Extracto
La resistencia al tratamiento con progestina es un obstáculo importante en el tratamiento del cáncer de endometrio avanzado y recurrente. La fenretinida es un retinoide sintético que se ha evaluado en ensayos clínicos como un agente terapéutico y quimio-preventivo del cáncer. Fenretinida se ha establecido para ser citotóxico para muchos tipos de células cancerosas. En el presente estudio, hemos demostrado que la fenretinida disminución de la viabilidad celular y la apoptosis inducida en células Ishikawa, que son una línea celular de cáncer de endometrio, en función de la dosis de
in vitro
. Este efecto
se encontró que era
independiente de la vía de señalización de receptores nucleares de ácido retinoico.
Más
, hemos demostrado que esta inducción de la apoptosis por fenretinida puede ser causada por aumento de la captación a través de retinol Stra6. El silenciamiento de Stra6 demostró que disminuye la apoptosis que fue inhibida por desmontables expresión de Stra6 en las células de Ishikawa. Los resultados de un
in vivo
estudio demostró que las inyecciones intraperitoneales de fenretinida en los tumores de cáncer de endometrio (creados utilizando células de Ishikawa) en ratones inhibió el crecimiento del tumor de manera efectiva. La inmunohistoquímica de tumores de ratones mostró una disminución en la expresión de Ki67 y un aumento en exfoliados caspasa-3 tinción después del tratamiento fenretinida en comparación con ratones tratados con vehículo. En conjunto, nuestros resultados son los primeros en establecer la eficacia de fenretinida como agente antitumoral para el cáncer de endometrio tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
, proporcionando una razón valiosa para iniciar más estudios preclínicos y los ensayos clínicos utilizando fenretinida para el tratamiento de cáncer de endometrio
Visto: N. Mittal, Malpani S, M Dyson, Ono M, Coon JS, Kim JJ, et al. (2014) La fenretinida: Un nuevo tratamiento para el cáncer endometrial. PLoS ONE 9 (10): e110410. doi: 10.1371 /journal.pone.0110410
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Febrero, 2014; Aceptado: September 15, 2014; Publicado: 23 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Mittal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Estos estudios fueron apoyados por generosos fondos de John y Diane O'Donnell (a la División de Ginecología Oncología, NU) y la División de Biología Reproductiva, NU. Los estudios también fueron apoyados por K12HD050121 y el Premio desarrollo de la carrera ASRM que se otorgó a María Elena Pavone. Centro de soporte Grant (NCI CA060553) se utilizó para incrustar, seccionamiento y tinción de los tejidos tumorales. NU Fondo para imágenes de células fue generosamente apoyada por el NCI CA060553 CCSG P30 que fue galardonado con el Centro Integral del Cáncer de Robert H Lurie
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción.
el cáncer de endometrio es el cáncer ginecológico más frecuente en los Estados Unidos, con un estimado de 49,560 nuevos casos y 8.190 - muertes que se producen en el año 2013 [1]. La probabilidad de una hembra ser diagnosticado con este cáncer durante su vida es de aproximadamente uno de cada 38 [2]. La incidencia de esta enfermedad órgano reproductor se ha incrementado en un promedio de 1.1% por año desde 2004 hasta 2008 y las tasas de mortalidad también han aumentado en un promedio de 0,3% por entre 1998 y 2007 [3]. La cirugía, la quimioterapia y la radioterapia son tres principales enfoques establecidos para el tratamiento de carcinoma endometrial [4], [5]. La extirpación quirúrgica del útero resultado terapia adyuvante y en un mayor que 90% de cada cinco años la tasa de supervivencia. La recurrencia debido a la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia presenta otro reto importante para los profesionales de la salud. Por lo tanto, es de suma importancia para identificar tratamientos nuevos y efectivos para el cáncer de endometrio.
Clínicamente, las progestinas, incluyendo Megace (acetato de megestrol) se han utilizado para el tratamiento de tumores malignos de endometrio debido al efecto antagonista de la progesterona en acción de los estrógenos . Las progestinas se utilizan como agentes primarios para el tratamiento de la enfermedad avanzada o recurrente, los que no son buenos candidatos para la cirugía y en las mujeres más jóvenes que desean preservar su fertilidad en el futuro. Una respuesta completa se puede lograr cuando se utiliza la terapia de progesterona en mujeres con hiperplasia endometrial y adenocarcinoma de endometrio bien diferenciado; sin embargo, la eficacia de la terapia de progestina cae con un aumento de la gravedad de la enfermedad. Además, las recurrencias pueden presentarse una terapia de progesterona se detiene [6], [7].
En busca de agente terapéutico dirigido contra el cáncer de endometrio, anterior
in vitro
estudios de nuestro laboratorio demostradas marcados inhibición de la proliferación de cáncer de línea celular Ishikawa endometrial por el ácido retinoico (RA) y el compuesto AM580 agonista RA [8]. Sin embargo, su uso clínico ha sido, hasta ahora, limitada por su perfil de efectos secundarios desfavorables [9]. RA y sus derivados (ya sea compuestos naturales o sintéticos) tienen un papel reconocido en la regulación del crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis. RA tiene el potencial para el tratamiento y la prevención de tipos de cáncer [10], [11]. Retinol (la forma dominante de los retinoides en el cuerpo humano) debe ser convertido en ácido retinoico para mostrar su actividad biológica. La fuente primaria de la AR es la dieta de vitamina A, que se recoge en el intestino y empaquetado como ésteres de retinilo en el hígado. Estos ésteres de retinilo se secretan en la circulación unido a proteína de unión a retinol (RBP) y posteriormente se toman en las células a través de
Stra6
(Estimulado por RA 6), un receptor de superficie celular crucial para RBP [12]. Anteriormente, nuestro laboratorio ha mostrado que Stra6 es el principal regulador de la absorción de retinol en el endometrio y que la disminución de expresión de este gen en la endometriosis puede contribuir a la disminución de hidroxiesteroide (17-beta) dehidrogenasa expresión 2 (HSD17β2) mRNA [13], lo que lleva a niveles persistentemente elevados de estradiol. También hemos demostrado que los retinoides disminuyen la producción de estrógeno mediante la inducción de la expresión HSD17β2 en células de Ishikawa endometriales [14].
Stra6 es el principal receptor de la superficie celular responsable de la absorción de retinol. Una vez dentro de la célula, el retinol se puede oxidar a la RA más biológicamente activa de las alcohol deshidrogenasas. RA se dirige entonces desde el citoplasma a receptores específicos de la hormona nuclear RA (RARs) y los receptores retinoides X (RXRs) por dos proteínas portadoras intra-citoplásmicos, específicamente celular proteína de unión a RA 2 (CRABP2) y ácido graso de la proteína 5 de unión (FABP5 ) [15]. Por último, el RA no utilizada es metabolizado y eliminado fuera de las células por la familia CYP26 de enzimas [16].
[retinamida N-4-hidroxifenil (4-HPR)] fenretinida, un derivado sintético de todo-trans ácido retinoico tiene la capacidad de iniciar la apoptosis de células incluso en líneas celulares resistentes a ATRA con el beneficio añadido de tener un perfil de efectos secundarios de menor importancia. Los estudios en humanos han encontrado que los efectos secundarios importantes incluyen la adaptación a la oscuridad disminuidos de los ojos, la piel y las mucosas sequedad, prurito, urticaria, molestias gastrointestinales y la alteración de las superficies oculares. Estos efectos secundarios son relativamente frecuentes, pero leves. Como tal, se perfila como uno de los agentes antitumorales más prometedores [17]. Los estudios han demostrado que la fenretinida puede inducir la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer humano
in vitro
[18] - [23]. Clínicamente, fenretinida se ha utilizado tanto como un agente quimiopreventivo en mama [24], de la vejiga [25] y de la mucosa oral, cáncer [26], y como un agente quimioterapéutico en pediátricos [27], tipos de cáncer [28] y adultos [29] - [31]. El mecanismo de acción de fenretinida la muerte celular inducida aún no ha sido completamente dilucidado. Sin embargo, se ha propuesto que sus efectos inhibidores pueden ser mediados por tanto el ácido retinoico dependiente del receptor y los mecanismos -independiente [17].
El presente estudio investigó el potencial terapéutico de fenretinida como agente antitumoral, así como su potencial mecanismo de acción contra el cáncer de endometrio tanto
in vitro
y
in vivo.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Northwestern Cuidado de animales y el empleo Comisión.
células de cáncer endometrial Cultura y
líneas de células del epitelio endometrial Ishikawa (una especie de regalo del Dr. Masato hospital Nacional Nishida Kasumigaura , Tsuchiura, Ibaraki, Japón) se obtuvieron a partir de células humanas malignas endometriales epiteliales [32]. Ishikawa células se cultivaron en monocapas a 37 ° C, 5% CO2 incubadora en una mezcla de DMEM y F12 (01:01) medio con suero al 5% fetal bovino (FBS), piruvato sódico 1% y 1% de penicilina-estreptomicina, higromicina solución de antibióticos (Life Technologies, Grand Island, Nueva York).
pequeños ARN de interferencia (siRNA) desmontables
Ishikawa células fueron cultivadas a aproximadamente el 80% de confluencia, a continuación, transfectadas con un ARNsi de control negativo nontargeting (siCTL) o siRNAs contra Stra6 (Life Technologies) a 30 nM de concentración utilizando Lipofectamine RNAiMAX de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). Las células transfectadas se trataron con DMSO o 6 fenretinida mu M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) solución 60 horas después de la transfección. Las células se recogieron después de 24 horas de tratamiento y se procesaron para PCR en tiempo real o transferencia Western.
viabilidad de las células de ensayo
Prestoblue (Life Technologies) reactivo viabilidad celular se utilizó para estimar la viabilidad celular. Prestoblue es un resazurina - solución permeable membrana base que después de la reducción, se convierte en resorufina, un compuesto fluorescente de color rojo que puede ser medido cuantitativamente para determinar la viabilidad celular [33]. Se sembraron células de Ishikawa (5 × 10
3 células por pocillo) en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas a 37 ° C. Después las células se privaron de suero durante 16-18 horas [34], [35]. Las células fueron cultivadas en medio fresco y se trataron con diferentes concentraciones de fenretinida y acetato de megestrol (Sigma-Aldrich) durante 24 horas a 37 ° C. La citotoxicidad de fenretinida y acetato de megestrol se midió añadiendo el reactivo Prestoblue de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la señal de fluorescencia para determinar la viabilidad celular en el lector de placas Synergy HT de Bio-Tek con el software KC4 3,4 a 530/590 nm.
Western blot
Ishikawa células fueron tratadas con diferentes concentraciones de fenretinida y acetato de megestrol (Sigma-Aldrich) o vehículo, se lisaron en RIPA [Tris 50 mM, pH 8.0,150 mM de cloruro de sodio, 1,0% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sodio ) suplementado con inhibidores de proteasa y de fosfatasa (Sigma-Aldrich). lisados claras se obtuvieron después de centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos, y la concentración de proteína se midió usando el kit Micro BCA (Thermo Scientific, Rockford, Illinois). Las proteínas se resolvieron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida en NOVEX NuPAGE 4-12% Bis-Tris geles (Life Technologies) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% no grasa durante una hora a temperatura ambiente y se hibridaron con anticuerpos primarios específicos para PARP escindido total y [poli (ADP-ribosa) polimerasa], caspasa-9 & amp; exfoliados caspasa-9 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) durante la noche a 4 ° C. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un reactivo de quimioluminiscencia kit de detección ECL Super Señal West Femto (Thermo Scientific) después de la hibridación con una peroxidasa de rábano picante de cabra conjugado con anti-anticuerpo secundario de conejo (Cell Signaling Technology). Las membranas fueron despojados con Restaurar Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) y se sondaron con beta-actina (β-actina) de anticuerpos (Sigma-Aldrich) para el control de la carga de proteínas.
PCR en tiempo real
ARN total fue aislado de las células de Ishikawa utilizando Quiagen RNAeasy Kit (Quiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La pureza y la concentración de ARN extraído se determinaron utilizando el ND-1000 Espectrofotómetro (NanoDrop). 1 g de ARN se transcribe inversa con el súper mezcla de ADNc Q-script (Quanta Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con el ABI 7900 de detección de secuencias y los sistemas de expresión de genes ABI Poder Syber verdes (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El ARNm se cuantificó usando cebadores específicos disponibles en el mercado a Stra6, CRBP1, cyp26a1, CRABP2, FABP5, RAR-α, RAR-β, y RXR-α (Quiagen) y la limpieza gen GAPDH (Integrated DNA Technologies, Chicago, IL). El cambio veces en la expresión se calculó utilizando el método ΔΔCt [36] con GAPDH como control interno. Las PCR se realizaron en un ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durante 40 ciclos (95ºC durante 15 s, 60ºC durante 1 minuto) después de 10 minutos de incubación a 95 ° C.
xenoinjerto de ratón modelo
CD-1 ratones desnudos atímicos hembra (4-5 semanas de edad, Charles River Laboratories International Inc., Wilmington, MA) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos con base en los lineamientos establecidos por la Universidad de Northwestern, institucional Cuidado de Animales y el empleo. Los ratones fueron ovariectomizadas, y, una pastilla de estradiol (1,7 mg /pastilla, liberación 60 días) (Innovative Research of America, Sarasota, Florida) se implantó por vía subcutánea. células de cáncer de células de la línea de Ishikawa endometriales humanas (2 x 10
6 /0,1 ml) se suspendieron en PBS 01:01 /Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California) y se inyecta por vía subcutánea en ambos flancos derecho e izquierdo de cada ratón los tumores se dejaron crecer y una vez que los tumores alcanzaron 50 a 150 mm
3 (que se produjo en aproximadamente 2 semanas), los ratones se dividieron en 4 grupos: 1. vehículo, 2. acetato de megestrol, 3 fenretinida (Tocris Bioscience, Bristol , Reino Unido) y acetato de megestrol fenretinida +. pellets de megestrol actate (21 mg, de liberación de 21 días para 1 mg /día) (Innovative Research of America) se implantaron subcutáneamente. Los ratones recibieron 120 mg /kg de fenretinida en un volumen de 10 ml /kg de peso corporal, 5 veces a la semana durante 3 semanas a través de inyección intraperitoneal. Los ratones de control fueron tratados de manera similar con i.p. inyecciones de etanol al 5% en solución de cloruro sódico al 0,9% que contiene 1,65 mg /ml de albúmina de suero bovino. No hubo evidencia de toxicidad local o sistémica después de la inyección i.p. el tratamiento con la dosis administrada [37] (Fig. S2). Los ratones se pesaron y tamaños de los tumores se midieron con calibres dos veces a la semana durante todo el curso del tratamiento. Los ratones fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 y se resecaron los tumores. Los tejidos tumorales de los ratones se pesaron, a continuación, incrustado en un bloque de parafina y se sometieron a inmunohistoquímica o hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula:.
Donde "a" es el más corto de los dos ejes perpendiculares [35]
La inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en formol, embebidos en parafina y se cortaron secciones de tejido de 4 micras. Después de-paraffinization de secciones de tejido, la recuperación de antígeno inducida por calor se realizó en un tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) con 0,05% de Tween (Sigma) durante 20 min en una olla a presión. Los portaobjetos se dejaron enfriar durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron en TBS-T durante 5 minutos. El kit Dako EnVision HRP IHC se utilizó (Dako América del Norte, Inc., Carpinteria, CA). La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno (3%) durante 10 minutos seguido de 2 lavados de TBS-T durante 10 minutos. Para Ki67 immunolabelling, sitios de unión no específicos se bloquearon con el bloque de la proteína, y las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo primario Ki67 (Dako) durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. a continuación, el anticuerpo secundario anti-ratón se aplicó a las secciones de tejido durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó en TBS-T dos veces durante 5 minutos. Para la caspasa-3 escindido, las proteínas no específicas se bloquearon utilizando 5% de suero normal de burro, se incubaron con exfoliados caspasa-3 (Cell Signaling Technology) durante la noche, se siguió a continuación un protocolo de kit ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). solución de DAB se utilizó para desarrollar color, y hematoxilina de Mayer se utilizó para contrateñir las secciones. El hidróxido de amonio 28% se utilizó como un reactivo de azulado. Las secciones se deshidrataron a través de 2 cambios de 95% de etanol, 2 cambios de 100% de etanol, y 3 cambios de xileno, y luego montadas en cubierta se desliza usando Cytoseal XYL medios de montaje (Richard-Allan Scientific). Los portaobjetos se visualizaron utilizando Zeiss en posición vertical AXIO TissueFAXS versión 3.5.5120.120 alcance (TissueGnostics GmbH, Viena, Austria).
El análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se expresan como valores medios ± error estándar, y diferencias significativas se determinaron por ANOVA de una vía utilizando GraphPad Prism6. Un valor de probabilidad de
P
. & Lt; 0,05 se utilizó como criterio de significación estadística
Resultados
fenretinida disminuye la viabilidad celular y aumenta la apoptosis de las células de cáncer de Ishikawa endometriales
in-vitro
El tratamiento de las células de Ishikawa con fenretinida viabilidad celular significativamente inhibido y aumento de la apoptosis de una manera dependiente de la dosis (figura 1A & amp; 1D). Fenretinida en 6 a 20 M causó una disminución de 38% a 99%, respectivamente, en la viabilidad celular y el aumento de la apoptosis, como es evidente por los aumentos en los niveles de proteína de la caspasa escindido -9 y escindido con PARP en comparación con las células tratadas con vehículo. Fenretinida se encontró que era tóxico para las células a dosis superiores a 2 M de concentración después de 24 horas de tratamiento (datos no mostrados). Con el fin de determinar los efectos de Megace, Ishikawa células se trataron con Megace solo a diferentes concentraciones y en combinación con fenretinida durante 24 horas y la viabilidad celular & amp; Se evaluó la apoptosis. Megace no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular y la apoptosis Ishikawa hasta 10 M, individualmente y en combinación con 6 M de fenretinida (Figura 1B, 1C & amp; 1E). Estos resultados sugieren que la fenretinida reduce la viabilidad celular e induce la apoptosis en células de Ishikawa
in vitro
lo que es un candidato prometedor para probar su eficacia
in vivo
.
Ishikawa las células fueron tratadas con DMSO (Veh), (a) 2-20μM fenretinida, (B) Megace 0.1-10μM o (C) una combinación de Megace + fenretinida durante 24 h y la viabilidad celular se midió utilizando el reactivo Prestoblue. Los datos se presentan como factor de cambio en unidades relativas de fluorescencia de las muestras tratadas DMSO y representan la media ± SEM de 4-5 experimentos independientes. Un asterisco indica una disminución significativa (*
P
& lt; 0,05) disminución de la viabilidad celular en las células Ishikawa tratados con fenretinida en comparación con el grupo tratado con DMSO. (D) las células de Ishikawa se trataron con DMSO (Veh) o fenretinida 1-10μM que indujo apoptosis de una manera dependiente de la dosis dentro de las 24 h de tratamiento como se demuestra por el aumento de la caspasa-9 escindido y los niveles de proteína PARP escindido con por Western Blot. (E) El tratamiento de las células de Ishikawa con Megace no tenía ningún efecto en estos marcadores de la apoptosis. Actina se utilizó como control de carga. Las transferencias son representativos de 3 experimentos independientes.
fenretinida ejerce un aumento en la absorción de retinol a través de Stra6 y CRBP1
Para determinar el efecto de fenretinida en el ácido retinoico vía de señalización en el cáncer de endometrio, tiempo real RT PCR se llevó a cabo. Los niveles de ARNm de Stra6, CRBP1 y cyp26a1 aumentaron significativamente con el tratamiento fenretinida [Fig.2 (A-C)]. El mRNA de estos genes se mantuvo sin cambios con el tratamiento Megace solo o en combinación con fenretinida [Fig.3 (A-C]. Sin embargo, fenretinida no tiene ningún efecto sobre los niveles de ARNm de genes de receptores nucleares (RAR-alfa, RAR-beta , α RXR-), o las proteínas portadoras intra-citoplásmicos CRABP2 y FABP5 (Figura S1).
el ARN total fue aislado de las células tratadas con DMSO Ishikawa (Veh) o fenretinida 0.25-10μM durante 24 h y la expresión de genes implicados en la absorción de retinol se midió mediante RT-qPCR. los datos se presentan como el cambio veces en la expresión de ARNm relativo de las células tratadas de fenretinida a partir de células muestras DMSO tratados y representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. un asterisco indica una disminución significativa ( *
P
& lt; 0,05) aumento de la expresión mRNA de (a) Stra6, (B) CRBP1 y (C) genes cyp26a1 en Ishikawa células tratadas con fenretinida en comparación con el grupo tratado DMSO
ARN total fue aislado de las células de Ishikawa tratados con DMSO (vehículo), Megace, fenretinida y una combinación de Megace y fenretinida ambos. ARNm expresiones relativas de (A) Stra6, CRBP1 (B) y cyp26a1 (C) se analizaron con RT-qPCR. Los datos se presentan como factor de cambio en las expresiones relativas de ARNm de muestras tratadas DMSO y representan la media ± SEM de 5 experimentos independientes. Un asterisco indica una disminución significativa (*
P
& lt; 0,05). Aumento de la expresión mRNA de estos genes en células de Ishikawa tratados con fenretinida o células Megace + fenretinida en comparación con células tratadas DMSO
Stra6 desmontables influencias fenretinida mediadas apoptosis en células de Ishikawa endometriales
Stra6 es el receptor de retinol superficie de la célula primaria en las células responsables de la absorción de retinol. Para establecer si Stra6 es esencial para la apoptosis inducida en células Ishikawa fenretinida, la expresión endógena Stra6 fue derribado mediante siRNA. Como se muestra en la Fig. 4A, hemos sido capaces de derribo significativamente (76%) la expresión de Stra6 en las células de Ishikawa. Desmontables de Stra6 abroga la apoptosis inducida en células fenretinida Ishikawa (Fig. 4B) como se muestra por niveles disminuidos de la caspasa-9 escindido y se escindió PARP cuando se silencia Stra6. Estos resultados apoyan firmemente la hipótesis de que Stra6 es crucial para la apoptosis inducida fenretinida en las células de Ishikawa endometriales.
Ishikawa células fueron transfectadas con 30 nM siCTL (nontargeting control negativo siRNA) o siSTRA6. (A) ARN total fue aislado de las células de Ishikawa no tratados a los 3 días consecutivos de después de la transfección y la expresión del gen Stra6 se midió mediante RT-qPCR. Los datos se presentan como factor de cambio en la expresión del ARNm relativa de Stra6 en las células transfectadas siSTRA6 y células transfectadas siCTL y representan la media ± SEM de 5 experimentos independientes. Un asterisco indica una diferencia significativa (*
P Hotel & lt; 0,05) disminución de la expresión de ARNm de Stra6. (B) Las células transfectadas de Ishikawa se trataron con DMSO (Veh) o fenretinida 6 micras por 24 h después y se realizó la inmunotransferencia para marcadores de apoptosis. la expresión del gen Stra6 caída apoptosis inducida fenretinida inhibida en las células Ishikawa como se ha demostrado por la disminución en los niveles de proteína de la caspasa-9 escindido y se escindió-PARP. Las transferencias son representativos de 3 experimentos independientes
fenretinida inhibe la progresión del tumor:. Un modelo de ratón con xenoinjerto
inicial
in vitro
observaciones sugieren que la actividad anticancerígena de fenretinida pudiera derivarse de su potencial para promover la apoptosis en las células tumorales. Para examinar esta actividad antitumoral de fenretinida
in vivo
, los ratones fueron injertados con tumores subcutáneos. fenretinida tratamiento suprimió significativamente la progresión del tumor en ratones en comparación con los ratones tratados con vehículo (Figura 5B) en base a veces el cambio en el tamaño del tumor. Las disminuciones en el volumen del tumor también fueron significativos en Megace tratada así como Megace + fenretinida tratado (Figura 5B) en comparación con los ratones tratados con vehículo. Por otra parte, los ratones parecían tolerar tratamientos fenretinida y Megace sin síntomas aparentes de toxicidad o pérdida grave de peso corporal en comparación con el grupo tratado con vehículo (Figura S2).
(A) se inyectaron ratones CD-1 hembra desnudos ovariectomizados con células Ishikawa, tanto en los flancos y pellets de estrógeno fueron implantados. Los tumores se dejaron crecer durante 2 semanas. Después de 2 semanas de establecimiento del tumor, los ratones se trataron con vehículo (20 ratones), Megace (19 ratones), fenretinida (21 ratones) o Megace + fenretinida (20 ratones) y los tumores se recogieron después de 3 semanas de tratamiento. (B) Las imágenes de los tumores extirpados representativos de cada grupo. (C) El factor de cambio en el volumen del tumor (de tratamiento durante el día 1 hasta el día del sacrificio) de vehículo, fenretinde, meagce o se representó tanto fenretinida + ratones tratados megace después de 3 semanas de tratamiento. Los datos se muestran como medias ± min a max de dos experimentos diferentes. Los valores P indican una inhibición significativa por fenretinida, Megace o Megace + fenretinida tanto sobre el crecimiento tumoral (* P & lt; 0,05). La mayor disminución en el tamaño del tumor se observó en los ratones tratados con fenretinida solo.
El tratamiento con fenretinida disminuye la proliferación y aumenta la apoptosis en los tumores de ratones
El efecto de la fenretinida sobre la proliferación celular y apoptosis se evaluó por inmunohistoquímica y H & amp; e tinción de secciones de tumor endometrial Ishikawa después de 3 semanas de tratamiento. (Figura 6). La proliferación de las células, medida por los niveles de proteína Ki67, disminuyó con el tratamiento fenretinida. Los niveles de exfoliados caspasa-3 (un marcador de apoptosis), fueron insignificantes en los tumores de los ratones tratados con vehículo, mientras que más de tinción era evidente en los tumores de los ratones tratados con fenretinida. Tomados en conjunto, estos datos indican que el desarrollo de tumores Ishikawa fue suprimida por fenretinida a través de su capacidad para inhibir la proliferación celular y aumento de la apoptosis de las células de Ishikawa tanto
in-vitro
& amp;
in vivo
.
tumores extirpados fueron fijadas en formalina, incluidos en parafina y se seccionaron. (A) H & amp; E tinción y la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-Ki67 (marcador de proliferación) y la caspasa -3 (marcador de apoptosis) de las secciones enteras de xenoinjertos de tumores anti-troceados. (B) Las imágenes están en 100
μ
m.
Discusión
La fenretinida ya ha demostrado ser una alternativa terapéutica eficaz en la quimioprevención y de mama y de ovario tipos de cáncer [17]. El presente estudio demuestra el uso de fenretinida como un posible agente antitumoral contra el cáncer de endometrio utilizando tanto
in vitro
y
in vivo estudios
. Fenretinida disminuyó cáncer endometrial Ishikawa viabilidad celular humana mediante la inducción de la apoptosis como se demuestra por un aumento de los marcadores de muerte celular (exfoliados caspasa-9 y se escindió PARP). Es crecimiento del tumor también inhibió
in vivo
, como se ve por una disminución en la proliferación celular (Ki67) y un aumento en la apoptosis (exfoliados caspasa-3) en xenoinjertos de ratones tumorales. Además, hemos demostrado que los efectos antitumorales de fenretinida están mediados por un aumento en la absorción de retinol, con un aumento de la expresión de Stra6 visto en las células tratadas fenretinida.
Recientemente, estudios realizados por Carrera et al han demostrado el papel de Stra6 en p53 mediada por las respuestas de muerte celular en células normales y cancerosas, lo que es similar a nuestros resultados de la investigación y se encontró que ser independiente de la activación de aguas abajo de los objetivos de la AR [38]. Ellos demostraron que la transfección con Stra6 indujo una cantidad sustancial de la apoptosis en células RA sensibles de ovario cáncer (específicamente PA-1 y A1847), así como en células de cáncer de colon HCT116 insensible con AR. Además, los autores encontraron que Stra6 transfección indujo tanto un supresor pro-apoptótica y tumor afecta. Estos hallazgos, junto con los resultados de nuestro estudio, sugieren que la inducción Stra6 puede tener un papel potencial en la supresión tumoral.
La literatura anterior sugiere una interacción en el éxito del tratamiento de las células de cáncer con fármacos quimioterapéuticos y su potencial para desencadenar las vías de apoptosis. Todavía no está claro si los efectos biológicos de los agentes quimioterapéuticos están mediadas por una interacción directa con los receptores de retinoides nucleares o a través de nuevas vías independientes del receptor nuclear [39]. Se encontró que el tratamiento de las células de Ishikawa con fenretinida resultó en la apoptosis celular a través de la inducción de la caspasa-9, caspasa -3 y PARP. La inducción de estas vías de apoptosis también se ha visto en el cáncer de mama [17] y el cáncer de ovario [40]. Curiosamente, un estudio de prevención del cáncer de mama en fase III en mujeres premenopáusicas ha demostrado que el tratamiento con fenretinida disminuyó la incidencia de tumores malignos de mama y cáncer de ovario segundo [41]
.
A diferencia de nuestro estudio, otros estudios han demostrado que análogos de la AR también pueden actuar mediante la activación de receptores nucleares. En concreto, la proliferación de las células de Ishikawa se redujo y se indujo la apoptosis a través de la señalización de la AR que implica la activación de RAR /RXR [8].
Las progestinas han sido utilizados en las mujeres en edad reproductiva que desean preservar su fertilidad, así como en avanzada y recurrentes casos de cáncer de endometrio que no se pueden tratar con agentes contra el cáncer, sin embargo, 30% o más pacientes con cáncer de endometrio muestran resistencia a las terapias hormonales, que limitan el uso de la terapia de progestina [42]. En el presente estudio, megace por sí sola no indujo ningún apoptosis en nuestro modelo de cáncer de endometrio, ni se potencia la actividad antitumoral de fenretinida
in vitro
o
in vivo
.
las limitaciones del presente estudio son el uso de un único modelo de ratón y el uso de Ishikawa células endometriales cultivadas en lugar de las células de cáncer de endometrio primarias. El uso de cultivo primario es difícil debido a la incapacidad para hacer crecer células de cáncer primario sin factores del estroma. Se necesitan más estudios para establecer la capacidad antitumoral de fenretinida en diferentes líneas celulares de cáncer de endometrio y modelos de ratón del tumor.
En conclusión, hemos demostrado que la fenretinida disminuye la viabilidad celular, aumenta la apoptosis, y provoca una disminución en el tamaño del tumor. Creemos que fenretinida indujo apoptosis debido a un aumento en la absorción de retinol, específicamente mediante el aumento de la expresión del gen de Stra6. Creemos que este estudio está entre los primeros en demostrar que fenretinida tiene un potencial antitumoral contra el cáncer de endometrio. Creemos que son necesarios futuros ensayos preclínicos y clínicos para validar su potencial como un nuevo candidato terapéutico posible para el tratamiento del cáncer de endometrio.
Apoyo a la Información
Figura S1.
tratamiento de las células de Ishikawa con fenretinida en 0,25-10
μ
concentraciones M durante 24 h no alteraron la expresión de los genes del receptor nuclear de ácido retinoico. Los datos son representativos de las medias ± error estándar de tres experimentos diferentes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0110410.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Tratamientos con cualquiera de fenretinida o Megace no tienen efecto sobre los pesos corporales ratón. Los pesos corporales se midieron a partir de vehículo tratada o grupos de ratones tratados con el fármaco de dos veces por semana durante todo el experimento escarcha
doi:. 10.1371 /journal.pone.0110410.s002 gratis (TIF)