Extracto
Antecedentes
Los actos de fosfatasa PTEN en el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato resultante de la activación de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). expresión PTEN se ha demostrado que la disminución en el cáncer colorrectal. Poco se sabe, sin embargo en cuanto a la función celular específica de PTEN en las células epiteliales intestinales humanas. El objetivo de este estudio fue investigar el papel de PTEN en células de cáncer colorrectal humano.
Metodología /Principales conclusiones
Caco-2/15, las células HCT116 y CT26 fueron infectadas con lentivirus recombinantes que expresan un shRNA diseñada específicamente para knock-down PTEN. El impacto de PTEN regulación a la baja se analizó en la polarización celular y la diferenciación, la integridad de unión intercelular (expresión de proteínas de adhesión célula-célula, la función de barrera), la migración (ensayo de la herida), la invasión (transwells matrigel recubierto) y en la formación de tumores y metástasis en ratones . análisis de microscopía electrónica mostró que la infección lentiviral de PTEN shRNA inhibe significativamente Caco-2/15 la polarización celular, la diferenciación funcional y el desarrollo del borde en cepillo. Una fuerte reducción de claudin 1, 3, 4 y 8 también se observó, así como una disminución en la resistencia transepitelial. La pérdida de expresión de PTEN aumenta la difusión, las capacidades de migración y la invasión de células de cáncer colorrectal
in vitro
. PTEN downregulation también aumentó el tamaño del tumor después de la inyección subcutánea de células de cáncer colorrectal en ratones desnudos. Por último, la pérdida de la expresión de PTEN en HCT116 y CT26, pero no en células Caco-2/15, condujo a un aumento de su potencial metastásico después de las inyecciones de la cola de la vena en ratones.
Conclusiones /Importancia
En conjunto, estos resultados indican que el PTEN controla la polaridad celular, establecimiento de uniones célula-célula, la permeabilidad paracelular, la migración y el potencial tumorigénico /metastásica de las células de cáncer colorrectal humano
Visto:. Langlois MJ, Bergeron S, G Bernatchez , Boudreau F, Saucier C, Perreault N, et al. (2010) La fosfatasa PTEN Controles epitelial intestinal polaridad celular y la función de barrera: Su papel en la progresión del cáncer colorrectal. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10.1371 /journal.pone.0015742
Editor: Cuelgue Thi Thu Nguyen, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 31 Agosto, 2010; Aceptado 22 de noviembre de 2010; Publicado: December 23, 2010
Derechos de Autor © 2010 Langlois et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por los Institutos canadienses de Investigación en Salud (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82942) y MT-14405 (a NR). N. R. es un receptor de una Cátedra de Investigación de Canadá en la señalización y Digestivo Fisiopatología. J. C., C. S. y F.B. son estudiosos del Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S. B. es un beneficiario de una beca post-doctoral de la Asociación Canadiense de Gastroenterología /CIHR /CCFC. N. R., J. C., C. S., N.P., y F.B. son miembros de la FRSQ financiado por el "Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. Una característica distintiva del cáncer colorrectal es la pérdida de la organización celular. El grado histológico de carcinomas colorrectales es una variable de pronóstico importante y depende del grado de diferenciación glandular y polaridad celular. De alto grado, las neoplasias colorrectales pobremente diferenciados son por lo general más agresivo que su bajo grado, homólogos bien diferenciados [1].
En las células epiteliales, la adhesión célula-célula y la polaridad apical-basal se mantiene a través de la formación de varios sistemas de adhesión intercelular tales como uniones estrechas (TJs). El TJ regula la difusión paracelular y funcionalmente segrega la membrana plasmática en dos compartimentos, que es un requisito para la plena polarización de las células epiteliales [2]. Las células neoplásicas con frecuencia exhiben deficiencias estructurales y funcionales en ambas uniones estrechas y adherentes [3] - [5]. Tal como fue revisado por Martin y Jiang [4], la expresión de muchas proteínas de unión estrecha se disregulated en los cánceres colorrectales. La unión adherente proteína E-cadherina también se ve disminuida en los cánceres colorrectales invasivos [6]. Además, el patrón de expresión de hDlg y hScribble, conocido para controlar el establecimiento de la polaridad apical-basal en las células epiteliales [7], notablemente cambia durante la progresión del tumor colorrectal con baja regulación de ambas proteínas están asociados con la falta de la polaridad celular epitelial y desorganizado arquitectura de los tejidos [8].
Fosfoinosítidos también han surgido en los últimos años como determinantes generales tanto de la polaridad y la identidad de varias membranas. Los datos recientes indican que PtdIns (4,5) P2 es un factor determinante de la superficie apical de las células epiteliales [9]. De hecho, en las células no polarizado MDCK, ambos PtdIns (4,5) P2 y PtdIns (3,4,5) P3 colocalize en célula-célula y los contactos célula-matriz extracelular. Sin embargo, durante las primeras etapas de la polarización, PtdIns (4,5) P2 se convierte en su mayor parte se concentra en la membrana apical de las células mientras que PtdIns (3,4,5) P3 se mantiene localizado en la membrana basolateral y excluidos de la membrana apical. La fosfatasa PTEN lípidos se localiza en el dominio apical y es esencial para la segregación de PtdIns (4,5) P2 a la superficie apical debido a su acción desfosforilante en el grupo D3-fosfato de PtdIns (3,4,5) P3 [10 ]. Además, PTEN actúa como un regulador negativo de la fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) vía de señalización /Akt y se ha demostrado que influyen en muchos procesos desregulados en la tumorigénesis tales como la proliferación, la supervivencia celular, la migración y la invasión [11], [12] .
PTEN es codificada por el
fosfatasa y tensina suprimido homólogo en el cromosoma 10 gratis (
PTEN
) gen supresor de tumores, que es el segundo gen mutado con mayor frecuencia en los cánceres humanos después de
TP53
[12]. Además, la pérdida de PTEN inmunotinción en el cáncer colorrectal tejidos se ha asociado con la enfermedad avanzada, la metástasis de hígado y pobre supervivencia de los pacientes [13] - [16], lo que sugiere su potencial papel de protección contra la progresión de la carcinogénesis colorrectal humano. Desde PTEN controla la polaridad en las células epiteliales normales, se podría especular que la pérdida de esta proteína puede ser suficiente para desencadenar la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un evento temprano crítico en la invasión y la metástasis de muchos tipos de cáncer, incluyendo CRC. En estudios anteriores, los efectos de la pérdida de PTEN principalmente se han medido en líneas celulares de cáncer que albergan otros numerosos transformadora y mutaciones oncogénicas y que han perdido su fenotipo epitelial [17] - [19]. Ese enfoque ha hecho que sea difícil determinar qué fenotipos son conferidas directamente por la pérdida de PTEN y para definir las etapas de la tumorigénesis que se altera específicamente en las células con la pérdida de PTEN. Para caracterizar aún más la relación entre la pérdida de PTEN, pérdida de la polaridad y la progresión del cáncer colorrectal, se utilizó la línea celular Caco-2/15 derivado de un adenocarcinoma colorrectal humano relativamente bien diferenciado. Este clon del padre línea celular Caco-2 se ha caracterizado en gran medida por su capacidad para llevar a cabo un proceso intestinal morfológica y funcional completa del epitelio diferenciación que se lleva a cabo de forma espontánea una vez que se ha alcanzado la confluencia y que se completa después de 15-20 días de post-confluencia . Más específicamente, estas células colónicas forman complejos de unión apretados y adherentes apicales y forman una monocapa polarizada después de varios días de post-confluencia, exhibiendo resistencia eléctrica transepitelial (TEER) similar a
in vivo
observaciones [20] - [22 ]. También se analizaron las siguientes líneas celulares de CRC "de" diferenciados: la HCT116, una línea celular humana CRC-microsatélite inestable y CT26, un colon metastásico línea celular de carcinoma de ratón. Los resultados muestran que PTEN puede actuar como una barrera para el desarrollo del cáncer mediante el control de la polaridad celular, el establecimiento de uniones célula-célula, la permeabilidad paracelular, la migración y el potencial metastásico de células de cáncer colorrectal humano.
Materiales y métodos
material y anticuerpos
Los anticuerpos para la detección de PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) y HNF4α (C-19) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos generados contra la E-cadherina y vellosidades eran de BD Biosciences (Mississauga, ON, Canadá). Los anticuerpos para la detección de fosfo-AKT (Ser473) y AKT eran de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). El anticuerpo β-actina fue de Chemicon (Temecula, CA). La ocludina, claudins y los anticuerpos ZO-1 eran todos de Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). El anticuerpo monoclonal HSI-14 contra sacarasa-isomaltasa fue proporcionado amablemente por el Dr. Andrea Quaroni (Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York). inmunotransferencia CDX2 se realizó con un anticuerpo policlonal de conejo contra CDX2 caracterizado previamente [23]. Todos los demás materiales se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Oakville, ON) a menos que se indique lo contrario
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de colon Tres fueron utilizados en el presente estudio:.
1-La línea celular de adenocarcinoma de colon Caco-2/15 se obtuvo a partir de A. Quaroni (Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York). Esta línea celular proporciona un modelo único y bien caracterizado para el estudio de la diferenciación del epitelio intestinal ya que estas células experimentan diferenciación morfológica y funcional a un fenotipo enterocito con microvellosidades, la formación de cúpula, y la expresión de sacarasa-isomaltasa varios días después de alcanzar la confluencia [20] - [22]. Estas células expresan truncados
APC mutado Opiniones y
p53
pero exhiben de tipo salvaje
K-Ras
,
β-catenina Opiniones y reparación de genes (MMR) proteínas; por lo tanto son de microsatélites estables (MSS) [24], [25]. Estas células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen ™) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS). Se obtuvieron 2- Las células HCT116 de la ATCC (CCL-247). Estas células crecen en multi-capas y son incapaces de polarización o la diferenciación del epitelio intestinal [20]. Estas células son deficientes en hMLH1, expresar de tipo salvaje
p53
, de tipo salvaje
APC
y llevar a la activación
K-Ras
,
pi3kca
, y
β-catenina
mutaciones [26]. Estas células son metastásico [27], [28] que nos permite analizar el impacto de la pérdida de PTEN de expresión en etapas avanzadas de cáncer colorrectal. Estas células se cultivaron en medio de McCoy (Wisent, St-Bruno, Québec, Canadá) que contiene 10% de FBS. 3- células CT26 (amablemente proporcionados por el Pr Nicole Beauchemin, Universidad McGill, Canadá) se obtuvieron a partir de un adenocarcinoma indiferenciado murino que fue inducida por la inyección rectal de
N
-nitroso-
N
-methylurethane en ratones Balb /c. Estas células llevan a la activación
K-Ras
mutaciones [29], de tipo salvaje
p53 Opiniones y no expresan E-cadherina o ZO-1 [30]. células CT26 se mantuvieron en medio RPMI (Invitrogen ™) que contiene 10% de FBS y penicilina-estreptomicina.
Construcciones de plásmidos y lentivirus producción
El vector lentiviral expresión shRNA (pLenti6-U6) se construyó como se descrito anteriormente [31]. oligonucleótidos ShRNA contra PTEN humana fueron diseñados según las directrices de Ambion (Boletín Técnico#506) utilizando el siRNA secuencias gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (# 2), gccagctaaaggtgaagatat (# 3) con TTCAAGAGA como la secuencia de bucle. Los productos de oligonucleótidos recocidos se subclonaron en pLenti6-U6 entre el
Bam HI y
Xho
sitios. Un irrelevante PLENTI-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) o una mutado PLENTI-shPTEN (shMUT) se utilizó como control negativo. El mutado plenti-shPTEN fue generada por el cambio de 3 nucleótidos en la secuencia del shRNA más eficaz contra PTEN (# 2), resultando en la secuencia de siRNA gcacaagataacctagatttc. El shRNA contra la forma murina de PTEN (TRCN0000028992) y un control correspondiente shRNA (shTGFP) contra TurboGFP ™ (SHC004) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Los lentivirus producidos en las células 293T se utilizaron para la infección de células de acuerdo a las recomendaciones de Invitrogen (ViraPower Lentiviral sistema de expresión). No inducción de
OAS1
la expresión de genes se detectó por análisis de Q-PCR en los experimentos que implicaban la infección lentivirus (datos no mostrados).
OAS1 gratis (2050-sintetasa oligoadenilato) es un gen diana interferón clásico y ha sido recomendado como una prueba clave para la inducción de interferón antes de atribuir una respuesta particular al gen diana [32].
Proteína extracción y análisis de Western blot se realizaron
extracciones de proteínas y Western blot como se describe anteriormente [22].
microscopía electrónica de Transmisión
Las muestras se procesaron tal como se describe anteriormente [22] y observado en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-7500.
microscopía electrónica de barrido
El Caco-2/15 células se sembraron en pequeña láminas de 12 mm de diámetro y se fijaron como se ha descrito anteriormente para microscopía electrónica de transmisión [22] hasta la etapa de deshidratación en etanol. Las muestras fueron entonces el punto crítico se secó con CO
2 y cubierto con oro-paladio con un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica. células recubiertas se observaron posteriormente con un microscopio electrónico de barrido JEOL (modelo: JSM-840).
Determinación de la resistencia eléctrica transepitelial
Caco-2/15 células se sembraron en placas Transwell® membranas permeables ( Corning, Acton, MA). TEER se midió 3 y 9 días después de que las células habían alcanzado confluencia con un epitelial Voltommeter (Instrumento World Precision, Modelo Evom-G).
análisis de ARN
ARN total aislamiento, RT-PCR y Q-PCR se realizó como se describió anteriormente [31]. de expresión diana se cuantificó relativamente a la expresión PDGB. Los cebadores para cada gen fueron diseñados en el exón-exón cruces utilizando el software Primer3 [33]. Primer secuencias y condiciones de PCR-Q están disponibles bajo petición.
Migración ensayos
Los ensayos se realizaron según la técnica afilada cuchilla de afeitar como se informó anteriormente [34].
los ensayos de actividad Cdc42 y Rac
GTP niveles de Rac y Cdc42 se analizaron con un kit de ensayo de activación de la bioquímica G-LISA (citoesqueleto, Denver, CO) según las instrucciones del fabricante.
ensayos de invasión
invasión ensayos se realizaron con BD BioCoat Matrigel ™ ™ invasión cámaras con filtros polycarbonated 8 mm (BD Biosciences). Las células se sembraron en medios sin suero en presencia de hidroxiurea 2 mM, un inhibidor farmacológico de la reductasa de ribonucleósido celular para detener el ciclo celular en G1 /S fase [35]. Los medios que contienen 20% de FBS se utilizó como quimioatrayente. Después de una incubación de 48 h a 37 ° C, las células no invasivas se eliminaron de acuerdo con el procedimiento del fabricante y las células invasoras se fijaron con metanol al 100%. Las células fueron teñidas de violeta cristal al 1%.
Los modelos animales
ratones desnudos hembra CD1
nu /nu Opiniones y ratones Fox Chase SCID beige fueron adquiridos de Charles River (Wilmington , MA). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Sherbrooke.
El crecimiento del tumor
: Un total de 2 × 10
se inyectaron 6 células suspendidas en 100 l de DMEM en el tejido subcutáneo dorsal de ratones hembra de 5 semanas de edad CD1
nu /nu
. Los ratones fueron sacrificados después de 42 días después de la inyección de células Caco-2/15 y 30 días después de la inyección de HCT116. Los tumores se extirparon y se pesaron.
ensayos experimentales vena de la cola:
La cola-vena de 5 semanas de edad, hembras CD1
nu /nu
o ratones Fox Chase SCID beige se inyectó con 10
6 Caco-2 /15, HCT116 o células CT26 en suspensión en 100 l DMEM. Los animales fueron sacrificados a cualquier signo de sufrimiento respiratorio o pérdida de peso, o después de 14 días después de la inyección de las células CT26, 75 y 35 días después de la inyección para inyectar HCT116, respectivamente, en el CD1
nu /nu Opiniones y Fox Chase SCID beige ratones y 60 días después de la inyección de 2-Caco /15 células inyectadas en ratones Fox Chase SCID beige. Los pulmones se mantuvieron en fijador de Bouin durante 24 h. lóbulos individuales se separaron a continuación y se determinó el número total de metástasis visible en la superficie.
tumores humanos
Las muestras de cáncer de colon y los tejidos de colon normales emparejados (al menos 10 cm de la tumor) tiene ha obtenido de los pacientes sometidos a resección quirúrgica. Los pacientes que no recibieron quimioterapia neoadyuvante o radioterapia. Los tejidos se obtuvieron después de consentimiento informado por escrito del paciente, de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de Revisión del Centro Hospitalario Universitario de Sherbrooke Seres Humanos Institucional. informaciones clínicas y patológicas se obtuvieron de los registros médicos. Las muestras fueron adenoma irresecable endoscópicamente y se define como avanzada debido a su mayor tamaño de 1 cm o por la presencia de displasia de alto grado o componente velloso. cáncer de los pacientes se clasifican histológicamente y se clasificaron de acuerdo con los criterios generales de estadificación TNM (basados en tumor-, la linfa y Nodo- Metastatic- de estado). Todos los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido dentro de los 15 minutos de la resección según lo recomendado por el tumor canadiense Repositorio de red (www.ctrnet.ca). Para la extracción de proteínas, tejidos emparejados se lisaron en tampón de muestra de Triton (NaCl 100 mM, EDTA 5 mM [pH 8,0], 50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1% de Triton X-100, 5% de glicerol, PMSF 1 mM, ortovanadato 0,2 mM, 40 mM β-glicerofosfato, mM NaF 50, y 2% de cóctel inhibidor de la proteasa [P 8340, Sigma-Aldrich]) y a inmunotransferencia tal como se describe anteriormente [22].
presentación de datos
Los resultados típicos se muestran son representativos de 3 experimentos independientes. Las estadísticas se calcularon utilizando Student de dos colas t-test. Las diferencias se consideraron significativas con p = 0.05 * *** o p≤0.005. Los análisis densitométricos se realizaron utilizando el software Image J.
Resultados
PTEN controla la polarización de las células epiteliales del colon y la diferenciación
Para investigar el impacto de la pérdida de PTEN de expresión en la diferenciación y polarización de células de cáncer colorrectal, lentivirus recombinantes que codifican los ARN de horquilla corta (shRNAs) fueron desarrolladas primero con el fin de suprimir de manera estable los niveles de ARNm de PTEN en Caco-2/15 células. Varias construcciones lentiviral fueron probados por su capacidad de knock-down PTEN. El shRNA más eficiente fue designado shPTEN (datos no mostrados). /15 células Caco-2 se infectaron en adelante con lentivirus shPTEN o con lentivirus shGFP irrelevantes o lentivirus que expresan un shPTEN con 3 nucleótidos no coincide (shMUT) como controles negativos. El vector lentiviral pLenti6-U6, que coexpresa un gen de resistencia a blasticidina S, permitió la selección de poblaciones puras de células transducidas dentro de los 7 días. Como se muestra en la Figura 1A, los niveles de proteína PTEN estaban casi completamente derribado-en-2 Caco /15 células que expresan el shPTEN (& gt; 90%); esta reducción se mantuvo durante la post-confluencia. De nota, PTEN baja regulación también se asoció con un aumento de la fosforilación de AKT, el principal efector aguas abajo de PI3K, lo que confirma que la vía PI3K se activó en shPTEN-células que expresan.
Caco-2/15 células eran infectadas o bien con lentivirus recombinante que codifica un shRNA que golpea hacia abajo específicamente PTEN (shPTEN) o un control negativo shRNAs (shGFP o shMUT). A y C. Después de la selección de las células infectadas, las células Caco-2/15 se lisaron a -2, 0, 3, 6, 9 y 12 días después de la confluencia. Las proteínas se analizaron entonces mediante transferencia Western. B. paneles Izquierda: recientemente confluentes Caco-2/15 células que expresan shGFP o shPTEN fueron observadas por microscopía óptica. Barras de escala = 100 m. paneles Media: recientemente confluentes /15 células que expresan shGFP o shPTEN 2 Caco-se fijaron y se observaron por microscopía electrónica de transmisión. Barras de escala = 2 m. paneles de la derecha: células que expresan shGFP o shPTEN recientemente confluentes se observaron por microscopía electrónica de barrido. Las barras de escala = 1 m.
Para analizar si PTEN tiene un impacto en las células Caco-2/15 polarización de las células, la morfología celular se examinó en primer lugar en diferentes días de la confluencia. Como se observa por microscopía óptica, il superficie celular se incrementó significativamente por 5,3 veces (p & lt; 0,005 analizados por software Metamorph) en células recién confluentes Caco-2/15 que expresan shPTEN en comparación con las células control (Figura 1B, paneles de la izquierda). Además, el análisis de microscopía electrónica de transmisión mostró que las células de control recientemente confluentes ya habían comenzado a polarizar mientras que las células PTEN-deficientes aún se mantiene una apariencia aplanada (Figura 1B, los del centro). A los 3 días posteriores a la confluencia, las células con expresión de PTEN Reducido sólo comenzaron a polarizar mientras que las células de control que ya habían adquirido su forma cilíndrica (datos no mostrados). Baja regulación de PTEN también dio lugar a una disminución del número de microvellosidades en la membrana apical de células como se observa por microscopía electrónica de barrido (Figura 1B, paneles de la derecha). Es de destacar que los niveles de expresión de los marcadores de diferenciación funcional de sacarasa-isomaltasa y Villin también disminuyeron notablemente en las células PTEN-empobrecido (Figura 1C).
A continuación verificamos si PTEN silenciamiento altera la expresión de factores nucleares de hepatocitos 1a ( HNF1α) y 4 (HNF4α), así como factor relacionado caudal-homeobox de transcripción 2 (Cdx2) que se sabe que el control intestinal diferenciación de células epiteliales [36]. Como se muestra en la Figura 1C, mientras que los niveles de expresión de HNF4α se redujeron ligeramente en confluente PTEN-deficientes Caco-2/15 células, expresión de HNF1α y Cdx2 se redujo notablemente (Figura 1C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que PTEN es importante para la polarización de las células epiteliales, así como la diferenciación funcional y morfológica de las células epiteliales intestinales. Es de destacar que no parece que estos efectos son una consecuencia indirecta de la alteración en la proliferación celular ya 2-Caco /15 células que expresan shPTEN exhibieron la misma tasa de proliferación de las células de control y detenga a proliferar tan pronto como llegó a la confluencia (datos no mostrados) .
PTEN baja regulación perjudica la integridad de las uniones estrechas en las células epiteliales del colon
Desde uniones intercelulares son reguladores de la polaridad celular [2], [5], el próximo verificado si la expresión de shPTEN tenía un efecto en uniones celulares. Bajo el microscopio electrónico de transmisión, las uniones adherentes apareció inalterada (Figura 2A, flechas) en células Caco-2/15 células PTEN-deficientes, mientras que las uniones estrechas parecían menos organizada a los 3 días posteriores a la confluencia (Figura 2A, soportes). Como cuestión de hecho, la masa no estructurada de las proteínas se observó sistemáticamente sin apretar de la membrana en la posición habitual de uniones estrechas. En consecuencia, la función de barrera de las uniones estrechas también se vio comprometida como lo demuestra la disminución de la TEER medida en células que expresan shPTEN en comparación con las células control a los 3 y 9 días después de la confluencia (Figura 2B). Con el fin de obtener una mayor comprensión de la manera en que PTEN controla la integridad de la unión, los niveles de expresión de varias proteínas de unión clave como ocludina, [2] se analizaron ZO-1 y claudinas. Expresión de proteínas de claudins 1, 3, 4 y 8 se redujo significativamente tanto en las células shPTEN post-confluentes (Figura 2C) y subconfluentes. Es de destacar que la expresión de la proteína de unión adherente E-cadherina también se atenuó en células shPTEN post-confluentes (Figura 2C).
A. las células Caco-2/15 que expresan shMUT o shPTEN se fijaron después de 3 días después de la confluencia y se observaron por microscopía electrónica de transmisión. Barras de escala = 500 nm. Las flechas indican las uniones adherentes, mientras que entre paréntesis indican las uniones estrechas. B. /15 células se cultivan en membranas porosas 2 Caco-después de lo cual la resistencia transepitelial se midió por triplicado de 3 y 9 días después de que las células alcanzaron la confluencia. *** Significativamente diferente al p≤0.005 (prueba t de Student). /15 células que expresan shGFP o shPTEN C. 2-Caco se lisaron a -2, 0, 3, 6, 9 y 12 días después de la confluencia seguida de Western blot de las proteínas de unión.
Pérdida de la expresión de PTEN en 2-Caco /15 células estimula la migración /invasión, promueve el crecimiento del tumor, pero no es suficiente para conferir potencial metastásico
in vivo
La pérdida de las uniones intercelulares es bien conocido por estar asociado con el aumento de las capacidades de migración celular y la invasión [4]. Además, PTEN se ha demostrado que controlar tales procesos en otros tipos de células [11]. Utilizando los ensayos de cierre de heridas, la migración de las células de control recién confluentes se comparó con la de las poblaciones shPTEN expresan. Como se muestra en la Figura 3A, la capacidad de shPTEN-expresión de 2-Caco /15 células para migrar fue notablemente mayor en comparación con las células de control, tal como se determina mediante la medición de la superficie relativa cubierto por la migración de células. También se observó que la baja regulación de PTEN estimulado notablemente Caco-2/15 desprendimiento de las células después de tripsinización (datos no mostrados). Estos datos indican que el silenciamiento del gen PTEN transcripción en células CRC mejora su capacidad de propagación y migrar. Desde PTEN se ha demostrado que influyen en la migración a través de la activación de las pequeñas GTPasas Rac1 y Cdc42 [37], el próximo analizó si su respectiva expresión y la actividad se vio afectada por la pérdida de la expresión de PTEN. Como se muestra en la Figura 3B, tanto Rac y Cdc42 muestran niveles más altos unido a GTP en subconfluentes y confluente células shPTEN expresan en comparación con las células de control.
A. paneles de la izquierda: La morfología celular se analizó mediante microscopía de contraste de fase en subconfluencia. paneles de la derecha: las células confluentes que expresan establemente recién shMUT o shPTEN resultaron heridos y fueron tratados con hidroxiurea 2 mM. Después de 48 h, el movimiento de la hoja coherente en todo el margen de la herida lineal (línea blanca) se evaluó mediante microscopía de contraste de fase. El gráfico de la derecha ilustra el área relativa cubierta por la migración de células como se evaluó en 5 diferentes experimentos herida por condición utilizando el software Image J. Barras de escala = 100 m. B. niveles de Rac activado unido a GTP o Cdc42 se analizaron con los kits de activación bioquímica de ensayo G-LISA en subconfluentes (SC) y recién confluentes (C) Caco-2/15 células. C. La invasión de las células se estudió usando Transwells recubiertos con Matrigel. Después de 48 h, se fijaron las células invasoras, se tiñeron con violeta cristal al 1% y se contaron. D. Subconfluent shMUT y shPTEN que expresan las células Caco-2/15 células se lisaron y el ARN total aislado de la expresión de genes analizados por Q-PCR. El nivel relativo de cada ARN se calculó utilizando el método de la curva estándar y se normalizaron a la correspondiente nivel de ARN PDGB. E. 2 × 10
6 proliferación de células Caco-2/15 células que expresan shMUT o shPTEN se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos 5 por condición. El peso del tumor se evaluó 42 días después de la inyección. * P = 0.05, *** p≤0.005, diferencias estadísticas determinaron mediante la prueba t de Student.
El efecto de la deficiencia de PTEN en la invasión También se determinó a través de cámaras de invasión de Matrigel BD Biocoat. Como se muestra en la Figura 3C, Caco-2/15 células que expresan el shPTEN aumento de las capacidades invasivas claramente expuestas en comparación con células shMUT expresan. Invasion no sólo implica ruptura de uniones célula-célula y aumento de la motilidad de las células tumorales, sino también la proteolisis focal de la matriz extracelular. Como se muestra en la figura 3D, Q-PCR análisis revelaron que los niveles de expresión de metaloproteinasas de la matriz 2 y 9 (MMP2 y MMP9), osteopontina (OPN) y UPA (de tipo activador del plasminógeno uroquinasa) fueron significativamente hasta reguladas en shPTEN expresan Caco- 2/15 células.
la tumorigenicidad de Caco-2/15 poblaciones de células se evaluó inmediatamente siguiente a la inyección subcutánea en el flanco de ratones desnudos. Como se muestra en la Figura 3E, la baja regulación de la expresión de PTEN en las células Caco-2/15 células aumentaron en gran medida su capacidad de inducir tumores in vivo.
Finalmente, se investigó si la reducción de PTEN en 2-Caco /15 células es suficiente para inducir metástasis tumoral
in vivo
, mediante el uso de ensayo de vena de la cola de metástasis experimental. ratones Fox Chase SCID beige inyectados con control o PTEN deficientes en Caco-2/15 células en la vena de la cola no desarrollaron metástasis incluso a los 60 días después de la inyección (datos no presentados), lo que indica que PTEN regulación a la baja no es suficiente para conferir un potencial metastásico CRC a las células bien diferenciadas.
La pérdida de expresión de PTEN estimula la migración /invasión, aumenta el crecimiento tumoral e induce potencial metastásico de células HCT116
in vivo
El impacto de PTEN silenciamiento también se evaluó en la línea celular dediferenciado microsatélite inestable HCT116. En estas células, PTEN silenciamiento también dio lugar a una mayor capacidad mejorada fosfo-Akt (Figura 4A), tanto de la migración después de la lesión (Figura 4B) y la invasión (Figura 4C), además de estar asociado con un aumento significativo en la actividad de Rac (1,5 -fold, p & lt; 0,005) y la expresión de OPN (1,9 veces, p & lt; 0,005) (datos no mostrados). Es de destacar que los niveles de expresión de MMP-2, MMP-9 y UPA en células HCT116 de control ya estaban marcadamente elevados y PTEN silenciamiento no mejoran aún más los niveles de mRNA de estas moléculas (datos no mostrados). La tumorigenicidad de las poblaciones de células HCT116 también se evaluó después de la inyección subcutánea en el flanco de ratones desnudos. Como se muestra en la figura 4D, la baja regulación de la expresión de PTEN en las células HCT116 aumentó su capacidad de inducir tumores
in vivo
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A. células HCT116 se infectaron o bien con lentivirus recombinante que codifican shMUT o shPTEN. Después de la selección de las células infectadas, se lisaron las células en proliferación y expresión de proteínas se analizó mediante transferencia de Western. B. izquierda paneles: La morfología celular se analizó por microscopía de contraste de fase en subconfluencia. paneles de la derecha: las células confluentes recientemente resultaron heridos y fueron tratados con hidroxiurea 2 mM. Después de 48 h, el movimiento de la hoja coherente en todo el margen de la herida lineal (línea blanca) se evaluó mediante microscopía de contraste de fase. El gráfico de la derecha ilustra el área relativa cubierta por la migración de células como se evaluó en 5 diferentes experimentos herida por condición utilizando el software Image J. Barras de escala = 100 m. C. La invasión de las células se estudió usando Transwells recubiertos con Matrigel. Después de 48 h, se fijaron las células invasoras, se tiñeron con violeta cristal al 1% y se contaron. D. 2 × 10
6 proliferan las células HCT116 que expresan shMUT o shPTEN se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos 5 por condición. El peso del tumor se evaluó 30 días después de la inyección. * Significativamente diferente en p = 0.05.
Finalmente, se investigó si la reducción de PTEN en las células HCT116 es suficiente para inducir metástasis tumoral
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, mediante el uso de ensayo de vena de la cola.