Extracto
Antecedentes
constitutivamente activa variantes del receptor de andrógenos (AR-V) que carecen del dominio de unión a ligando (LBD) puede favorecer la aparición de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). La expresión de AR-Vs en el lugar de la metástasis clínicamente más importante, el hueso, se ha, sin embargo, no ha sido bien documentado. Nuestro objetivo era, por tanto, para comparar los niveles de AR-Vs en la hormona-ingenuo (HN) y las metástasis óseas CRPC en comparación con PC primaria y tejido de la próstata no malignos, así como en relación con AR de expresión de proteínas, todo el genoma de los perfiles de transcripción y La supervivencia del paciente.
Metodología /Principales conclusiones
Hormona-naïve (n = 10) y de los huesos CRPC metástasis muestras (n = 30) se obtuvieron de 40 pacientes de cirugía de metástasis. muestras de próstata no malignas y malignas fueron compradas a los 13 hombres prostatectomizados. Los niveles de longitud AR completo (ARfl) y AR-Vs denominan AR-V1, AR-V7, y mRNA AR-V567es se midieron con RT-PCR y perfiles de transcripción de todo el genoma con una matriz Illumina BeadChip. Los niveles de proteína se examinaron mediante transferencia Western e inmunohistoquímica. Se detectaron las transcripciones de ARfl, AR-V1 y AR-V7 en la mayoría de los tumores primarios y metástasis, y los niveles se incrementaron significativamente en las metástasis óseas CRPC. Se detectó la transcripción AR-V567es en el 23% de las metástasis óseas sólo CRPC. Un subgrupo de las metástasis óseas CRPC expresa proteínas truncadas AR-LBD en niveles comparables a la ARfl. Detectable AR-V567es y /o ARNm AR-V7 en el cuartil superior, vista en 1/3 de todas las metástasis óseas CRPC, se asoció con una alta puntuación de AR inmunotinción nuclear, la regulación del ciclo celular y la supervivencia a corto perturbado.
Conclusiones /Importancia
la expresión de AR-V se incrementa en comparación con CRPC metástasis óseas HN y asociado con un pronóstico especialmente pobre. Se necesitan más estudios para probar si los pacientes que expresan tales AR-V en sus metástasis óseas se benefician más de los fármacos que actúan sobre o aguas abajo de éstos AR-V que de terapias que inhiben la síntesis de andrógenos
Visto:. hornberg E, Ylitalo EB, Crnalic S, Antti H, Stattin P, Widmark A, et al. (2011) La expresión del receptor de andrógenos variantes de empalme en cáncer de próstata metástasis ósea se asocia con la castración resistencia y supervivencia corta. PLoS ONE 6 (4): e19059. doi: 10.1371 /journal.pone.0019059
Editor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2011; Aceptado: March 23, 2011; Publicado: 28 de abril 2011
Derechos de Autor © 2011 hornberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Sociedad sueca del cáncer, el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación de Investigación del cáncer de Leones y la Fundación del cáncer norte de Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los andrógenos regulan el crecimiento del tejido normal de la próstata y la diferenciación, a través de la activación de los receptores de andrógenos en las células epiteliales y del estroma, y también juegan un papel importante durante todas las fases de crecimiento del cáncer de próstata (PC). La terapia estándar para pacientes con PC avanzada, en consecuencia, reducir los andrógenos, ya sea por la castración quirúrgica o médica. Después de un período de tumores iniciales de remisión finalmente recaer, en su mayor parte dentro del hueso, y luego se denominan PC resistente a la castración (CRPC). Los mecanismos que controlan el crecimiento CRPC en las metástasis óseas son sin embargo en gran parte desconocida y rara vez explorado mediante el examen de realidad tales metástasis en pacientes.
Curiosamente, el receptor de andrógenos (AR) es comúnmente activo en CRPC pesar de los niveles de castración de testosterona [1 circulante ], [2] y inmunotinción intensa AR nuclear en las metástasis óseas CRPC está relacionada con una supervivencia particularmente corta [3]. Se han sugerido diferentes mecanismos para contribuir a la activación AR en CRPC, incluyendo la síntesis intracrina de los andrógenos, los cambios genéticos y epigenéticos de la AR por lo que es más sensible a la activación por los andrógenos u otros ligandos [1], [4], [5] y la expresión de variantes constitutivamente activa AR (AR-V, ver más abajo). Estos hallazgos sugieren que la CRPC podría ser tratado con éxito con los nuevos fármacos actualmente en ensayos clínicos que bloquean la síntesis de andrógenos o la AR en las metástasis (revisado en [6]), pero que los receptores constitutivamente activos todavía podría ser un problema. Por lo tanto, se necesitan estudios para explorar si estas AR-V se expresa comúnmente en las metástasis óseas CRPC o no.
Estructuralmente el ser humano
AR
gen está compuesto por ocho exones que codifican una proteína de 110 kDa que consiste en un dominio NH
2 terminal de trans-activación (NTD), un dominio de unión al ADN (DBD), una región bisagra, y el dominio COOH terminal (CTD), que es también el dominio de unión a ligando (LBD) [7]. El LBD, codificada por los exones 4-8, no es esencial para la actividad transcripcional [8]. Truncado AR-Vs que carecen de la LBD y propuesto para ser constitutivamente receptores activos han sido detectados en líneas celulares PC, así como en muestras clínicas, incluyendo el tejido benigno, maligno y metastásico, como resultado de corte y empalme alternativo o sin sentido mutaciones del humano
AR
genes [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Aumento de los niveles de las variantes de empalme de AR se han detectado en CRPC en comparación con la hormona-naïve (HN) PC [13], [14], [16]. Esos estudios incluyeron muestras CRPC obtenidas de tumores primarios en la cirugía, o metástasis de los tejidos blandos y algunas metástasis óseas recogidas en la autopsia. La expresión de AR-Vs en el lugar de la metástasis clínicamente más relevante, el hueso, no ha sido bien documentada.
El objetivo de este estudio fue, por tanto, para analizar la expresión de la AR longitud completa (ARfl) y su clínicamente más abundante de empalme variantes aquí denomina AR-V1, AR-V7 [14] (también referido como AR3 [13], [17], y AR-V567es [16] en HN y metástasis óseas CRPC en comparación con la expresión en PC primaria y en el tejido de la próstata no maligno. por otra parte, los niveles de transcripción AR estaban relacionados con AR expresión de la proteína, los perfiles de transcripción de todo el genoma y el resultado clínico.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
el estudio fue aprobado por el comité de revisión ética local de la Universidad de Umeå y los participantes dieron su consentimiento por escrito o verbal.
Pacientes
las metástasis óseas se obtuvieron a partir de una serie de fresco congelado y se fija con formalina biopsias incluidas en parafina obtenidos de pacientes con PC operados para la compresión de la médula espinal o metastásico fracturas patológicas en el hospital de la Universidad de Umea (2003-2009). Estos pacientes se han descrito a fondo en [3] y las características clínicas y terapias se resumen en la Tabla 1. El estudio también incluye 13 pacientes que fueron tratados con prostatectomía radical en el Hospital de la Universidad de Umea, entre Feb de 2005 y Septiembre 2006. La edad media de los pacientes era de 60 años (rango 48-68 años) y la mediana de PSA eran de 6,6 ng /ml (rango de 3,5 a 24 ng /ml). Once de los pacientes tenían tumores calificado como puntuación de Gleason (GS) 7 y dos como GS 8. Cuatro de los tumores se encontraban en estadio T2 y nueve en estadio T3. Inmediatamente después de la extirpación quirúrgica de las próstatas fueron llevados al departamento de Patología y cortadas en rebanadas de 0,5 cm de espesor. A partir de estas rebanadas 20 muestras fueron perforados unos de próstata mediante un cilindro de acero de 0,5 cm y se congelaron en -70 ° C a los 30 minutos después de la cirugía. Las rodajas de próstata fueron fijadas en formaldehído al 4% durante 24 h, deshidratados, embebidos en parafina, se cortaron en 5 micras de grosor y se tiñeron con hematoxilina-eosina. La naturaleza de las muestras de tejido congelado (no maligno o maligno) se determinó por su ubicación en las secciones de todo el montaje, pero también verificada mediante el microscopio de luz de la sección de criostato hematoxilina /eosina manchados de cada una de las muestras de tejido analizadas como se describe a continuación . En estas secciones el porcentaje de tejido tumoral y se cuantificó el tumor GS determinado.
Preparación de tejidos y la extracción de RNA
áreas representativas de las metástasis óseas, PC principal y el tejido de la próstata no maligno fueron seccionada crio en tubos de extracción y el ARN se aisló utilizando el protocolo de Trizol (Invitrogen, Estocolmo, Suecia). El porcentaje de células tumorales en las muestras varió entre 25-95%. Las concentraciones de ARN se cuantificaron por medidas de absorbancia utilizando un espectrofotómetro (espectrofotómetro ND-1000; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). Se analizó la calidad del ARN con el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) y verificado para tener un número integridad del ARN ≥6.
tiempo real RT-PCR
dos cien (200) ng de ARN se invirtiera transcrito con transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) en un volumen total de 10 l. La amplificación PCR subsiguiente se realizó usando el Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las reacciones se realizaron en un volumen 20 l usando el IQ SYBR Green Supermix (laboratorios Bio-Rad). Se utilizaron los siguientes conjuntos de cebadores; ARfl: 5'-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 'y 5'-AGCTTCTGGGTTGTCTCCTCAGTGG-3', AR-V1: 5'-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 'y 5'-CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT-3', AR-V7: 5'-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 'y 5'-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3 ', y AR-V567es: 5'-CCAAGGCCTTGCCTGATTGC y 5'-TTGGGCACTTGCACAGAGAT-3', dando como resultado amplicones de 143, 145, respectivamente 125 pb, tal como se describe anteriormente [14], [16]. Los cebadores para la RPL13A limpieza de genes (5'-GTACGCTGTGAAGGCATCAA-3 'y 5'-GTTGGTGTTCATCCGCTTG-3') amplificaron un fragmento de 125 pb. Cada muestra se llevó a cabo por duplicado y se ajusta a los niveles Rpl13a correspondiente. Melting análisis de la curva confirmó los productos amplificados, que también se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar el tamaño esperado (datos no mostrados).
análisis de transferencia de Western
metástasis óseas fresco congelado y muestras de próstata fueron seccionadas crio y las proteínas se extrajeron de 20 secciones (10 micras cada una) utilizando el kit de AllPrep Mini, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce Chemical Co., IL, EE.UU.). 22RW1 células se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ATCC) y las proteínas se extrajeron como se describe anteriormente [18].
Las muestras (20 mg de proteína) se separaron por 7,5 SDS-PAGE en condiciones reductoras y, posteriormente, transferidos a membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Las membranas fueron teñidas con rojo Ponceau para confirmar la igualdad de carga de la muestra y de transferencia (resultados no mostrados). Las membranas se bloquearon a continuación en la leche 5%, seguido de incubaciones de anticuerpos anti-AR; N-20 (diluido 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o PG-21 (diluido 1:1000, Upstate, Lake Placid, NY) con el fin de detectar la ARfl y AR-Vs, y C-19 (Santa Cruz) con el fin de detectar ARfl pero no Ar-Vs que carecen de la LBD. Los anticuerpos primarios se diluyeron en 1% de leche /PBST y se incubaron en 4 ° C durante la noche. Se aplicó la IgG anti-conejo secundario (Dako, Glostrup, Dinamarca) anticuerpo (diluido 1:20 000 en 2,5% de leche) después del lavado con PBST y se incubó durante 1 h en RT. expresión de la proteína se visualizó después de un prolongado lavado usando el kit de detección avanzada ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y se cuantificó con un escáner ChemiDoc y la cantidad One 4 de software (Bio-Rad Laboratories).
La inmunohistoquímica
las metástasis óseas examinados en este estudio han sido inmunotinción previamente para la AR, Ki67 (proliferación celular), caspasa activado 3 (células apoptóticas) y antígenos de PSA (Tabla 2) siguiendo los protocolos descritos antes [3]. Nuclear inmunotinción PSA AR y citoplásmico se obtuvo de acuerdo con la intensidad (0, 1, 2, o 3) y la fracción de células teñidas (0, 1, 2, 3, o 4). Una puntuación total (que van desde 0-12) se obtiene multiplicando las puntuaciones de intensidad de tinción y fracciones. Una puntuación total de AR 8 o superior (mediana y superior) se definió previamente como alta y se encontró que estar asociada con una menor supervivencia después de la cirugía ortopédica metástasis de una puntuación total AR debajo de 8 [3]. Una puntuación de PSA de 8 y por debajo (mediana e inferior) se asoció con un resultado desfavorable en pacientes CRPC [3]. Las fracciones (%) de Ki67 y la caspasa 3 células tumorales teñidas activos se determinaron previamente y se encontró que no se relacionan con un desenlace de este material del paciente [3].
Análisis
La expresión génica
de doscientos cincuenta (250) ng de ARN total por muestra se utilizó para la producción de ARNc por el kit de amplificación de ARN Illumina TotalPrep (Ambion Inc, St. Austin, TX, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo previsto. Se evaluó la calidad de ARNc utilizando el kit de ARN 6000 Pico (Agilent Technologies) y el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Se utilizó un total de 750 ng de ARNc para la hibridación a un Illumina BeadChip gama de expresión génica HT12-v3 humana (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.), incluyendo sondas 48803 y 37846 genes anotados, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los arreglos fueron escaneadas y las señales de fluorescencia obtenidos utilizando el Illumina Bead matriz Reader (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). análisis de datos de la matriz se realizó con el software GenomeStudio (versión 2009.1, Illumina). Las muestras se normalizaron por el algoritmo spline cúbica y las sondas con todas las señales más bajas que el dos veces los niveles medios de base fueron excluidos del análisis. los genes expresados diferencialmente fueron identificados con la U de Mann-Whitney diferencial algoritmo de expresión (
P Hotel & lt; 0,05) y define para tener un factor de cambio en-entre los grupos de más de 1,5. Gene ontología análisis se realizó con el software MetaCore (GeneGoInc. St. Joseph, MI, EE.UU.).
El análisis estadístico
Las correlaciones entre variables se analizaron mediante el test de rangos de Spearman. Los grupos se compararon mediante la prueba de la U de Mann-Whitney para las variables continuas y la prueba de Chi-cuadrado para las variables categóricas. El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se realizó con la muerte del PC como evento y el tiempo de seguimiento como el tiempo entre la cirugía de metástasis y el último examen de seguimiento. Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales, el software SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU.). Un valor de p menor o igual a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Los altos niveles de mRNA de AR variantes de empalme en las metástasis óseas CRPC
Las transcripciones de la normal y ARfl los más abundantes variantes de corte y empalme AR conocidos hasta la fecha [16]; AR-V1, AR-V7, y AR-V567es, se detectaron y sus niveles cuantificados en partes de tejido no malignas y GS7-8 de tumores de próstata primarios y en metástasis óseas muestras, utilizando en tiempo real el análisis RT-PCR. Como se muestra en la Tabla 3, se detectaron el ARfl, AR-V1 y AR-V7 transcripciones en la mayor parte de la no maligno, tumor primario y metástasis muestras examinadas, mientras que la transcripción AR-V567es se detectó en 7 (23%) de las metástasis óseas CRPC solamente.
Hubo una tendencia para niveles más altos de ARfl, AR-V1 y AR-V7 mRNA en las metástasis óseas HN que en tejido PC primaria, pero las diferencias eran no significativo (Figura 1). Es evidente que los niveles de transcripción elevada ARfl, AR-V1 y AR-V7 sin embargo fueron vistos en las metástasis óseas CRPC, que mostraban 8, 44, respectivamente 120 veces los niveles más altos que la mediana de las metástasis (HN
P
El ≤0.001, la figura 1). El ARfl, AR-V1 y AR-V7 niveles de ARNm en las muestras de próstata no malignos fueron comparables a los niveles en los tumores de próstata primario (Figura 1).
Todos los niveles de mRNA se ajustaron para limpieza de genes correspondiente ( RPL13A) los niveles de ARNm, normalizados al valor de la mediana de las muestras de tumores primarios, y transformado por el logaritmo natural. Los niveles en el tejido de la próstata no maligno (
n
= 13), tumor de próstata primario (
n
= 13), las metástasis óseas hormonas ingenuo (
n = 10)
y metástasis óseas resistentes a la castración (
n
= 30) las muestras se muestran en blanco, gris claro, gris oscuro y negro, respectivamente. niveles indetectables no están indicados, pero representados por las columnas que simbolizan el nivel más bajo medible en el análisis de RT-PCR de cada variante de transcripción.
Expresión de variantes de la proteína AR LBD-truncada en las metástasis óseas CRPC
niveles de proteínas de AR-V fueron examinadas usando Western blot de 13 muestras de metástasis óseas CRPC seleccionados al azar para representar casos con altos niveles de AR-V7 de ARNm (niveles en el cuartil superior, Q4), los casos con niveles bajos e intermedios de AR-V7 mRNA (niveles en el más bajo; Q1, e intermedio; Q2-Q3, cuartiles, respectivamente), así como niveles detectables /no detectables de AR-V567es mRNA (Figura 2). La línea celular 22Rv1 conocido para expresar la variante AR-V7 [13], pero también variantes de empalme adicionales [15] sirvieron como control positivo. Una muestra de próstata primario con indetectable AR-V7 mRNA sirvió como un control negativo (Figura 2). Las bandas de proteína con los pesos previstos moleculares de aproximadamente 110 kDa (ARfl) y 80 kDa (presumingly AR-V1, AR-V7 o -V567es) se detectaron en las metástasis óseas CRPC, por los anticuerpos dirigidos al dominio N-terminal de la AR, mientras el 80 kDa AR-Vs no se detectaron utilizando el anticuerpo dirigido el dominio LBD C-terminal (Figura 2A). El más intenso 80 kDa bandas se detectaron en muestras con niveles de mRNA Q4 AR-V7, mientras que las metástasis óseas CRPC con niveles más bajos de ARNm de AR-V7 mostraron menor a niveles no detectables, independientemente de los correspondientes niveles de AR-V567es de ARNm (Figura 2B). Sobre la base de las intensidades blot, las proteínas variantes AR constituidas en la mediana de 32% del nivel de proteína ARfl (rango de 0 a 95%,
n
= 13, datos no mostrados). Esto estaba en contraste con las proporciones correspondientes en el nivel de ARN en las transcripciones AR-V7 y AR-V567 representados en la mediana de sólo el 0,4% (rango 0,03 a 7%, datos no mostrados) y 1,0% (intervalo de 0,3 a 1,2%, los datos no se muestra), respectivamente, del nivel de ARNm ARfl, de acuerdo a la diferencia en los niveles de CT RT-PCR. Nuestros resultados indican que la AR-V carece del dominio LBD son posibles post-transcripcionalmente estabilizó en las metástasis óseas CRPC en relación con el ARfl.
A) Anticuerpos (N-20 y PG-21) centradas en la N- dominio terminal (NTD) de la AR detecta las variantes ARfl y AR (AR-V; presumingly AR-V1, AR-V7, y /o AR-V567es). Anticuerpo C-19 dirigidas a la LBD detecta la ARfl de ~110 kDa, pero no las variantes truncadas AR-LBD de aproximadamente ~ 80 kDa. B) Análisis de las metástasis óseas CRPC que representan las muestras con altos niveles de AR-V7 ARNm (niveles en el cuartil más alto, Q4, de acuerdo con el análisis por RT-PCR), así como las muestras con niveles de AR-V7 mRNA en la Q1, Q2 y Q3, utilizando el anticuerpo N-20. 22Rv1 extracto de células sirvió como control positivo para ARfl y ~ 80 kDa variantes AR y una muestra de cáncer de próstata primario (P) sirvió como control negativo para las variantes de AR.
Expresión de AR-V7 y AR- V567es ARNm se asocia con un mal pronóstico
Las AR-V1, AR-V7, y ARNm ARfl niveles fueron correlacionados en todas las muestras examinadas (datos no mostrados,
n
= 66) y en el subgrupo de las metástasis óseas CRPC (AR-V1 vs AR-V7;
Rs
= 0,91, P
Restaurant & lt; 0,001, AR-V1 vs. ARfl;
Rs
= 0,47,
P Hotel & lt; 0,01, y AR-V7 vs ARfl;
Rs
= 0,58,
P Hotel & lt; 0,001,
n
= 30). Las metástasis óseas con AR-V567es detectable de ARNm tenían aproximadamente 3 veces más altos ARfl nivel de ARNm mediana que las otras metástasis (CRPC
P
= 0,004).
Los pacientes con niveles de ARNm de AR-V7 en Q4 tuvieron una supervivencia específica del cáncer significativamente más corto después de la cirugía metástasis que los otros pacientes CRPC y un resultado similar se observó para los pacientes con niveles detectables de la AR-V567es en comparación con el resto (Figura 3A-B). Diez pacientes con metástasis óseas CRPC fueron ya sea incluido en el Q4 sub-grupo AR-V7 y /o tenían niveles detectables de la AR-V567es, y se refieren además a tan altas pacientes AR-V. Los pacientes de alto AR-V tenían una mediana de supervivencia después de la cirugía de las metástasis sólo 2 meses, en comparación con 8 meses para el resto de los pacientes CRPC (Figura 3C). No se encontró asociación entre los niveles ARfl o la supervivencia después de la cirugía y la metástasis (datos no mostrados) AR-V1 ARNm.
Los pacientes con A) AR-V7 [14] niveles de mRNA en el cuartil más alto (Q4), B detectables) AR-V567es [16], los niveles de mRNA y C) detectable AR-V567 y /o Q4 AR-V7 (AR-V) de alto niveles de mRNA tuvieron una supervivencia más corta que otros pacientes con enfermedad CRPC.
metástasis con altos niveles de las variantes de corte y empalme AR muestran inmunotinción intensa AR nuclear
Como hemos encontrado previamente que las puntuaciones de inmunotinción alta AR se asociaron con una especial corta supervivencia después de la cirugía de las metástasis y ahora que AR-V pacientes de alto tenido un mal pronóstico, hemos querido examinar si la puntuación de tinción de alta AR se asoció con niveles de AR-Vs. Los altos metástasis AR-V todos tuvieron puntuaciones de tinción de alta AR en comparación con otras metástasis óseas CRPC que mostraron tinción variable, desde débil a fuerte (Tabla 2,
P
= 0,02).
Además , AR-V altos metástasis mostraron significativamente más baja puntuación de PSA inmunotinción (Tabla 2,
P = 0,038
) y las tendencias de tener mayores fracciones de la proliferación y apoptosis de células epiteliales tumorales (
P = 0,12 y
P
= 0,085, respectivamente) que otras metástasis CRPC (Tabla 2).
expresión de variantes de empalme AR se asocia con perturbadas
de control del ciclo celular
El perfil de expresión génica de el subgrupo de las metástasis óseas alta AR-V se comparó con el perfil de otras metástasis óseas CRPC, mediante el uso de una matriz de ADNc basada Illumina incluyendo 48803 sondas de genes. Se definieron unos 17700 sondas para dar señales por encima de fondo en las metástasis óseas PC. Ciento noventa y cinco (195) sondas fueron expresados diferencialmente entre las metástasis óseas alta AR-V y otras metástasis óseas CRPC de acuerdo con un factor de cambio de al menos 1,5 en-entre los grupos (
P Hotel & lt; 0,05) y se incluyen más en el análisis de la ontología para la evaluación de los procesos enriquecidos. Muchos (60) de los productos de los genes de diferenciación se propusieron estar interactuando directamente a través de la AR, C-MYC, y las proteínas CDK1 (Figura 4 y en la Tabla S1). C-MYC y CDK1 son dos reguladores clave del ciclo celular y, en consecuencia, los 5 mejores redes de procesos enriquecidos encuentran en las metástasis AR-V de alta óseos fueron; Core ciclo celular, ciclo celular en fase S, la mitosis del ciclo celular, citoesqueleto microtúbulos del huso y el ciclo celular G2-M. C-MYC y CDK1 son también factores pro-supervivencia que inhiben la apoptosis y, además, se halló una mayor niveles de transcripción de las proteínas anti-apoptóticas y survivin BCL2L12 en el AR-V alto en comparación con las otras metástasis óseas CRPC (Figura 4). Notablemente, sin embargo, los niveles de otros reguladores clave de la apoptosis, tales como receptores de muerte, BAX, BCL2, y caspasas se no cambiaron de manera significativa y, por otra parte, las redes de proceso relacionados con la apoptosis no fueron significativamente enriquecido en nuestros datos (datos no mostrados). Varias transcripciones de genes que se sabe están regulados positivamente por el AR se encontraron en niveles altos en los altos metástasis AR-V, tales como CDK1, ciclina A2, HSP27, C-MYC, UGT2B17, CDC20, UBE2C, mientras que otros como KLK3 (PSA) , KLK2, Nkx3-1, FKBP5 y TMPRSS2 no eran (Figura 4).
los círculos rojos indican una mayor y círculos azules indican bajos niveles de transcripción en la AR-V alta que en otras metástasis óseas CRPC. Tenga en cuenta que muchos de los productos de los genes que diferencian están interactuando directamente a través de AR, C-MYC y CDK1.
Discusión
Este documento describe, por primera vez, el patrón de expresión de la truncado-LBD de empalme AR variantes AR-V1, AR-V7 [14] y AR-V567es [16] en las metástasis óseas de PC en los pacientes y, por otra parte, que los niveles de las variantes se incrementan en las metástasis óseas CRPC y que la expresión de la AR -V567es y /o niveles muy altos de la AR-V7 se encuentran en las personas con mal pronóstico en particular.
Varios estructuralmente diferentes, constitutivamente activa AR-V han sido identificados hasta ahora en muestras clínicas de PC [10], [11], [13], [14], [16], [17], y que aquí mostramos el enriquecimiento de variantes de corte y empalme AR LBD-truncada en las metástasis óseas PC. En contraste con el Sol y los compañeros de trabajo, que encontraron la AR-V567es sea la variante de empalme más abundante examinado [16], encontramos la AR-V7 para ser expresado con mayor frecuencia a los AR-V567es en CRPC. Esta disparidad podría ser explicado técnicamente por diferentes sensibilidades de las técnicas de RT-PCR utilizados, pero posiblemente también podría reflejar las heterogeneidades en la expresión de la variante AR empalme entre diferentes orígenes tisulares como hemos examinado CRPC en el hueso mientras que Sun et al incluyó CRPC de varios sitios. También hemos tomado nota importante es que varias de las metástasis óseas CRPC examinados (AR-V casos de alto) expresaron LBD-truncado proteínas AR a niveles comparables a los niveles de proteína ARfl, a pesar de las correspondientes transcripciones variantes AR se encuentran en niveles relativamente mucho más bajos que la ARNm ARfl. Una estabilización post-transcripcional de AR variantes de corte y empalme en relación con el ARfl en las metástasis óseas CRPC selectivos pensar, por tanto, aunque el mecanismo de esto no se conoce.
El mal pronóstico de los pacientes con metástasis CRPC que expresa la AR- V567es y /o altos niveles de transcripciones AR-V7 están probablemente relacionados con la actividad constitutiva postulado de estas variantes. El AR-V567es contiene la secuencia de núcleo de localización (NLS) de la región de bisagra en el exón 4 [16] y de la AR-V7, en contraste con AR-V1, se han postulado para contener una NLS en su críptico exón [14]. En consecuencia, el AR-V7 y AR-V567es se ha demostrado que trasladar en el núcleo, se unen a elementos de respuesta a AR, y activar /reprimir la transcripción de genes
in vitro
sin la necesidad de la unión del ligando [14], [ ,,,0],16], [17]. Curiosamente, Watson y compañero de trabajo mostraron recientemente un aumento inmediato de los niveles de AR-V7 y AR-V1 de ARNm en modelos de xenoinjerto de PC después de la castración, así como una disminución después de la suplementación de andrógenos, lo que indica que algunos AR-Vs puede ser regulada directamente por andrógenos y por lo tanto probablemente inducen en los pacientes poco después de la terapia de la castración [17]. Es tentador especular que esos y otros AR-Vs será seleccionado para también durante el desarrollo de la enfermedad resistente a la castración y contribuir así a la recaída de las terapias dirigidas a reducir los niveles de esteroides o la unión del ligando a la AR normal. En consecuencia, hemos encontrado niveles más altos de las variantes de corte y empalme en AR CRPC que en las metástasis óseas HN. Sin embargo, las transcripciones AR-V1 y AR-V7 se detectaron también en una parte sustancial de las piezas de prostatectomía radical no malignos y malignos, aunque a un nivel más bajo que en las metástasis óseas, y otros han demostrado que los niveles de AR-V7 ( AR3) en los tumores de próstata primarios eran previsibles para el resultado después de la prostatectomía radical, con un menor tiempo de recaída química en individuos con niveles más altos [13], [14]. La razón de esto no se conoce, pero indica que constitutivamente activa AR-Vs podría ser parte de la fisiología normal de la próstata y que una selección de las variantes se produce durante la progresión del PC.
El enriquecimiento de estructuralmente diferentes, constitutivamente activa AR-Vs durante el desarrollo de metástasis CRPC señala eventos moleculares complejas y heterogéneas que por diferencia significa parece asegurar la activación AR en ausencia de andrógenos testiculares. Los pacientes que expresan constitutivamente activa AR-VS en el largo plazo probablemente no beneficiarse de las terapias anti-andrógenos con el objetivo de reducir la síntesis de esteroides, tales como la castración quirúrgica, los análogos de la LHRH, o la abiraterona agente de reciente introducción que inhibe la síntesis de CYP17 y por lo tanto de esteroides no sólo en los testículos, pero también en las glándulas suprarrenales y en el tejido del tumor [19], [20]. Sorprendentemente, la novela AR antagonista MDV3100 la orientación del LBD de la ARfl y actualmente en ensayos clínicos para CRPC [21], [22] se encontró que inhiben el crecimiento resistente a la castración inducida por la expresión de constitutiva AR-V7 en un modelo animal para PC [17]. Esto es alentador, como antagonistas de AR novela inhibir la translocación del receptor en el núcleo por lo tanto puede tener efectos terapéuticos también en pacientes que expresan constitutivamente activa AR-Vs. No todos los pacientes CRPC embargo no responden a los fármacos y abiraterona MDV3100, e incluso aquellos que no recaen posteriormente dentro de unos meses [20], [22]. Si este tipo de resistencia a la terapia está relacionada con la expresión de constitutivamente activa AR-V en las metástasis óseas (el principal objetivo de la terapia) Actualmente no se conoce y no se puede determinar hasta que los estudios clínicos empieza a incluir las biopsias de las metástasis óseas. Además, los agentes terapéuticos que inhiben los que sus efectos corriente abajo AR-V o necesitan ser desarrollados [23], [24]. Otra posible explicación para la resistencia a la terapia de la castración es la presencia de células tumorales negativas AR, AR y por lo tanto de derivación durante la progresión del tumor [25]. falta total de AR expresión se encuentra sólo en una pequeña subpoblación de las metástasis óseas CRPC, pero AR células tumorales negativas dispersas entre los aspectos positivos se encuentran en la mayoría de las metástasis CRPC hueso [3], y por lo tanto el énfasis en la necesidad también para terapias no depender solamente en un AR funcional.
en las muestras clínicas analizadas en el presente estudio, los niveles detectables de la AR-V567es y /o altos niveles de las transcripciones AR-V7 se asociaron con niveles de genes desregulados AR-controlado conocidos , pero específicamente no de algunos de andrógenos genes regulados clásicos como KLK3 (PSA), TMPRSS2, y FKBP5 que fueron inducidos por la sobre expresión de AR-V7 o AR-V567es en LNCaP células
in vitro
[14] , [dieciséis]. En consecuencia, los casos de alto AR-V mostraron menos inmunotinción PSA que otras metástasis CRPC. En su lugar encontramos los niveles de transcripción de genes que diferenciaban las metástasis óseas alta AR-V de otras metástasis óseas CRPC indicando alta actividad de c-myc y CDK1 y un control del ciclo celular alterado con respecto G1-S, así como la transición G2-M a pesar de no aumento significativo en el etiquetado Ki67. El desarrollo de CRPC se ha caracterizado por una proliferación no balanceada a la proporción de apoptosis y la resistencia a los estímulos apoptóticos [26], [27]. En la última etapa de la enfermedad examinados en este estudio, sin embargo no lo hicimos, con unas pocas excepciones, han encontrado signos claros de alteración de la expresión de los genes reguladores de la apoptosis o una mayor desregulación del proceso de apoptosis en AR-V alta en comparación con otros metástasis óseas CRPC. En base a los datos, no somos capaces de discriminar si el control del ciclo celular alterado que se encuentra en las metástasis ósea elevada AR-V está realmente relacionada con la expresión de la AR-Vs, el ARfl, o simplemente asociada con la enfermedad particularmente avanzada en aquellos casos CRPC.