciado y escamosas carcinoma de células. positividad ocasional nuclear en pulmón normal, tinción moderada en el adenocarcinoma bien diferenciado y fuerte tinción en el adenocarcinoma pobremente diferenciado y carcinoma de células escamosas (HE: hematoxilina-eosina) (x100) guía empresas
Asociación entre la expresión SIAH2 y clínico-patológica. características
para evaluar la importancia biológica de expresión SIAH2 en el cáncer de pulmón humano, hemos examinado la relación entre las diferentes características clinicopatológicas (S1 Tabla) y los cambios en los niveles de expresión SIAH2 (ARNm y proteínas) en los tumores en comparación con el tejido pulmonar sano . IHC datos no se incluyeron porque la expresión SIAH2 fue positivo en todos los tumores. La séptima edición de la Clasificación TNM para el cáncer de pulmón (cáncer de pulmón Estadificación del proyecto, la Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón-IASLC) [27] se utilizó para la estadificación. Es de destacar que la expresión de proteínas SIAH2 mostró una fuerte correlación con SUV (max) en NSCLC primario (
p
= 0,014). Por otra parte, el aumento del tamaño del tumor correlacionada con alta absorción de
18 FDG en PET /TC (
p = 0,012
) (figura 5).
(A) La correlación positiva entre la expresión de la proteína SIAH2 y la captación de 18 FDG (medido como el máximo valor de captación estándar-SUVmáx) en el CPNM primario (
p = 0,014
), r2 = 0,13). (B) La correlación positiva entre el aumento del tamaño del tumor y la captación de 18 FDG en PET /TC (
p = 0,012
, r2 = 0,12).
DYRK2 expresión de la proteína se reduce en el pulmón humano cáncer
a continuación, se decidió para correlacionar la expresión SIAH2 con algunos de sus sustratos. A continuación, analizó el posible impacto de la regulación mutua previamente demostrada entre SIAH2 y DYRK2 en el cáncer de pulmón humano [26] mediante técnicas de inmunohistoquímica. DYRK2 juega un papel importante en la vía de señalización daños de ADN y su expresión de pulmón no ha sido profundamente estudiado todavía. expresión DYRK2 se determinó en la cohorte completa del paciente y las imágenes representativas se muestran en la Fig 6A. Se observó un aumento significativo en la expresión DYRK2 en muestras de pulmón sanos en comparación con las muestras de cáncer de pulmón correspondiente, lo que sugiere que la sobreexpresión SIAH2 se asocia con una disminución de la expresión de sus sustratos.
(A) Imágenes representativas de adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas, y el tejido normal adyacente se tiñó con anticuerpo DYRK2 (x100). (B) células BEAS-2B se cultivaron con o sin suero durante 7 días, se lisaron y expresión de la proteína se evaluó mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados (panel superior) y la expresión de ARNm por qPCR (panel inferior). Borrón representativo de tres experimentos independientes y las posiciones y pesos moleculares (en kDa) se indican.
Finalmente, decidimos evaluar los resultados antes mencionados utilizando un
in vitro
modelo de diferenciación en de las células progenitoras a carcinoma de pulmón. Por lo tanto, hemos investigado las proteínas y de expresión de mRNA niveles SIAH2 y DYRK2 en la línea celular del epitelio bronquial humano BEAS-2B. Se encontró una expresión inversa entre la expresión de la proteína SIAH2 y DYRK2, ya sea en las células epiteliales normales o cuando se somete a diferenciación escamosa (Fig 6B), sin observar cambios importantes en el nivel de mRNA. Por lo tanto, se observó que la expresión DYRK2 se redujo significativamente en el fenotipo escamosas comparación con las células epiteliales normales. Por el contrario, los niveles de SIAH2 aumentaron significativamente después de fenotipo diferenciación escamosa. Estos resultados utilizando un
vitro
modelo de diferenciación en refuerzan la asociación entre la expresión de la proteína SIAH2 y carcinoma de pulmón observada en las muestras humanas, que también se asocia con una disminución de expresión de sustratos tales como DYRK2.
discusión
la literatura actual incluye datos contradictorios con respecto a la función de SIAH en la progresión del cáncer. Por lo tanto, es de suma importancia para estudiar cada forma individual por separado con el fin de discriminar su papel preponderante en el desarrollo de diferentes neoplasias. Sin embargo, los datos de
in vitro
estudios, modelos animales o cohortes de pacientes han demostrado un papel dominante de SIAH2 como un oncogén en tumores sólidos y la leucemia [12, 19, 28-30]. Nuestros resultados apoyan esta hipótesis, destacando que el aumento observado en la expresión SIAH2 depende del grado histológico del tumor.
La importancia del papel de SIAH2 en la tumorigénesis ha sido validado en diferentes investigaciones que trataron de modular tanto por su abundancia y su actividad. Schmidt RL et al [31], mutante construido Siah1 /2 proteínas con actividad de ligasa E3 inactivado y, por lo tanto, bloquean la auto-ubiquitinación y degradación del sustrato. Encontraron que la reducción de la función Siah aumento de la apoptosis celular y tuvo efectos inhibitorios sobre el crecimiento del tumor, concluyendo que Siah media la tumorigénesis mediada por Ras oncogénico en el cáncer de páncreas. El mismo grupo publicó el primer trabajo que analiza en detalle el papel de las proteínas Siah en el cáncer de pulmón [32]. Los autores demostraron que SIAH2 juega un papel patogénico importante en el cáncer de pulmón humano y, por lo tanto, se abrió la posibilidad de inhibir la acción SIAH como una nueva diana contra el cáncer. Aunque las conclusiones se basaron principalmente en experimentos de líneas celulares humanas, una primera aproximación usando especímenes de cáncer de pulmón humano mostró una fuerte asociación entre el aumento de la expresión de proteínas SIAH y la proliferación de células tumorales. Sin embargo, el principal inconveniente de este estudio es que si no consigue discriminar entre los dos miembros de la familia, y SIAH1 SIAH2. Además, la expresión SIAH2 detallada en diferentes niveles es insuficiente.
En otro estudio que aborda el papel de SIAH1 y SIAH2 en un modelo singénico de cáncer de mama [33], los autores observaron que el bloqueo del sitio de unión SIAH-sustrato resultaron en el crecimiento tumoral y la angiogénesis reducida. Estos resultados también son consistentes con los reportados por Qi J et al [34] en un modelo de melanoma de ratón SW1. La inhibición de la actividad SIAH2 a través de un mutante ANILLO, la forma dominante negativa de SIAH2 reduce la tumorigénesis, mientras que el bloqueo del sitio de unión SIAH2-sustrato reducida metástasis, pero no tienen un impacto en la formación de tumores. El mismo grupo investigó la contribución de SIAH2 en el modelo TRAMP de cáncer neuroendocrino de próstata [19]. Es importante destacar que, knockout genético de Siah2 atenuó el desarrollo de carcinoma neuroendocrino de próstata. Por otra parte, tanto la frecuencia y el tamaño de las lesiones metastásicas se redujeron significativamente. En consonancia con esta observación, en un modelo de cáncer de mama los autores encontraron que la pérdida de SIAH2 retrasa la aparición de tumores, reduce la infiltración del estroma, el aumento de la perfusión del tumor a través de la vasculatura del tumor normalizado, disminución de la producción de factores de crecimiento proangiogénicos y, en última instancia, condujo a un aumento de la sensibilidad a la quimioterapia [28].
Recientemente, Muller y sus colegas han demostrado cómo SIAH2 acelera la degradación proteasomal de TYK2, que conduce a la inactivación de STAT3 en células de cáncer de pulmón [35]. También mostraron una correlación inversa entre la expresión de ambas proteínas en muestras de NSCLC de diferentes cohortes de pacientes. Además, también encontraron que SCC mostró niveles significativamente más altos de SIAH2 comparación con ADC. Estos resultados son concordantes con los obtenidos en el presente trabajo, en el que el análisis inmunohistoquímico mostró una mayor expresión en las muestras de SIAH2 SCC comparación con las muestras de ADC. Estos resultados ponen de manifiesto no solo la importancia de la expresión SIAH2, sino también la expresión de algunas de sus sustratos que juegan un papel clave en la regulación del crecimiento de células cancerosas y la carcinogénesis. Habíamos demostrado previamente una regulación mutua entre DYRK2 y SIAH2, por el cual SIAH2 media DYRK2 ubiquitinación y controla su expresión en respuesta a la hipoxia [26]. DYRK2 es un miembro de una familia conservada evolutivamente de especificidad dual de tirosina quinasas de fosforilación regulada (DYRKs) que juega un papel importante en el daño en el DNA vía de señalización y la proliferación celular. Aunque el papel de DYRK2 en la progresión del cáncer sigue siendo poco clara, una menor expresión en los tumores invasivos se ha descrito [36]. Hemos demostrado cómo el aumento en la expresión SIAH2 consecuencia suprime la expresión DYRK2. Estos resultados sugieren la posibilidad de que la acumulación de SIAH2 podría inversamente correlacionada con la expresión de las proteínas clave que controlan la progresión del tumor y la invasión, como DYRK2 o STAT3, señalando SIAH2 como una diana terapéutica potencial.
Para la primera vez en la historia, se evaluó la expresión SIAH2 a diferentes niveles en cáncer de pulmón primario en comparación con el tejido pulmonar normal adyacente. Se encontró una tendencia hacia una inducción de la expresión génica en SIAH2 SCC en comparación con el tejido pulmonar normal adyacente, aunque no significativa. Por el contrario, no hemos encontrado diferencias en la expresión de genes en muestras SIAH2 ADC. Esto está en marcado contraste con la expresión de la proteína SIAH2 estudiado por Western blot, que se aumentó significativamente tanto en las muestras ADC y SCC en comparación con el tejido pulmonar normal. Estos resultados apuntan claramente a la posible existencia de alguna alteración en el nivel post-transcripcional en las células tumorales en comparación con el tejido sano. Hasta la fecha, SIAH2 fosforilación es, posiblemente, el mecanismo de control más importante de SIAH2 auto-ubiquitinación y la degradación de [26, 37, 38]. Alteraciones o cambios en la expresión de esas quinasas capaces de fosforilar SIAH2 en las células tumorales podría ser uno de los mecanismos subyacentes responsables de esta diferencia entre el ARNm y la expresión de la proteína.
También destacan que la expresión de la proteína SIAH2 más alta fue encontrado en la histología ADC en comparación con la histología SCC cuando se analiza por transferencia de Western, ya que el análisis a través de la inmunohistoquímica mostró resultados diferentes. Sin embargo, estos resultados paralelos un estudio anterior que demuestra una mayor expresión de SIAH2 en SCC en comparación con el ADC se analizaron por inmunohistoquímica en tres cohortes diferentes [35]. El tamaño del tumor es un factor pronóstico muy conocido en el CPNM, y se asocia con la captación de FDG en PET /CT. De acuerdo, hemos encontrado una fuerte asociación entre el aumento del tamaño del tumor y captación
18 FDG medida como SUV (max), y podría ser útil para predecir el pronóstico del paciente NSCLC. Más importante aún, la expresión de proteínas SIAH2 mostró una fuerte correlación con
18 FDG captación, lo que puede ayudar a los médicos en la estratificación de los pacientes con mayor riesgo global de supervivencia de los pobres.
Conclusiones
Nuestros hallazgos indican una importante asociación entre la expresión de SIAH2 y cáncer de pulmón, que también se asocia con el grado histológico del tumor,
captación de 18 FDG y con una disminución en la expresión de sustratos SIAH2 como DYRK2. Estos resultados subrayan el posible uso de SIAH2 como marcador diagnóstico y pronóstico en el cáncer de pulmón. En concreto, nuestros hallazgos sugieren que el análisis de SIAH2 podría mejorar el diagnóstico de cáncer de pulmón, y podría profundizar en el conocimiento actual de su pronóstico. Por otra parte, se podría incluso llegar a ser una posible diana terapéutica para el NSCLC.
Apoyo a la Información
S1 Fig. gel Representante de expresión de la proteína SIAH2 en muestras de cáncer de pulmón en comparación con la del tejido sano correspondiente después de la normalización de las intensidades de señal de actina.
Los valores por debajo de los geles indican SIAH2 y las intensidades de señal de la proteína actina (cuantificada usando ImageJ). SIAH2 expresión relativa en OD muestra de tumor en comparación con el tejido normal se calculó después de la normalización de las intensidades de señal de actina
doi:. 10.1371 /journal.pone.0143376.s001 gratis (TIFF)
Tabla S1.