Extracto
Muchos estudios demostraron perfiles de microARN únicas en el cáncer de pulmón. No obstante, el papel y la señal relacionada con las vías de miR-375 en el cáncer de pulmón son en gran parte desconocidos. Nuestro estudio investigó relaciones entre la carcinogénesis y miR-375 en el adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y el carcinoma de pulmón de células pequeñas para identificar nuevas dianas moleculares para el tratamiento. Se evaluaron 723 micro ARN en las células cancerosas y las células normales microdissected adyacentes de 126 muestras de pulmón se congelaron utilizando microarrays. Hemos validado los perfiles de expresión de miR-375 y sus 22 mRNAs putativo objetivo en una cohorte independiente de 78 tejidos de cáncer de pulmón se congelaron utilizando transcriptasa inversa-PCR cuantitativa. Por otra parte, se realizó un ensayo indicador de luciferasa dual y Western blot en 6 genes blanco (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
LRP5
,
PIAS1
y
RUNX1
) en el pulmón de células línea celular de carcinoma pequeña NCI-H82. También se detectó el efecto de miR-375 en la proliferación celular en NCI-H82. Hemos encontrado que la expresión de miR-375 fue significativamente hasta reguladas en el adenocarcinoma y el carcinoma de pulmón de células pequeñas, pero las reguladas en el carcinoma de células escamosas. Entre los 22 genes diana putativo, 11 mostraron significativamente diferentes niveles de expresión en al menos 2 de 3 comparaciones por pares (adenocarcinoma vs., de células escamosas normales carcinoma vs. pulmonar normal o pequeño de células de carcinoma vs. normal). Seis determinados genes tenían una fuerte correlación negativa con el nivel de expresión de miR-375 en el carcinoma de pulmón de células pequeñas. Investigaciones posteriores revelaron que el miR-375 dirigido directamente a la 3'UTR de
ITPKb
ARNm y la sobre-expresión de miR-375 conducido a una disminución significativamente el nivel de proteína ITPKb y promovieron el crecimiento celular. Por lo tanto, nuestro estudio demuestra los perfiles de expresión diferencial de miR-375 en 3 subtipos de carcinomas de pulmón y se encuentra thatmiR-375 se dirige directamente a
ITPKb
y promovido el crecimiento celular en la línea celular SCLC
Cita.: Jin Y, Liu Y, Zhang J, Huang W, Jiang H, Hou Y, et al. (2015) La expresión de miR-375 se asocia con la carcinogénesis en tres subtipos de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (12): e0144187. doi: 10.1371 /journal.pone.0144187
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 19 Junio, 2015; Aceptado: 13 Noviembre 2015; Publicado: December 7, 2015
Derechos de Autor © 2015 Jin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81472174 y 81401879), Ciencia y Tecnología de la Comisión de la municipalidad de Shanghai (Nº 14411965900 y 14ZR1406100 ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón ha sido durante mucho tiempo la principal causa de muerte por cáncer en los hombres en todo el mundo [1]. Histológicamente, el cáncer de pulmón se clasifica en 2 clases principales, el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). NSCLC es un grupo heterogéneo compuesto por 2 subtipos más comunes, es decir, el carcinoma de células escamosas (SQ) y adenocarcinoma (AC) [2] .A pesar de las mejoras en el diagnóstico precoz y el reciente avance en /terapias dirigidas, la tasa de supervivencia global a 5 años quimioterapia de cáncer de pulmón sigue siendo baja y la tasa de recurrencia es alta [3] .Poor pronóstico es debido a la presentación tardía de la enfermedad, heterogeneidades, y la comprensión relativamente limitado de la biología del tumor. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos marcadores moleculares y dianas para el diagnóstico y tratamiento del cáncer de pulmón podría jugar un papel fundamental en mejorar el pronóstico.
microARN (miARN) es una clase de forma endógena expresada, no codificante ARN pequeño con alrededor de 22 nucleótidos. Se ha demostrado que los genes miARN escanear regular la expresión génica a nivel postranscripcional a través de apareamiento de bases imperfecta con la región 3 'no traducida (3'UTR) del ARNm diana [4]. La creciente evidencia sugiere que la desregulación de miRNAs puede contribuir a ciertos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón. Muchos estudios han demostrado perfiles de miARN únicas en el cáncer de pulmón [5-7] .En nuestro estudio anterior sobre la investigación de biomarcadores miARN en 3 subtipos de carcinomas de pulmón, encontramos importantes sobre regulación de la expresión de microARN-375 (miR-375) en los niveles de CA y SCLC, pero la baja regulación de miR-375 en SQ [8]. Nuestra hipótesis es que el miR-375 puede ser un oncogén candidato en CA y SCLC, pero un supresor tumoral en SQ. De hecho, los fenómenos de una sola miARN que desempeña papeles opuestos durante la patogénesis del tumor, ya sea como un oncogén o como un supresor de tumores, se ha informado en diferentes tipos de cáncer [9-11] Además .En, sobre regulación de miR-375 en SCLC se informó recientemente [12, 13]. Sin embargo, las vías de señales reguladas por el miR-375 y el papel de miR-375 en el cáncer de pulmón sigue siendo en gran parte desconocido.
Hemos investigado el papel de miR-375 en la carcinogénesis de los 3 subtipos de carcinoma de pulmón de identificar nuevos materiales moleculares objetivos para el diagnóstico y la terapia de cáncer de pulmón. En este artículo, nos muestran la validación exitosa de distintos perfiles de expresión de miR-375 en los 3 subtipos. Por otra parte, se presentan los perfiles de expresión de 22 ARNm putativo objetivo de miR-375 en subtipos Carcer 3 pulmonares. Además, se demuestra que el miR-375 promueve el crecimiento celular en la línea celular SCLC y ITPKb inhibe la expresión a nivel postranscripcional atacando directamente a la 3'UTR de
ITPKb
ARNm.
Materiales y Métodos
muestras clínicas
el Comité de Ética local aprobó el estudio y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes. Para la selección de la muestra, se utilizó la clasificación histológica de rutina después de Clasificación Mundial de la Salud Organización de los tumores de pulmón [2] .El diagnóstico de CA se confirmó por la ausencia de queratinización o puentes intercelulares y la tinción positiva TTF1. diagnóstico SQ fue confirmada por puentes intercelulares o tinción P63 positivo (al menos 40% de las células tumorales). Para todos los casos de SCLC, hubo un acuerdo total sobre la morfología neuroendocrina, células pequeñas y neuroendocrino tinción positiva. Si hubo un desacuerdo, el consenso fue alcanzado por la detección de TTF1 /P63. Todos los casos fueron revisados de forma independiente por 2 patólogos experimentados con cáncer de pulmón. Los pacientes que habían recibido radioterapia o quimioterapia preoperatoria fueron excluidos. Las características clínicas se presentan en la Tabla 1.
aislamiento de ARN
El ARN total de las secciones de tejido congelado se extrajo utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). La concentración se cuantifica por NanoDrop 1000 Espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Waltham, MA). El control de calidad de ARN se realizó por un 2100 Bioanalyzer utilizando el kit Pico LabChip RNA 6000 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La calidad se midió utilizando el número de la integridad del ARN (RIN). Una muestra de ARN se descartó si la puntuación RIN fue inferior a 5,0.
QRT-PCR
cuantitativa transcriptasa inversa-polimerasa en cadena de la reacción (QRT-PCR) se realizó en 78 macrodissected congelada tejidos pulmonares para validar los perfiles de expresión de miR-375 y sus genes diana putativos en 3 subtipos de carcinomas de pulmón. En la validación de miR-375, QRT-PCR se realizó usando ensayos de microARN Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. El U47 ARN nuclear pequeño se utilizó como control endógeno. Todos los ensayos se realizaron por triplicado
.
En 22 predijo genes diana de miR-375 (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
CSNK2A1
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
JAK2
,
JUND
,
LAMC1
,
LRP5
,
MAP3K5
,
NLK
,
PAK7
,
PDGFC
,
PDPK1
,
PIAS1
,
RUNX1
,
RYR2
,
SOCS5
,
SP1
y
WNT5A
) , QRT-PCR usando el kit SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
GAPDH
se utilizó como control endógeno. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Primeras secuencias estan disponibles bajo peticion. Los criterios de exclusión para el análisis estadístico son los siguientes: 1) un gen diana que mostraron valores de umbral de ciclo (TC) por encima de 35 ciclos en & gt; 20% de las muestras analizadas y 2) Una muestra que mostró valores de CT por encima de 35 ciclos en & gt; 20% de los genes de la prueba.
Objetivo predicción y análisis vía
Los objetivos de miR-375 se predijo a través de los miRecords de puerta de enlace (http://mirecords.biolead.org/). Para aumentar la precisión de la predicción, se seleccionaron los genes que fueron predichas por al menos 4 de 11 bases de datos (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, PicTar, pita, rna22, RNAhybrid y TargetScan) como objetivos.
La base de datos KEGG (http://www.genome.jp/kegg/tool/search_pathway.html) para mapear los objetivos previsto a las vías asociadas con el cáncer de pulmón.
las células
Una línea celular NCI-H82 SCLC fue proporcionado amablemente por el Dr. Zhu Xueliang (Instituto de Bioquímica y Biología celular, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas de la Academia china de Ciencias, Shanghai, china) [13]. NCI-H82 establemente transducidas con miR-375 que expresan (H82-miR-375) o vacío (H82-NC) lentivirus se mantuvieron en RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS). línea celular de riñón embrionario transformada con SV40 293T, obtenido de la American Type Culture Collection, se mantuvo en DMEM con 10% de SFB.
Vector construcción
Seis determinados genes putativos (
ITPKb
,
RUNX1
,
LRP5
,
PIAS1
,
FZD8
y
ITGA10
) que tenía una fuerte correlación negativa con el miR -375expression nivel en SCLC fueron seleccionados para estudios funcionales. De los 6 genes blanco, el 3'UTR de
ITPKb
ARNm contiene 3 sitios putativo objetivo de miR-375 (sitio de destino 1: semillas 1667-1673, sitio diana 2: Semilla de 2463 a 2469 y Sitio de destino 3 : semillas 2513-2519). Dos segmentos diferentes de la
ITPKb
3'UTR, designado ITPKb-Δ1 (sitio de destino 1) y ITPKb-Δ2 (sitio de destino 2 y 3), se clonaron, la representación de la respectively.Schematic
ITPKb
3'UTR y los supuestos sitios de unión de miR-375 se muestra en la figura S2.
para construir el vector de expresión de miR-375 (pS-miR-375), un fragmento de ADN que codifica el miR-375 pre-miARN (flanquean aguas arriba y aguas abajo 30-50 nt) se amplificó y se inserta en el
Bam
HⅠ y
Hind
ⅲ sitios de vector que expresa pSilencer4.1 CMV-puro. El vector lentiviral de miR-375 que expresan fue construido con Ubi-EGFP-IRES-MCS-puromicina.
Para la construcción de tipo salvaje reporteros 3'-UTR pGL3 (pGL3-ITPKb-Δ1, pGL3-ITPKb-Delta 2 , pGL3-RUNX1, pGL3-LRP5, pGL3-PIAS1, pGL3-FZD8 y pGL3-ITGA10), fragmentos de ADN de 100 pb de los genes específicos predichos incluyendo los putativo secuencias de unión de miR-375 y sitios XbaⅠrestriction se sintetizaron y se clonaron en el sitio XbaⅠ inmediatamente aguas abajo del codón de parada en el vector del promotor pGL3. Mutados reporteros 3'-UTR pGL3 (pGL3-ITPKb-Δ1-mut1, pGL3-ITPKb-Δ2-mut2, pGL3-ITPKb-Δ2-mut3, pGL3-RUNX1-mut, pGL3-LRP5-mut, pGL3-PIAS1-mut, pGL3-FZD8-mut y pGL3-ITGA10-mut), que lleva la secuencia mutada en el sitio complementario para la región semilla de miR-375, se genera en base a tipo salvaje reporteros 3'-UTR pGL3 por mutagénesis específica de sitio. Todos los productos clonados fueron verificados por secuenciación. Los cebadores para la clonación de miR-375 y oligonucleótidos para la construcción 3'UTR objetivo se presentan en la Tabla S1.
reportero de luciferasa ensayo
Las células 293T se sembraron en placas de 96 pocillos. Las células fueron co-transfectadas con 2 ng de un control de vectores PRL-Renilla interno (Promega, Madison, WI), 40 ng de diferentes reporteros 3'-UTR del promotor pGL3, 160 ng de miR-375 vector de expresión (pS-MIR -375) o el control de vacío (pS-negativo). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las actividades de luciferasa de luciérnaga y de Renilla se analizaron utilizando Dual-Glo sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI). La actividad de luciferasa de cada muestra se normalizó por la actividad de luciferasa de Renilla. La actividad de la luciferasa normalizada para el PS-negativo se establece como actividad luciferasa relativa 1. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y con independencia tiempos repeated3.
Western blot
p>
CCK-8 ensayo
p>
El análisis estadístico
Para los datos de microarrays, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con Benjamini-Hochberg corrección (p ≤ 0,001) se llevó a cabo para determinar miRNAs expresados diferencialmente entre los tejidos normales, AC, SQ y SCLC. La agrupación jerárquica se realizó con correlación de Pearson usando los miRNAs expresados diferencialmente
Para los datos QRT-PCR, una, desigualdad de la varianza no apareado
t-test
con Benjamini-Hochberg corrección (p & lt; 0,05). estaba aplicadas a miR-375 y diferencialmente determinados genes expresados en las comparaciones de CA vs. normales, SQ vs normal y SCLC frente a tejido normal. Los genes diana con p & lt; corregido 0,05 veces el cambio y la expresión & gt; 2 fueron seleccionados como candidatos para nuevos estudios funcionales. Todos los valores de p fueron de dos caras.
Los métodos adicionales que incluyen la captura de microdisección por láser (LCM), macrodissection y la hibridación de microarrays se describen en S2 Archivo.
Resultados
El miR 375 perfiles de expresión en tres subtipos de carcinomas de pulmón
en un análisis de microarrays, los perfiles de expresión de 723 miRNAs humanos se investigaron en las poblaciones de células cancerosas LCM seleccionado y las células normales derivadas de CA 36, 30, 16 SQ SCLC y 44 adyacentes tejidos normales. Fig 1A ilustra la agrupación jerárquica de los niveles de expresión diferencial de miRNAs en 3 subtipos de carcinomas de pulmón y tejido pulmonar normal. Los perfiles de expresión de los genes miARN dividen claramente las muestras en cuatro grupos principales: Aire Acondicionado, SQ, SCLC y el tejido normal. Sobre regulación de miR-375 nivel de expresión se observó ligeramente en CA y de manera significativa en el CPCP, mientras marcada baja regulación de la expresión de miR-375 se observó en SQ (Figura 1B y Tabla 2).
A, jerárquica agrupación de los perfiles de expresión de genes miARN en AC, SQ, SCLC y el tejido pulmonar normal en microarrays. La media de la señal a partir de muestras biológicas repetidas se utilizó para la agrupación. Las barras de colores indican la gama de señales basado en log2 normalizados. B, un diagrama de puntos interactivos de miR-375 señales normalizadas en microarrays. C, un diagrama de puntos interactivos de miR-375 CT valores normalizados de QRT-PCR. AC: adenocarcinoma, SQ: el carcinoma de células escamosas, SCLC:. Carcinoma de pulmón de células pequeñas
Los perfiles de expresión de miR-375 en 3 subtipos de carcinoma de pulmón fueron validados en una cohorte independiente de 78 se congelaron los tejidos pulmonares quirúrgicos usando QRT-PCR. Del mismo modo, la expresión de miR-375 fue significativamente hasta reguladas en CA y SCLC, pero las reguladas en SQ (Figura 1C y Tabla 2).
La asociación de la expresión de miR-375 con la carcinogénesis pulmonar
se identificaron 191 genes a través de puerta de enlace miRecords ser asociados con el miR-375. Después de la asignación a la base de datos KEGG vía, se identificaron 22 genes de participar en importantes vías de señalización en cáncer de pulmón (Tabla S2.).
Los niveles de expresión de los 22 genes putativo objetivo se establece a continuación de 78 macrodissected congelado tejidos pulmonares. Los perfiles de expresión de los ARNm putativo objetivo en 3 subtipos de carcinomas de pulmón se presentan en la Tabla 3. De los 22genes, 11 (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
JUND
,
LRP5
,
PIAS1
,
RUNX1
y
RYR2
) habían diferencial marcadamente los niveles de expresión en al menos 2 de 3 en pareja comparaciones de CA vs. normales, SQ vs normal o SCLC vs normal. Excepto
ACSL3
, todos los 11 genes objetivo putativo mostraron significativa regulación a la baja en todos los 3 carcinomasubtypes pulmonares. Por el contrario,
ACSL3
mostraron más de 10 veces sobre regulación cuando el nivel de expresión en compareits SCLC para que en el tejido normal (p = 0,011). Dos genes (
CSNK2A1
y
MAP3K5
) mostraron niveles de expresión diferencial en SC vs única comparación normal. Tres genes (
NLK
,
PDPK1
y
SP1
) mostraron expresión diferencial en SCLC frente al control normal sólo. Dos genes (
JAK2
y
LAMC1
) mostraron niveles de expresión comparables en las 3 comparaciones, mientras que otros 4 genes (
PAK7
,
PDGFC
,
SOCS5
y
WNT5A
) no pasó el control de calidad en la que el gen diana mostró valores de CT por encima de 35 ciclos en & gt; 20% de las muestras analizadas.
Correlación del nivel de miR-375 con la expresión de ARNm diana
En la comparación de CA vs. normal (figura 2A), se observaron fuertes correlaciones negativas entre el nivel de expresión de miR-375 y la de 10 ARNm putativo objetivo (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
JUND
,
LRP5
,
PIAS1
y
RYR2
). En la comparación de SQ vs normal (figura 2B), se detectaron fuertes correlaciones positivas entre el nivel de expresión de miR-375 y la de 13 ARNm putativo objetivo (
ACSL3
,
CACNG2
,
CCDC6
,
CSNK2A1
,
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
JUND
,
LRP5
,
MAP3K5
,
PIAS1
,
RUNX1
y
RYR2
). En la comparación de SCLC vs normal (Figura 2C), se encontraron una fuerte correlación negativa entre el nivel de expresión de miR-375 y el de 6 ARNm putativo objetivo (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
LRP5
,
PIAS1
y
RUNX1
), mientras que se observaron fuertes correlaciones positivas entre la expresión de miR-375 y el de 4 ARNm diana putativos (
ACSL3
,
NLK
,
PDPK1
y
SP1
).
A, Correlación de miR-375 con la expresión de ARNm diana en la comparación de AC vs. normal. B, la correlación de miR-375 con la expresión de ARNm diana en la comparación de SQ vs. normal. C, la correlación de miR-375 con la expresión de ARNm diana en la comparación de SCLC frente a normal. Círculo verde: baja regulación. Círculo rojo: la regulación. Círculo blanco: el gen no mostró expresión diferencial en la comparación por pares de CA vs. normales, SQ vs normal o SCLC vs normal. Círculo azul: el gen no pasó el control de calidad. AC: adenocarcinoma, SQ: el carcinoma de células escamosas, SCLC:. Carcinoma de pulmón de células pequeñas
ITPKb: un objetivo directo de miR-375
ensayo indicador de luciferasa dual se llevó a cabo el 6 dirigida genes (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
LRP5
,
PIAS1
y
RUNX1
) que tenían una fuerte correlación negativa con el nivel de expresión de miR-375 en el CPCP. A los 3 sitios putativo objetivo en el 3'UTR de
ITPKb
ARNm, la actividad luciferasa del reportero que lleva el sitio 2 y 3 de tipo salvaje (ITPKb-Δ2) se suprimió significativamente por el miR-375, mientras la actividad de la luciferasa de la página 1 de tipo salvaje (ITPKb-Δ1) no se vio afectada. Es importante destacar que el sitio 2 mutante (ITPKb-Δ2-mut2) no fue el objetivo de miR-375, mientras que el mutante del sitio 3 (ITPKb-Δ2-mut3) todavía estaba inhibida por el miR-375 (Figura 3A). Tomados en conjunto, los resultados revelaron que el miR-375 dirigido el 3'UTR del
ITPKb
ARNm principalmente a través del sitio de destino 2 (semilla: 2463-2469).
A, la actividad de la luciferasa. La actividad de luciferasa de cada muestra se normalizó por la actividad de luciferasa de Renilla. La actividad de la luciferasa normalizada para el PS-negativo se establece como actividad luciferasa relativa 1. Columna: valor medio de 3 experimentos independientes por triplicado. barra de error: desviación estándar. *: P & lt; 0,05, en comparación con las células transfectadas con vacío del promotor pGL3 vector. B, Los niveles de expresión de la proteína de ITPKb H82, H82-NC y las células H82-miR-375 se evaluaron por Western blot. Después de la transfección de miR-375, el nivel de expresión de la proteína ITPKb se suprimió significativamente. C, Análisis cuantitativo de Western blot. Las intensidades de proteínas ITPKb se normalizaron por GAPDH.
El efecto de miR-375 en la expresión endógena de ITPKb se examinó mediante Western blot. La expresión ectópica de miR-375 suprimió significativamente la proteína ITPKb en las células transfectadas H82-miR-375 (H82-miR-375) en comparación con el control de vectores transfectadas H82 células (H82-NC) (Fig 3B y 3C). Los datos indicaron que el miR-375 inhibe la expresión de ITPKb a nivel postranscripcional atacando directamente a la 3'UTR (apuntar principalmente sitio2) de
ITPKb
ARNm.
Además, se observó ITPKb expresión de la proteína fue significativamente las reguladas en tejidos de cáncer de pulmón en comparación con el tejido normal adyacente, que están en consonancia con el patrón de expresión de
ITPKb
ARNm se ha mencionado anteriormente (figura 4 y Tabla 3).
Western blot se utilizó para detectar la expresión de la proteína ITPKb en los tejidos de carcinoma de pulmón (muestras 2AC, muestras 2SQ, muestras 3SCLC) y el tejido de pulmón normal adyacente. Las intensidades de proteínas ITPKb se normalizaron por GAPDH.The doblan cambios fueron 0.2and0.3 en las comparaciones de 2AC vs. normales, 0.2 y 0.4of 2SQ vs. normales, 0.3, 0.3 y 0.4of 3SCLC vs. normales, respectivamente.
Para otros 5 putativo de determinados genes (
RUNX1
,
LRP5
,
PIAS1
,
FZD8
y
ITGA10
), no se observaron efectos mínimos sobre el miR-375 en sus actividades de luciferasa (Fig S3). Por otra parte, los ectópicos niveles de expresión de miR-375 no fueron suprimidos de manera significativa por las 5 proteínas putativo objetivo en H82-miR-375 en comparación con H82-NC (S4 figura).
Efecto de la sobreexpresión de miR-375 en SCLC el crecimiento celular
El importantes sobre regulación de la expresión de miR-375 en muestras de SCLC y su efecto inhibidor sobre la
nos ITPKb
llevó a investigar su papel biológico posible en las células de SCLC. Después infectado, el miR-375 expresión tanto de H82 y H82-NC-miR-375 se detectó utilizando en tiempo real QRT-PCR (Figura 5A). A continuación, se evaluó la tasa de crecimiento celular por CCK-8 ensayo. Los resultados mostrados en la figura 5B sugerido que la expresión exógena de miR-375 podría promover el crecimiento celular de las células H82 de una manera dependencia temporal. Después de la incubación 24 h, no hubo diferencia en la viabilidad celular entre los dos grupos se observó (p & gt; 0,05) .Sin embargo, no se observó diferencia significativa entre los dos grupos después de 48 h y 72 h de incubación, y las eficiencias de promoción fueron 33,1% y 35,9%, respectivamente ( p. & lt; 0,01)
A, miR-375 expresión de ambas células H82-H82-NC y miR-375.NCI-H82 se infectaron con miR-375 que expresan (H82-miR-375) o vacíos (H82-NC) lentivirus antes del ensayo de proliferación. B, miR-375 podría promover el crecimiento celular de células H82. Las células infectadas se sembraron a placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante varios días, el crecimiento celular se midió por CCK-8 ensayo. *: P & lt; 0,01, en comparación con H82-NC.
Discusión
miR-375 fue identificado por primera vez como un islote-miARN específico que regula la secreción de insulina pancreática [14-16]. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que miR-375 es un miARN multifuncionales que participan en el desarrollo de los islotes pancreáticos, homeostasis de la glucosa, la inmunidad de la mucosa, la secreción de agente tensioactivo pulmonar y más importante, la tumorigénesis. La desregulación de miR-375 se ha observado en diferentes tipos de cánceres. Por ejemplo, Kong et al informaron de que la expresión de miR-375 fue fuertemente downregulated en carcinoma de células escamosas del esófago (CECA) y miR-375 inhibió el crecimiento tumoral y la metástasis a través de la represión de factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF1R) [17]. Otro estudio convencido de que el miR-375 fue con frecuencia downregulated en líneas celulares y tejidos CECA, y miR-375 se asoció significativamente con la etapa avanzada, metástasis y los pobres resultados de la CECA [18]. Leidner et al encontró que el miR-375 se asoció con la progresión a carcinoma invasivo en el esófago de Barrett [19] .Chang et al demostraron que la regulación a la baja de miR-375 en el glioma se correlaciona con el resultado clínico desfavorable [20]. Bajo la expresión de miR-375 se encuentran en el cáncer colorrectal [21, 22], y también se correlaciona con un peor pronóstico y la metástasis en la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas [23, 24]. He et al encontró que el miR-375, regulado por disminución en el carcinoma hepatocelular (HCC) los tejidos y líneas celulares, se dirige a AEG-1 en HCC y suprime el crecimiento de células cancerosas
in vitro Opiniones y en
in vivo
[ ,,,0],25]. En el cáncer de pulmón, disminución de miR-375 nivel de expresión en muestras de tejido de NSCLC correlacionaron significativamente con el estadio avanzado y metástasis linfática [26] .Reduced expresión de miR-375 se observó en todos los tipos de cáncer mencionados anteriormente, mientras que el miR-375 se observó en la regulación positiva de mama cáncer y carcinoma de próstata [27, 28]. Estos resultados ponen de relieve un papel fundamental de miR-375 en la tumorigénesis. Nuestros resultados fueron consistentes con los resultados anteriores. Descubrimos y validado significativa de miR-375 sobre regulación en CA y SCLC, pero significativa baja regulación en SQ.
Los actuales dos informes sobre la expresión de miR-375 en SCLC fueron consistentes con nuestros resultados [12, 13] . En comparación con ellos, nuestro estudio es único por las siguientes razones: En primer lugar, Zhao et al examinaron los patrones de expresión de genes miARN sólo en líneas celulares (cuatro líneas celulares de SCLC (H209, H69, H82 y H345), una línea celular de NSCLC CRL 5908 y uno línea de células epiteliales de pulmón humano inmortalizado BEAS-2B), encontraron que el miR-375 se reguló forma consistente en las cuatro líneas celulares de SCLC. El otro también llegó a la conclusión por las células cultivadas, y utiliza pequeñas muestras de tejido (7 NSCLC vs. 8SCLC) para la verificación sin control normal. Nuestro estudio no sólo incluye líneas celulares, sino también un escaneo más amplio de muestras clínicas, lo que nos permite identificar mejor los posibles marcadores de diagnóstico miARN. Subrayando los perfiles de expresión de genes miARN en el CPCP y subtipos de NSCLC se debe a las dificultades para obtener muestras de tejidos primarios, como la mayoría de los tumores SCLC no se resecan quirúrgicamente. En segundo lugar, hemos descubierto biomarcadores miARN en LCM seleccionada células cancerosas y las células normales adyacentes derivados de CA, SQ y SCLC. Este enfoque asegura la pureza de las células diana, lo que reduce las señales de fondo de las células no cancerosas y mejorar la fiabilidad de los candidatos de biomarcadores descubiertos [29] .Y Curiosamente, hemos observado que la sobreexpresión de miR-375 puede promover drásticamente el crecimiento celular en la línea celular SCLC NCI-H82.
MiRNAs son elementos de regulación post-transcripcional negativos de la expresión génica. miARN individuales se regulan múltiples ARNm y son posiblemente mejores blancos de la droga. Para comprender mejor el mecanismo molecular de miR-375 en los 3 subtipos de cáncer de pulmón, que predijo aún más los genes diana de miR-375 y se filtró a los genes diana putativos a través de vías KEGG. Hemos observado that22 genes diana son los miembros clave de las vías de señalización establecidos en el cáncer de pulmón incluyendo calcio, insulina, Jak-STAT, MAPK, mTOR, PPAR, el TGF-beta y vías de Wnt. Entre estos genes, se encontró que 6 genes diana (
FZD8
,
ITGA10
,
ITPKb
,
LRP5
,
PIAS1
y
RUNX1
) tenían una fuerte correlación negativa con el nivel de expresión de miR-375 en la comparación de SCLC frente a tejido normal. La asociación entre el cáncer de pulmón y 4 genes diana (
FZD8
,
LRP5
,
PIAS1
y
RUNX1
) se ha informado anteriormente [30-33 ] .Se ha informado de que
FZD8
es altamente expresado en la línea celular A549 y la desregulación de la
FZD8
podrían desempeñar un papel clave en el cáncer humano a través de la activación de la vía TCF-beta-catenina [30 ]. Lee et al demostraron una baja expresión significativa de
LRP5
gen en 6 de 17 muestras de carcinoma escamoso de pulmón [31]. En la línea celular H1299,
PIAS1
inhibe la activación de genes mediada por STAT1 y la actividad de unión al ADN [32]. En los pacientes con CPNM,
RUNX
fue más frecuentemente metilados en los tejidos tumorales que en los tejidos cancerosos [33] .Sin embargo, las funciones de
ITGA10
y
ITPKb Hoteles en el cáncer de pulmón son aún desconocido. En nuestro estudio,
ITPKb
ARNm y proteínas expresión fue significativamente las reguladas en tejidos de cáncer de pulmón. El ensayo de luciferasa reveló que
ITPKb
es el gen diana directa de miR-375. La sobre-expresión de miR-375 conducido a una disminución significativamente el nivel de proteína ITPKb. Los resultados confirmaron que el miR-375 regulada negativamente
ITPKb
a nivel de traducción. Para
ITGA10
gen, que no observó ningún efecto sobre el miR-375 en la actividad de la luciferasa y la supresión de la expresión de la proteína ITGA10 por el miR-375.
Recientemente, el miR-375 ha sido encontrado para suprimir características principales de cáncer mediante la focalización varios genes importantes como
AEG-1 |,
YAP1
,
IGF1R
y
PDK1
[16]. los genes diana regulados por miR-375 pueden funcionar espaciotemporalmente o en cooperación con otros en diferentes procesos celulares. Nuestra identificación del gen ITPKb como objetivo directo de miR-375 proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos que subyacen a la tumorigénesis. ITPKb, un miembro de [Ins
P página 3] 3-quinasas de la familia, se asigna al final telomérica del cromosoma humano 1 y se asocia con la vía de señalización de calcio. Se ha identificado como un gen candidato en la patogénesis de los trastornos inmunes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, y el melanoma maligno [34, 35].