Extracto
El panel NCI-60 de 60 líneas celulares de cáncer humano de nueve diferentes tejidos de origen se ha caracterizado extensamente en biológica, Los estudios moleculares y farmacológicos. Los análisis de los datos de tales estudios han proporcionado información valiosa para la comprensión de los procesos celulares y el desarrollo de estrategias para el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Aquí, Affymetrix® GeneChip ™ miARN versión 1 microarrays de oligonucleótidos se utilizaron para cuantificar 847 microRNAs para generar un conjunto de datos de expresión de 495 (58,4%) microRNAs que fueron identificados como se expresa en al menos una línea de células del panel de NCI-60. La exactitud de las mediciones de microARN se confirmó parcialmente por transcripción inversa y los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa. Similar a la observada entre los cuatro conjuntos de datos del NCI-60 microARN existentes, la concordancia del nuevo conjunto de datos de expresión con los otros cuatro fue modesto, con una media de los coeficientes de correlación de Pearson de 0,37 hasta 0,54. A pesar de esto, los resultados comparables con diferentes conjuntos de datos se observaron en la agrupación de las líneas de células por su expresión microRNA, la expresión diferencial de microRNAs por el tejido de origen de las líneas ', y la correlación de microRNAs específicos con el tiempo de duplicación de las células o su sensibilidad a la radiación. estado de la mutación de las células de líneas para el
TP53, PTEN
y
BRAF
pero no
CDKN2A
o
KRAS
genes relacionados con el cáncer se encontró que era estar asociado con cambios en la expresión de microRNAs específicos. El conjunto de datos generados microARN aquí debe ser valioso para los que trabajan en el campo de la micro ARN, así como en los estudios integromic del panel NCI-60
Visto:. Patnaik SK, Dahlgaard J, W Mazin, Kannisto E, Jensen T, Knudsen S, et al. (2012) La expresión de microARN en los Cáncer del NCI-60 líneas celulares. PLoS ONE 7 (11): e49918. doi: 10.1371 /journal.pone.0049918
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2012; Aceptado: 15 Octubre 2012; Publicado: 28 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Patnaik et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por el Instituto Roswell Parque cáncer, Buffalo, Nueva York, Estados Unidos de América, y el Instituto pronóstico médico, Hørsholm, Dinamarca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: co-autores JD , WM y SK son /eran empleados del Instituto Médico pronóstico, Hørsholm, Dinamarca, que se centra en el desarrollo y comercialización de tecnología basada en microarrays para su uso en la atención clínica para el cáncer. Sin embargo, esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Uno de los co-autores de este manuscrito, Sai Yendamuri (SY) es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Los estudios sistemáticos de grupos de líneas celulares han proporcionado información sobre los procesos biológicos y sus mecanismos y han demostrado su utilidad para la elaboración de enfoques diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, la fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) y dependientes de los mecanismos supresores de tumores -independiente se han identificado utilizando un panel de líneas celulares de melanoma [1], y marcadores genéticos de la sensibilidad a la droga contra el cáncer, el trastuzumab (Herceptin ™) se han delineado utilizando un panel de cáncer de mama líneas celulares [2]. El panel NCI-60 de 60 tumores de líneas celulares humanas de diversas histologías y nueve diferentes tejidos de origen fue desarrollado por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de los EE.UU. a finales de 1980 con el propósito de rastrear fármacos contra el cáncer [3]. Durante las dos últimas décadas, las células NCI-60 se han utilizado para probar más de 150.000 compuestos químicos y extractos de productos naturales para el descubrimiento de fármacos [4]. Numerosos estudios han perfilado las células para las características fenotípicas, tales como el tiempo de duplicación, de eflujo de fármaco, y sensibilidad a la radiación, y para la caracterización de sus genomas y los niveles de ARN, proteínas y metabolitos [5], [6], [7]. Los análisis de los datos integrados de múltiples estudios también han arrojado importantes conocimientos de importancia biológica y clínica [8].
Los microARN, corta no codificante ARN, desempeñan papeles importantes en los procesos celulares por la orientación transcripciones de ARNm que codifican proteínas que inhiben traducción o causar su degradación. En los seres humanos, 2.042 especies de microRNAs maduros han sido identificados según la versión más reciente (19; agosto de 2012) de la secuencia repositorio miRBase microARN [9]. la expresión desregulada de microRNAs se produce en muchas enfermedades, incluyendo el cáncer [10], y esta observación ha dado lugar a múltiples estudios que demuestran la utilidad terapéutica y marcador biológico de estas moléculas [11], [12]. La evaluación de los microRNAs expresada en el panel NCI-60 de líneas de células ha demostrado ser útil en la identificación, entre otras cosas, las funciones biológicas de los microRNAs específicos [13], [14], las bases mecanicistas y el potencial biomarcador de microRNAs en la sensibilidad de drogas [ ,,,0],15], [16], las firmas genéticas de enfermedades [17], [18], y las bases estructurales de las redes de regulación microRNA [19], [20].
la expresión de microRNAs en el NCI-60 Las células fueron cuantificados por primera vez en 2007 por Gaur, et al. [21] y soplador, et al. [22] en los estudios que examinaron respectivamente 241 y 321 especies de las moléculas. El presente estudio fue diseñado para ampliar las NCI-60 perfiles de expresión de microARN para cubrir los muchos cientos de microARN que ya han sido descubiertos. Si bien este estudio ha estado en progreso, otros dos grupos han publicado datos que cuantifiquen & gt; 700 microRNAs en el panel NCI-60 [23], [24]. Aquí, además de la generación y caracterización de un nuevo conjunto de datos de expresión de microARN, tales múltiples conjuntos de datos se comparan, y analiza la información de integrar en la proliferación celular, la expresión de ARNm, las mutaciones de oncogenes, o sensibilidad a la radiación de los estudios sobre el panel de líneas celulares son reportados.
Materiales y Métodos
el aislamiento de ARN a partir de células del NCI-60 Panel
Para cada una de las 60 líneas celulares del panel NCI-60 (tabla S1), un ml de células congeladas (1-2 × 10
6) en medio de cultivo de la línea celular específica que contiene 10% de dimetilsulfóxido se obtuvo del Developmental Therapeutics Program (DTP) de la División de Tratamiento y Diagnóstico del cáncer del Instituto Nacional del cáncer. Inmediatamente antes del aislamiento de ARN, las células se descongelaron en un baño de agua a 37 ° C durante cinco minutos y se recogió por centrifugación a 200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aislamiento de ARN total de las células utilizando el kit de mirVana ™ (Ambion®, Austin, TX) se llevó a cabo en lotes aleatorios de 12-24 líneas celulares durante cuatro días dentro de los 10 días de la obtención de las células. La concentración de ARN se midió por espectrofotometría de absorción en un NanoDrop instrumento ™ 2000 (Thermo Scientific®, Waltham, MA).
La cuantificación de microARN por PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
Los niveles de madura microRNAs
miR-16
,
-21
,
-30-5p
,
-106a
y
Hoteles en -200b 50 ng de ARN total se midieron utilizando TaqMan ™ Micro RNA kit de transcripción inversa y ensayos de RT-PCR (Applied Biosystems®, Foster City, CA) según los protocolos sugeridos por el fabricante. Los números de identificación de los ensayos de microARN fueron 391, 397, 417, 578, y 1800, respectivamente. reacciones de RT y PCR para todas las muestras de ARN se realizaron en conjunto para cada ensayo microARN. cuantificación ciclo (C
q) los valores fueron calculados como el promedio de C
q valores identificados por SDS software (versión 2.3; Applied Biosystems®) para las reacciones de 40 ciclos de PCR por triplicado que se realizaron en un termociclador 7900HT (Applied Biosystems®)
la hibridación de microarrays
la matriz GeneChip ™ miARN (versión 1;. Affymetrix, Santa Clara, CA) plataforma se utilizó para cuantificar los microRNAs en el ARN total aislado de la NCI-60 Células. Uno de ARN poliadenilado fue mg y se ligó con dendrímeros con biotina 3DNA ™ utilizando el HSR ™ biotina RNA Labeling Kit FlashTag (Genisphere®, Hatfield, PA). El ARN marcado, en un volumen de 80 l, se calentó a 99 ° C durante 5 minutos y luego a 45 ° C durante 5 minutos para la carga en una matriz utilizando materiales y métodos se proporciona con el Affymetrix GeneChip ™ hibridación, lavado y las manchas equipo. RNA-array hibridación se realizó con agitación a 60 revoluciones por minuto durante 16-18 horas a 48 ° C en una estación de fluidos Affymetrix® 450, después de lo cual se lavaron las matrices y un conjugado de estreptavidina-ficoeritrina se utilizó para la detección de ARN encuadernados en las matrices con un microscopio confocal de escaneo láser GeneChip ™ Systems 3000Dx2 (Affymetrix). Los valores de señal se calcularon utilizando el software de Affymetrix GeneChip ™ Consola de comandos. Los datos de todas las matrices tenían bajo ruido de fondo, una distribución similar de las señales para los ARN endógenos, y una distribución de señal similar y dependiente de la concentración de ARN específicos que se han de púas en las muestras de ARN antes de que fueran etiquetados. Los datos de la señal en bruto se ha depositado con el número de acceso E-MTAB-327 en la base de datos ArrayExpress del Instituto Europeo de Bioinformática [25].
El GeneChip ™ versión 1.0 miARN matriz tiene 11 micras de tamaño 46.228 puntos de sonda de 7.815 sondas de oligonucleótidos de ADN incluyendo aquellos contra 922 ARN no microARN humanos, 847 microARN humanos, y 5.856 microRNAs de otras 70 especies. Sondas para la detección de microARN son manchas en la matriz por cuadruplicado. La matriz también dispone de 95 sondas no específicas, cada uno manchado hasta 94 veces, que se han agrupado por el contenido de GC. Las señales procedentes de estas sondas fondo se utilizan para hacer llamadas de detección "ausente" o "presente". En total, 72 de matriz hibridaciones se llevaron a cabo en nueve lotes, cada uno con ocho arrays, durante tres días, con dos, tres y cuatro lotes utilizados en la primera, segunda y tercera día, respectivamente (Tabla S1). hibridaciones se realizaron por cuadruplicado durante cuatro líneas celulares elegidas arbitrariamente para evaluar la reproducibilidad técnica (tabla S1).
Tratamiento de datos de microarrays
archivos de datos en bruto de los 72 gama hibridaciones fueron procesados juntos utilizando Affymetrix miARN Herramienta de software de control de calidad (versión 1.0.33) con los siguientes pasos en orden según lo sugerido por Genisphere®: detección de fondo, corrección de fondo con el método robusto promedio multichip (RMA) [26], cuantil normalización, y la mediana de resumen esmalte [27]. El control de calidad y la correlación entre repitiendo los análisis se utilizaron para identificar la mejor de las cuatro réplicas para cuatro de las preparaciones de ARN (cuatro líneas celulares) que se ensayaron por cuadruplicado. Los datos de las tres repeticiones restantes fueron excluidos del conjunto de datos de expresión final. En esta etapa, la matriz de datos de expresión tenía valores de la señal de 7635 humana, así como los ARN no humanos. Los valores para 324 no microARN ARN y microRNAs 2.282 con las llamadas "ausente" de detección para todas las 60 líneas celulares fueron retirados de la matriz de datos. La expresión de ARN con valores de señal & lt; 4x el rango promedio entre el cuartil de los valores de señal para todos los ARN fue considerado como ausente, y los ARN cuya expresión estaba ausente en todas las líneas celulares a continuación, fueron excluidos de los nuevos análisis
. la comparación con el NCI-60 conjuntos de datos de expresión de microARN existentes
Pre-procesado de microARN expresión de datos generados por el soplador, et al. [22], Gaur, et al. [21], Liu, et al. [24], y Sokilde, et al. [23] se obtuvieron, respectivamente, mediante la aplicación del NCI CellMiner ™ web [28], el sitio DTP, los autores, y Gene Expression Omnibus del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, EE.UU., con el número de acceso GSE26375. Para el conjunto de datos de Gaur, et al., La fila de nombres de microARN fueron normalizados a los nombres utilizados en la versión 15 de la base de datos miRBase [9] como se ha descrito anteriormente [23]. Pearson coeficientes de correlación entre los valores de medición de microARN no transformada en estos conjuntos de datos y en la generada en este estudio se calcularon utilizando R.
Análisis de correlación de los niveles de microARN y su objetivo ARNm
Raw datos de expresión génica adquiridos utilizando Affymetrix GeneChip ™ HG-U133A microarrays de oligonucleótidos de ADN para la expresión de ARNm en 57 de los 60 NCI-60 líneas celulares de este estudio podrían ser obtenidos mediante la aplicación web CellMiner ™. Una lista de los ARNm 10.392 conservadas (los símbolos de genes únicos) predicha por el algoritmo TargetScan 5.1 [29] siendo blanco de 153 familias microRNA conservadas se obtuvo en línea en http://www.targetscan.org. Los datos de la expresión de ARNm fue pre-procesado utilizando el método de RMA en el paquete Affy Bioconductor [30] en R, normalizada para obtener y registrar valores de la señal de microarrays
2-transformado. Después se aplicó un filtro para retener valores de sólo aquellas sondas para los que el rango de la muestra de los valores de la señal era ≥1. De las 495 microRNAs expresada considerados en este estudio, 192, perteneciente a un total de 121 familias microRNA conservadas, fueron identificados como la orientación de los 6.465 10.392 ARNm. Gene símbolos de los 6.465 mRNAs se convirtieron a 10.612 identificadores de sonda Affymetrix® utilizando el paquete BioMart Bioconductor [31] en R. Un total de 117,004 Pearson coeficientes de correlación entre los niveles de expresión de los 192 microRNAs y sus mRNAs objetivo como se detecta por los 10.612 sondas se a continuación, calcula de pruebas t de dos colas R. con Benjamini-Hochberg corrección para una tasa de falso descubrimiento (FDR), de & lt; 5% se utilizó para evaluar la significación de las correlaciones. Las correlaciones también se calcularon para 10 permutaciones aleatorias de etiquetas de clase (que identifican las células de líneas) del conjunto de datos de expresión de ARNm.
Otros en
El limma (versión 3.10.0) paquete de Bioconductor [32] se utilizó en R para el análisis de la expresión diferencial de registro usando los valores de expresión
2-transformado. Los análisis estadísticos y trazado gráfico se realizaron utilizando Excel ™ (versión 12; Microsoft®, Redmond, WA), Prism ™ (versión 5.0; GraphPad®, La Jolla, CA), y R (versión 2.12.1). TM4 [33] MultiExperiment Viewer (versión 4.6) se utilizó para el análisis de agrupamiento jerárquico con la optimización de la hoja de pedidos. A menos que se indique otra cosa, se utilizó un valor de p por debajo de 0,05 en las pruebas estadísticas para considerar la significación estadística. Detalles sobre la corrección de múltiples ensayos se proporcionan con los resultados de los análisis donde se aplicó una corrección de este tipo.
Resultados
MicroARN de perfiles de expresión de células NCI-60 Uso de Affymetrix microarrays
GeneChip® miARN microarrays de Affymetrix ® 1.0 se utilizaron para examinar la expresión de microARN 847 en el ARN total de 60 líneas celulares de cáncer del panel de la línea celular NCI-60 (tabla S1). Este trabajo se llevó a cabo durante tres días en un total de nueve lotes de ocho muestras de ARN cada uno (Tabla S1). ARN utilizado para el perfil de expresión se obtuvo de células congeladas, similar a un estudio previo de expresión microRNA en el panel NCI-60 [21]. El rendimiento de ARN a partir de 1-2 x 10
6 células de las líneas celulares a distancia de 11 a 60 ug (media = 37; desviación estándar [DE] = 11).
Técnica de la replicabilidad método de perfiles de expresión fue confirmado por el examen de los datos de hibridación durante cuatro preparaciones de ARN, uno por cada uno de los KM12, PC-3, RPMI-8226 y OVCAR-8 líneas celulares que se ensayaron por cuadruplicado. La media (y SD) de los percentiles 75 de registro
2 transformó-valores de la señal de microarrays para los conjuntos por cuadruplicado para los 1.779 sondas (847 para microRNAs) anotado como humano específico fueron 3,58 (0,07), 3,61 (0,12), 3,62 (0,04) y 3,50 (0,10), respectivamente. Para los percentiles 95, los valores fueron de 9,60 (0,10), 9,43 (0,09), 9,66 (0,11) y 9,60 (0,21), respectivamente. La media (y DE) de los coeficientes de 12 auto-auto correlación de Pearson para las cuatro líneas celulares fueron 0,98 (& lt; 0,01), 0,97 (0,01), 0,98 (& lt; 0,01) y 0,98 (0,01), respectivamente. Para cada línea celular, las hibridaciones se realizaron por cuadruplicado en diferentes días excepto que para OVCAR-8, un par de los quadruplicates se ensayó en el mismo lote (Tabla S1). El coeficiente de correlación de Pearson fue 0,980 para este par de repeticiones intra-lotes.
Al menos una de las 60 líneas celulares expresaron 523 (63,4%) de los 847 microRNAs detectables por la plataforma de microarrays como se indica por el significativamente más altos valores de la señal de las sondas en microARN específicos en comparación con desajuste sondas no específicos de contenido similar GC. Aunque las correlaciones entre replicados descritos anteriormente parecen excelentes, un examen más detallado reveló que las correlaciones no fueron buenos en los valores de señal de microarrays de baja. Esto se muestra en la figura S1 durante cuatro comparaciones entre replicados. Dado que este indica altos niveles de ruido a valores bajos de señal, un filtro basado en el valor de la señal se realizó para identificar los ARN que podrían ser considerados como ser cuantificados con mayor precisión. De acuerdo con ello, la expresión de los ARN con valores de señal & lt; 4x la media (18,3) de los intervalos inter-cuartil de los valores de señal para todas las hibridaciones (rango = 13,3-26,3; SD = 2,7) fue considerado como ausente. Veintiocho microRNAs con expresión ausente en todas las 60 líneas celulares Según este criterio fueron excluidos de los nuevos análisis. Por lo tanto, 495 (58,4%) de los 847 microRNAs detectables con la plataforma de microarrays fueron considerados expresa y se utilizó los datos para ellos para su posterior análisis.
Correlación entre Expandido y basados en RT-PCR microARN cuantificaciones
para confirmar al menos parcialmente, la exactitud de las mediciones de expresión de microARN basadas en matrices, RT-PCR se utilizó para cuantificar los niveles de microARN
miR-16
,
-21
,
-30-5p
,
-106a
, y
-200b Hoteles en 50 ng de cada una de las preparaciones de ARN de 12 líneas celulares. Las líneas celulares fueron seleccionados al azar y los microRNAs se escogieron arbitrariamente de aquellos para los cuales al menos la mitad de las líneas celulares de conectarse tenía valor & gt señal de microarrays
2-transformado; 5. Como se muestra en la figura 1, los dos conjuntos de mediciones para todos los cinco microRNAs tenían correlaciones significativas (P & lt; 0,01) en las pruebas de Pearson, con coeficiente de correlación absoluta ≥0.70. Los valores de la pendiente de las rectas de regresión lineal (método de los mínimos cuadrados) variaron de
-
0,40 (
miR-16
) a
-
0,93 (
miR 21
) durante cuatro microARN, lo que indica una mejor capacidad de detección de los microARN con el ensayo de RT-PCR. Para
miR-200b
, esto también es notable, con las cinco muestras de ARN con valores de señal pobre de microarrays (2
1
2-2
1
7) pero detectables RT-PCR C
q valores en una buena gama (27,8-34,3). Para
miR-30a-5p
, la pendiente de la recta de regresión fue
-.
2,2, lo que sugiere una mejor detectabilidad con la plataforma de microarrays
coeficientes de correlación de Pearson (
r
), los valores de P y de mejor ajuste (mínimos cuadrados) líneas se muestran para la RT-PCR C
q y log
2-transformado los valores de señal de microarrays de microARN
miR-16
,
-21
,
-30-5p
,
-106a
, y
-200b gratis (n = 12).
Comparación con el NCI-60 conjuntos de datos existentes de expresión de microARN
de los 495 microRNAs considera expresa en el conjunto de 60 líneas celulares en este estudio, 135 (27%), 144 (29%), 299 (60%) y 359 (73%) también se cuantificaron en 59 de las 60 líneas celulares en los estudios de soplador, et al. [22], Gaur, et al. [21], Liu, et al. [24], y Sokilde, et al. [23], respectivamente. Estos cuatro estudios utilizaron respectivamente encargo 40-mer microarrays de ADN, ensayos TaqMan ™ RT-PCR, Agilent® microarrays de DNA 60-mer (versión 2), y Exiqon® ácido nucleico cerrado miRCURY ™ microarrays (Dx, versión 9.2) para evaluar la expresión de 321, 241, 723 y 955 microARN, respectivamente. En Pearson análisis de correlación de las mediciones de expresión no transformadas de microARN comunes a esto y los estudios soplador, Gaur, Liu o Sokilde, la media (y SD) de los coeficientes de Pearson fueron 0,44 (0,30) 0,47 (0,28), 0,54 (0,29) y 0,45 (0,34), respectivamente. Las fracciones de microARN con coeficiente de Pearson & gt; 0,75 fueron 0,18, 0,16, 0,29 y 0,24, respectivamente (figura 2). En los cuatro comparaciones, los coeficientes de correlación fueron superiores para microRNAs con altos valores de la señal que para aquellos con valores bajos (datos no mostrados). También se realizaron análisis similares para comparar los conjuntos de datos de Sokilde, et al. y Liu, et al. en contra de otros (figura S2). Al correlacionar el conjunto de datos Sokilde con los conjuntos de datos soplador, Gaur y Liu, respectivamente, la media (y SD) de los coeficientes de Pearson fueron 0,37 (0,32), 0,39 (0,33) y 0,44 (0,30), respectivamente. Los valores fueron 0,47 (0,31) y 0,42 (0,22) en las comparaciones del conjunto de datos Liu con los conjuntos de datos de soplado y Gaur, respectivamente. Por lo tanto, a juzgar por las correlaciones observadas con conjuntos de datos existentes, la "corrección" del conjunto de datos de expresión de microARN generados en el presente estudio es similar a los generados en los estudios anteriores. Debido a la sensibilidad y especificidad variables de las cinco plataformas de cuantificación de estos estudios para diferentes microRNAs, no se realizó una comparación entre plataformas para las correlaciones de la línea celular.
distribución de frecuencias acumuladas figuran para los coeficientes de correlación de Pearson (
r
) con un compartimiento de tamaño de 0,025 para microRNAs cuantificados en este estudio y en los estudios de soplador, et al. [22], Gaur, et al. [21], Liu, et al. [24], y Sokilde, et al [23]. La distribución de los coeficientes con las mediciones de expresión de Liu, et al. resampled también se indica.
Expresión microARN y tejidos de origen
Para evaluar si la expresión de microARN entre las líneas celulares se asoció con el tejido de origen de las líneas celulares, sin supervisión agrupamiento jerárquico basado en promedio de correlación de Pearson uncentered se ha realizado mediante microarrays de registro de valores de la señal
2-transformado para el 495 expresaron microARN (figura 3A). Los grupos de la leucemia y melanoma líneas celulares completamente segregados en sus propios grupos independientes. Todas las siete menos uno (HCT-116) de cáncer de colon líneas celulares también segregados en una agrupación independiente. Una agrupación igual de firme de líneas celulares para los restantes seis tejidos de origen no fue visto. El cáncer de ovario línea celular OVCAR-8 y la línea celular NCI /ADR-RES derivada de ella [34], así como el melanoma línea celular M14 y la línea celular MDA-MB-435 derivada de la misma [35 ], agrupadas como vecinos como se esperaba. Sin embargo, esto no fue visto por el tercer par de líneas de células homólogas en el panel NCI-60, la línea celular U251 y su derivado, SNB-19 [36]. la huella de ADN sugiere que, en comparación con la similitud genética -97% 94% de los otros dos pares, este par de líneas es sólo el 81% similar.
Un
. agrupamiento no supervisado de 60 NCI-60 líneas celulares de registro
2-transformado los valores de señal de microarrays de la 495 expresado microRNAs se muestra como un dendrograma. Los diferentes tipos de tejidos de origen de las líneas celulares se indican por su color (
Pr.
, Próstata). El árbol se extrae de las correlaciones de Pearson no centradas, con vínculos medios utilizados para la unión de las agrupaciones. La escala de la izquierda representa node-alturas.
B Opiniones. Mapa de calor, con su pseudo-escala de color por debajo, de la Z a escala valores de la señal de microarrays de las 60 líneas celulares para las series de ocho microRNAs cada uno con valores más bajos de P en las pruebas de expresión diferencial en las líneas de células de un tejido específico de origen en comparación con todas las otras líneas celulares. Ambas líneas celulares y microRNAs se agrupan por el tejido de origen. escalamiento Z se llevó a cabo a lo largo de filas (por microARN).
Para identificar microRNAs expresadas diferencialmente en las líneas de células de un tejido-origen específico en comparación con todas las otras líneas celulares, bayesiana empírica moderado t- estadísticas y Benjamini-Hochberg corrección para FDR & lt; se han usado 5%. Los grupos de líneas celulares de cáncer del SNC (n = 6), cáncer de colon (n = 7), leucemia (n = 6), melanoma (n = 9), cáncer de ovario (n = 7) y el cáncer renal (n = 8), respectivamente, mostraron expresión diferencial de 83 (17%), 37 (7%), 137 (28%), 74 (15%), 14 (3%) y 3 (0,6%) del 495 microRNAs presente en el conjunto de datos completo. No hay microRNAs expresados diferencialmente pueden ser identificados en los grupos de líneas celulares de mama (n = 6), NSCLC (n = 9) o de la próstata (n = 2) el cáncer, aunque los grupos tenían 10 (2%), 24 (5% ) y 4 (0,8%) microARN para el cual los valores de p fueron & lt; 0,05 sin ajuste por falso descubrimiento. Los mapas de calor en las figuras 3B y S6 muestra la expresión de microRNAs ocho para cada uno de los nueve grupos de líneas celulares con los valores más bajos de P. Estadísticas detalladas de los 72 microRNAs totales se proporcionan en la tabla S2.
Expresión microARN y sensibilidad a la radiación
Amundson, et al. han examinado la sensibilidad a la radiación gamma de 59 de las 60 líneas celulares de este estudio para cuantificar siete diferentes parámetros de supervivencia de radiación [37]. Los parámetros incluyen SF2, SF5 y SF8, la fracción de la población de células que sobrevive después de la exposición a 2, 5 y 8 Gy de radiación, respectivamente. Para comprobar si las líneas celulares NCI-60 se pueden clasificar en dos grupos sensibles a la radiación y resistentes de tamaño similar, como se ha hecho para la sensibilidad a los fármacos (por ejemplo, [6], [38], [39]), una método no paramétrico se utilizó para estimar la densidad de kernel de Gauss de los datos de respuesta de radiación después de registro
2 transformación y la normalización de puntuación z. Una distribución bimodal con los grupos sensibles y resistentes de tamaño similar no se observó para cualquiera de los siete parámetros de supervivencia de radiación (figura S3). Por lo tanto, los parámetros de radiación se consideraron como variables continuas y análisis de correlación de Pearson de registro
2 valores de los parámetros transformada con el registro se realizaron los valores de expresión de microARN
2-transformado. Aunque las correlaciones significativas con absoluta coeficiente & gt Pearson; 0,5 no fueron vistos en cuatro de los parámetros de sensibilidad a la radiación, que estaban presentes en 30 (6%), 27 (5%) y 33 (7%) del 495 expresó microRNAs de este estudio para SF2, SF5 y 8 de San Francisco, respectivamente (figura S4). Sin embargo, las correlaciones para los tres parámetros fueron impulsados en gran medida por las seis líneas celulares de leucemia altamente sensibles a la radiación del panel NCI-60. Cuando se excluyeron las líneas leucémicas de los análisis de la correlación, la expresión de ninguna de las 495 microRNAs correlacionados con absoluta coeficiente de Pearson & gt; 0,5 para cualquiera de los tres parámetros de sensibilidad a la radiación. Se observaron resultados similares cuando los conjuntos de datos de expresión de microARN de Liu, et al. y Sokilde, et al. fueron analizados (figura S4). .. Tal como se recoge en el cuadro S3, 10, cuatro y 14 microRNAs en las bases de datos del presente estudio, Liu, et al, y Sokilde, et al, respectivamente, tuvieron absoluta coeficiente de Pearson & gt; 0,4 para al menos uno de SF2, SF5 y 8 de San Francisco. Los microARN
let-7i
,
miR-142-5p y
miR-193b
eran comunes a los resultados con los tres conjuntos de datos.
Asociación de microRNAs con Oncogene mutaciones
El estado de mutación de 24 oncogenes es conocido por 59 de las 60 líneas celulares de este estudio [40]. Para algunos de los genes -
BRAF
,
CDKN2A gratis (
p16
),
KRAS
,
PTEN
, y
TP53 CD - mutaciones oncogénicas existe en & gt; 10 de las líneas celulares, lo que permite una comparación de los niveles de expresión de microARN entre los grupos de tipo salvaje y mutante líneas celulares. El uso de Bayes empírica moderado t-estadísticas y Benjamini-Hochberg corrección para FDR & lt; 5%, microRNAs
miR-29b
y
miR-769-3p
resultaron ser los dos únicos que microRNAs fueron expresados diferencialmente entre el 47 mutante
PTEN Opiniones y 12 de tipo salvaje
PTEN
líneas (P & lt; 0,01 para ambos microRNAs). En un análisis similar, los microARN
miR-34a
y
miR-34a * gratis (
miR-34a-3p
) resultaron ser los únicos dos microARN que estaban diferencialmente expresado entre el 43 mutante
TP53
y 16 de tipo salvaje
TP53
líneas (P & lt; 0,01 para ambos microRNAs). La expresión diferencial de los cuatro
PTEN CD - o
TP53
-asociado microRNAs se representa en la figura 4. Para los
BRAF
gen, por lo que 11 líneas de células portan mutaciones , 40 microARN fueron expresados diferencialmente, con
miR-146a
y
miR-509-3p
sobreexpresa y
miR-149
y
mR-192b
underexpressed la mayoría (S5 tabla). Este elevado número de micro ARN expresados diferencialmente puede deberse a que ocho de los 11
BRAF
mutantes líneas celulares de melanoma son líneas celulares. No hay microRNAs expresados diferencialmente fueron identificados en este tipo de análisis para
CDKN2A gratis (33 mutantes líneas celulares) o
KRAS gratis (11 mutantes líneas celulares).
Las gráficas de puntos con medianas y rangos intercuartiles se muestran para la expresión de microRNAs
miR-29b, -34a
,
-34a *
y
Hoteles en -769-3p 59 NCI-60 líneas de células agrupadas por el estado de mutación para la
PTEN
o
TP53
genes.
correlación entre los niveles de microARN y su objetivo ARNm
se detectaron correlaciones significativas entre la expresión de microRNAs y mRNAs de 3483 (3%) de 117,004 pares posibles de los microARN y sus ARNm diana como se predijo por el algoritmo TargetScan. Los 3.483 pares compuesta por 167 microRNAs y 1.232 ARNm diana con los símbolos de genes únicos. Entre los 3.483 correlaciones significativas, 1.997 (57%) fueron negativos y 1.486 (43%) fueron positivos (Figura S5). Por el contrario, la media y SD para el número de correlaciones significativas visto con 10 permutaciones aleatorias del conjunto de datos de expresión de ARNm para cambiar los identificadores de línea celular fueron 21,3 y 6,6, respectivamente. Con Benjamini-Hochberg corrección para FDR por debajo del 5%, se esperaba un valor medio de 174. Además, los valores de 117,004 coeficientes de correlación obtenidos con el conjunto de datos de la expresión de ARNm fueron significativamente diferentes en las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon (P & lt; 2 × 10
-16). De los obtenidos con cualquiera de los 10 conjuntos de datos permutados
Discusión
la expresión de microARN 847 en el panel NCI-60 de las líneas de células tumorales humanas fue examinado en este estudio utilizando Affymetrix GeneChip ™ miARN microarrays de oligonucleótidos de ADN 1.0 para generar un conjunto de datos de 495 microARN identificados como se expresa en al menos una de las 60 líneas del panel. Por lo tanto, el estudio se expande la cobertura microRNA de tres de los cuatro existentes NCI-60 expresión de datos. Estos conjuntos se generaron de forma independiente utilizando diferentes plataformas de alto rendimiento - personalizada 40-mer microarrays de ADN, TaqMan ™ RT-PCR, Agilent® 60-mer microarrays de ADN, o ácido nucleico cerrado Exiqon® miRCURY ™ microarrays - para evaluar los niveles de 321, 241, 723 o 955 microARN, respectivamente [21], [22], [23], [24]. Como se representa en las figuras 2 y S2, la correlación de las mediciones de expresión de microARN entre los cinco conjuntos de datos es modesta, con coeficientes medios de Pearson varían desde 0,37 hasta 0,54.