Extracto
LCRMP-1, una nueva isoforma de CRMP-1, puede promover la migración de las células del cáncer, la invasión y la asociada con un mal resultado clínico en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Sin embargo, los mecanismos reguladores subyacentes de LCRMP-1 en células de invasión del cáncer todavía permanecen en la oscuridad. En este caso, nos informan de que GSK3 puede fosforilar LCRMP-1 en Thr-628 en las secuencias de consenso y esta fosforilación es crucial para la función de LCRMP-1 para promover la formación de filopodios, la migración y la invasión de las células cancerosas. Impedimento de la fosforilación de Thr-628 atenúa los efectos estimulantes de LCRMP-1 en filopodios forman, habilidades migración y la invasión de las células cancerosas; al mismo tiempo, GSK3 quinasa-muerta disminuye regulación de LCRMP-1 en la invasión de células cancerosas. Por otra parte, también se encontró que los pacientes con expresión de GSK3 de bajo nivel de Ser-9-fosforilada y alto nivel LCRMP-1 de expresión tienen peor supervivencia global que los que tienen expresiones de alto nivel inactivos GSK3 y de bajo nivel LCRMP-1 expresiones (P & lt; 0,0001). En conjunto, estos resultados demuestran que la fosforilación de GSK3-dependiente de la LCRMP-1 proporciona un mecanismo importante para la regulación de LCRMP-1 en la invasividad de las células del cáncer y el resultado clínico
Visto:. Wang WL, Hong TM, Chang YL, Wu CT, Pan SH, Yang PC (2012) La fosforilación de LCRMP-1 por GSK3 promueve la formación de Filopoda, Habilidades migración y la invasión de las células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (2): e31689. doi: 10.1371 /journal.pone.0031689
Editor: Adam I. Marcus, Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de diciembre de 2011; Aceptado: January 11, 2012; Publicado: 21 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Consejo Nacional de Ciencias (NSC 98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-3112-B-006-005, y NSC100-2321-B-002-071). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Metástasis contribuye al fracaso del tratamiento y la muerte en la mayoría de los pacientes con cáncer [1]. La capacidad de las células cancerosas a la metástasis progresiva es controlada por procesos celulares complejos, implicando cambios microambientales, aumento de la capacidad de migración de células o invasión, múltiples acontecimientos genéticos y factores reguladores. Hasta ahora, muchos maestros inductores y supresores de la metástasis del cáncer ha sido identificado para participar en estos procesos, y por lo tanto desentrañar las vías de regulación aguas arriba de estas proteínas puede facilitar que representa mecanismos moleculares detallados para la metástasis del cáncer [2].
El glucógeno quinasa-3β sintasa (GSK3) es conocido como un multi-tarea de serina /treonina quinasa que controlan numerosos procesos celulares, incluyendo el metabolismo del glucógeno, la diferenciación celular, la apoptosis, la reorganización del citoesqueleto, la regulación del ciclo celular y la proliferación celular [3], [4]. GSK3 regula una amplia gama de sustratos a través de la fosforilación en motivos de consenso óptimas (Ser /Thr-X-X-X-Ser /Thr, donde X es representativo de cualquier aminoácido) [3], [5]. Por lo general, los sustratos más comunes de GSK3 necesitan un cebado quinasa específica para aumentar la eficiencia de la primera fosforilación en residuos de serina o treonina que cerca de los cuatro residuos de sitio de fosforilación de GSK3 en el extremo carboxilo terminal. Por ejemplo, la caseína quinasa 1 primos anteriores ß-catenina a la fosforilación GSK3 [6], y la caseína quinasa 2 es un cebado quinasa de la sintasa de glucógeno [7].
proteína-1 mediadora de la respuesta colapsina (CRMP-1) suprime la extensión del cono de crecimiento neuronal durante el desarrollo, y también se conoce como un supresor de la invasión del cáncer [8], [9]. Recientemente, hemos identificado una nueva isoforma de CRMP-1, la forma larga CRMP-1 (LCRMP-1) [10]. LCRMP-1 puede promover la formación de filopodios, la migración de células de cáncer, la invasión a través funcionalmente contra CRMP-1, y su expresión se correlaciona con un mal resultado clínico en cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) de los pacientes. LCRMP-1 y CRMP-1 puertos secuencias C-terminal idénticos de exón-2 al exón-14; Sin embargo, N-terminal exón-1 secuencia de LCRMP-1 es distinta a la de CRMP-1 [11]. Entre la familia CRMP humana, la secuencia de aminoácidos de CRMP-2 es 78% y 76% de identidad con CRMP-1 y CRMP-3, respectivamente [12]. Anteriormente, CRMP-2 ha sido reportado ser fosforilados por GSK3 en Thr-514, y asociado con menoscabo de polarización neuronal [13]. Notablemente, CRMP-1 y CRMP-3 mostraron motivos de fosforilación de consenso muy similares GSK3 con CRMP-2 [14]. Consistente con CRMP-1, LCRMP-1 también contienen mismo motivo para la fosforilación GSK3.
Desde LCRMP-1 y CRMP-1 tienen función opuesta sobre la migración y la invasión del cáncer, si la función de LCRMP-1 puede regularse por GSK3 debe ser más estudiado. En el presente informe, se investiga la posible regulación de GSK3 en LCRMP-1. Aquí, hemos demostrado que GSK3 puede fosforilar LCRMP-1 y modular la formación de filopodios, la migración de células de cáncer y la invasión. Además, confirmamos el sitio GSK3 fosforilada en LCRMP-1, investigamos su función para la invasión de células y evaluar su clínica significativa en pacientes con CPNM.
Resultados
GSK3 puede fosforilar LCRMP-1 en la Thr- 628
Para predecir si las secuencias consenso de fosforilación GSK3 clásicos están existían en LCRMP-1, primero se suman las secuencias de proteínas entre CRMP-2, CRMP-1, y LCRMP-1 (fig. 1A). estudio anterior mostró que Cdk5 es una quinasa que fosforila cebado CRMP-2 en Ser-522, siguiendo con la fosforilación de CRMP-2 en Thr-514 por GSK3 y que resulta en la regulación funcional de polarización neuronal [13]. Por lo tanto, se encontró que las secuencias de proteínas de LCRMP-1 contenían altamente consistente con Cdk5 y el motivo de fosforilación GSK3, así especuló que un importante sitio de fosforilación potencial de LCRMP-1 se encuentra en Thr-628 (Fig. 1A). Para examinar si LCRMP-1 puede ser fosforilado por GSK3, las células HEK293T se cotransfectaron con el tipo salvaje marcada con Flag LCRMP-1 (WT) en presencia del vector vacío, de tipo salvaje GSK3 (WT), constitutivamente activa GSK3 (CA) o GSK3 quinasa-muerta (KD). La expresión de GSK3 (CA) fue más obviamente detecta desplazamientos de movilidad (puntas de flecha) de LCRMP-1 (WT) de GSK3 (WT) (Fig. 1B, carril 2 y 3). Sin embargo, a la migración lenta bandas superior se desaparecieron completamente en células que expresan la forma quinasa deficiente de GSK3 (KD) (Fig. 1B, carril 4). Estos resultados sugieren que LCRMP-1 es un sustrato de GSK3 y bandas que migran lentamente fueron causadas por su fosforilación
in vivo
.
Análisis (A) Secuencia de proteína mostró el sitio consenso potencial de LCRMP- 1 para la fosforilación por GSK3. Secuencias de proteínas están alineados entre CRMP2, CRMP-1, y LCRMP-1. Los números representan los sitios de aminoácidos y subrayado indica un sitio de fosforilación potencial para Cdk5. (B) GSK3 fosforila LCRMP-1 (WT)
in vivo
. HEK293T células fueron co-transfectadas con Bandera de etiquetado LCRMP-1 y la actividad distinta de la Bandera de etiquetado GSK3 (WT, CA y forma KD). La misma cantidad de plásmidos se transfectaron en cada condición mediante el uso de vectores vacíos. Las células se lisaron 30 horas después de la transfección y los extractos de proteínas se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos anti-Flag. (C) GSK3 fosforila LCRMP-1 (WT) en Thr-628
in vivo
. células CL1-0 fueron co-transfectadas ya sea Bandera de etiquetado LCRMP-1 (WT) o LCRMP-1 (T628A, T628D) mutantes en la presencia o ausencia de actividad distinta de GSK3 Bandera de etiquetado (CA y KD forma). vectores vacíos fueron utilizados para complemento de la misma cantidad de plásmidos en ensayo de transfección. Los lisados celulares se cosecharon 48 horas después de la transfección y se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos anti-FLAG y anti-β-actina.
A continuación, para determinar si GSK3 fosforila LCRMP-1 en Thr-628
in vivo
, un no fosforilada LCRMP-1 mutante se generó mediante la sustitución de Thr-628 a Ala (T628A). las células se cotransfectaron con CL1-0 LCRMP-1 (WT) o una LCRMP-1 (T628A) mutante no fosforilado en presencia de cualquiera de vector vacío, GSK3 (CA), o GSK3 (KD). De acuerdo con observaciones anteriores, GSK3 (CA) y GSK3 (KD) se probaron para mostrar desplazamiento de banda y de cambios no banda (puntas de flecha) de LCRMP-1, respectivamente (Fig. 1C, carril 2 y 3). Notablemente, LCRMP-1 (T628A) era resistente a actividad GSK3 (CA) y las bandas pasado fueron casi abolió (Fig. 1C, carril 4). Este resultado fue similar a las condiciones de LCRMP-1 (WT), además de GSK3 (KD) (Fig. 1C, carril 3 y 4), y confirmando además que GSK3 fosforilada de hecho LCRMP-1 a Thr-628 residuos. En conjunto, todos estos resultados indicaron que LCRMP-1 fue específicamente fosforilados en Thr-628 por GSK3
in vivo
.
se requiere Thr-628 fosforilación de LCRMP-1 para la invasión de células de cáncer, la migración y la formación de filopodios
en nuestros informes actuales, hemos encontrado que la de tipo salvaje LCRMP-1 aumenta la formación de filopodios, y promueve la migración celular y la invasión en líneas celulares de cáncer de pulmón no invasivos humanos [10]. Desde LCRMP-1 puede ser fosforilada en Thr-628 por GSK3, el próximo preguntamos si la función de LCRMP-1 podría ser regulada por esta fosforilación. Para hacer frente a esto, hemos generado una serie de lentivirus que expresan GFP (control), no etiquetada LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A) o LCRMP-1 (T628D), y los transducidas en bajo invasiva CL1 -0 células de cáncer de pulmón que expresan bajos niveles de LCRMP endógena-1 [11]. Expresión de la proteína de tipo salvaje o mutante LCRMP-1 se confirmó por análisis de inmunotransferencia utilizando anti-LCRMP-1 anticuerpos (Fig. 2A). entonces Estas células se usaron para examinar la capacidad de invasión de células. Como era de esperar, LCRMP-1 (WT) la sobreexpresión contribuyó a un aumento de la invasividad de las células en comparación con el control de GFP (Fig. 2B). Sin embargo, T628A mutante no fosforilada de LCRMP-1 fue enormemente disminuida capacidad de invasión celular (Fig. 2B). capacidad de invasión a la inversa, fosfato imitar LCRMP-1 (T628D), que se esperaba para imitar la forma fosforilada, representada aumentada similar a la de tipo salvaje LCRMP-1 (WT). Para explorar más a fondo el efecto de la Thr-628 fosforilación de LCRMP-1 de expresión en la motilidad celular CL1-0, se realizó un ensayo de microscopía de lapso de tiempo de vídeo en movimiento para controlar pistas de por lo menos 10 células individuales durante un período de 20 horas. Lentivirus transducidas con células que expresan GFP-CL1-0 LCRMP-1 (WT) o GFP-LCRMP-1 (T628D) aumentó tanto la distancia de migración y la migración de velocidad en comparación con el vector GFP (Fig. 2C, D, y E). Sin embargo, GFP-LCRMP-1 (T628A) mostraron un marcado de compresión de la distancia y la velocidad de la migración (Fig. 2C, D, y E). Estos resultados sugieren que la fosforilación de LCRMP-1 a Thr-628 es un prerrequisito para la invasión celular y la migración celular.
(A) los niveles de expresión de la proteína de exógena sin etiquetar LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A ), y LCRMP-1 (T628D) se confirman por inmunotransferencia. Después de 48 horas después de la infección por lentivirus, células CL1-0 expresaban de forma estable de tipo salvaje y mutante LCRMP-1. Lentivirus que expresan GFP sirvió como control. Se recogieron lisados celulares, seguido de la evaluación con inmunotransferencia utilizando anti-LCRMP-1 de anticuerpos y anticuerpos anti-beta-actina. (B) no fosforilada LCRMP-1 (T628A) mutante reduce la actividad de la invasión celular. La capacidad de invasión de estas células se determinó con el ensayo de invasión cámaras Boyden modificada
in vitro
. Porcentaje de la capacidad invasiva se normalizó con el control de las buenas prácticas agrarias. Los datos se muestran como medias ± SEM para los experimentos de tres independientes (n = 3). (C) no fosforilado LCRMP-1 (T628A) mutantes en gran medida suprimidas pistas de migración celular. parcelas del tracto mostraron células CL1-0 que expresan GFP, GFP-LCRMP-1 (WT), GFP-LCRMP-1 (T628A), GFP-LCRMP-1 (T628D), respectivamente. Mover pistas de por lo menos 10 células representativas en el punto inicial listo para '0,0' durante un periodo de 20 horas (diferentes líneas) mostró la motilidad de las células representante. Barra de escala, 100 micras. (D, E) la distancia de migración total (D) y la velocidad de la migración celular (E) se cuantificaron a partir de ensayo de rastreo celular durante 20 horas. Los datos se presentan como medias ± SEM.
A continuación, se examinó además los efectos de GSK3 en la formación de filopodios inducida LCRMP-1. células CL1-0 fueron transfectadas transitoriamente con control GFP, GFP-LCRMP-1 (WT), GFP-LCRMP-1 (T628A) o GFP-LCRMP-1 (T628D) y siguiendo por tinción con actina utilizando faloidina conjugada con rodamina. De acuerdo con nuestros informes actuales, el análisis de inmunofluorescencia reveló que el número de filopodios la inducida por la expresión ectópica de GFP-LCRMP-1 (WT) en las células CL1-0 eran más que eso por el control de vectores GFP. Por el contrario, los números de la formación de filopodios eran obviamente atenuadas en células que expresan no fosforilado mutante GFP-LCRMP-1 (T628A) (Fig 3A;. 3B, p & lt; 0,0001). Además, GFP-LCRMP-1 (T628D) también se indujo más filopodios que similar a GFP-LCRMP-1 (WT), (Fig 3A;. 3B, p & lt; 0,0001). Estos datos indicaron que la fosforilación de LCRMP-1 a Thr-628 es crucial para la formación de filopodios.
(A) no fosforilado LCRMP-1 (T628A) mutante afecta la formación de filopodios. células CL1-0 fueron transfectadas transitoriamente con GFP-tagged LCRMP-1 (WT), LCRMP-1 (T628A), y LCRMP-1 (T628D). A las 24 horas después de la transfección, se fijaron estas células, se permeabilizaron y luego a inmunotinción con faloidina conjugada con rodamina (rojo) para la actina y DAPI (azul) para la visualización de núcleos. imágenes representativas de inmunofluorescencia se visualizaron mediante microscopio de fluorescencia. Barra de escala, 10 micras. El recuadro muestra aumentos superiores (400 ×). (B) el número de filopodios se contaron con al menos seis células por grupo. Los datos se presentan como medias ± SEM.
GSK3 fosforila LCRMP-1 y modula la invasión de células de cáncer de
Para detectar más los efectos de GSK3 en LCRMP-1 (WT) inducida por el cáncer la invasión de células, lentivirus que expresan GFP de control, GSK3 (WT), GSK3 (CA), o GSK3 (KD) fueron infectados en células de sobreexpresión /LCRMP-1 CL1-0 (líneas 1015 y 1003) que se ha demostrado previamente para inducir fuertemente celular invasividad [10]. De acuerdo con nuestros hallazgos anteriores (Fig. 1B y C), análisis de inmunotransferencia mostró que LCRMP-1 GSK3 (CA) inducida con banda desplazado en comparación con el control de GFP (Fig 4A, carril 1 y 3;. Carril 5 y 7), pero una banda que no sea desplazada se observó en GSK3 (KD) (Fig. 4A, carril 4 y carril 8). Basado en las condiciones anteriores, los resultados de ensayo de invasión se muestra también que GSK3 (CA) -introduced células (1015) CL1-0 /1 LCRMP-podría promover aún más la invasión de células en comparación con las células control (Fig. 4B). Sin embargo, GSK3 (KD) -introduced células dieron lugar a una disminución en la capacidad de invasión (Fig. 4B). En conjunto, estos resultados demostraron que GSK3 podría modular la actividad LCRMP-1 a través de una manera dependiente de la fosforilación de controlar la invasión de células de cáncer.
(A) Lentivirus expresado control GFP, myc-etiquetados GSK3 (WT), GSK3 ( CA), o GSK3 (KD) en las células de sobreexpresión CL1-0 /LCRMP-1 (WT) (1015 y 1003). Después de 48 horas después de la infección, se lisaron estas células y se sometieron a análisis de inmunotransferencia con el uso de anti-Flag, anti-Myc, y los anticuerpos anti-beta-actina. (B) la actividad de GSK3 afecta a la invasión de células de cáncer LCRMP-1 inducida. /LCRMP-1 en las células de sobreexpresión CL1-0 (1015) se infectaron con GSK3 lentivirus que expresan GFP de control, etiquetado con myc (CA) o GSK3 (KD). Después de 48 horas después de la infección, estas células se sometieron al ensayo de invasión cámaras Boyden modificada
in vitro
. La normalización de control GFP sirvió como porcentaje de la capacidad invasora.
Baja expresión de GSK3 inactiva y una alta expresión de LCRMP-1 se correlacionan con la supervivencia global pobres en pacientes con CPNM
Aunque nuestros resultados consistentemente conjetura que la función de LCRMP-1 podría ser regulada por la fosforilación de GSK3, tales estudios no reflejan totalmente la malignidad clínica. En consecuencia, hemos ampliado nuestro análisis examinando forma inactiva GSK3 y LCRMP-1 en los niveles de expresión de proteínas en muestras tumorales de 142 pacientes con CPNM. Las características clínicas de estos pacientes se resumen en la Tabla 1. Las secciones seriadas de cada muestra se tiñeron con anticuerpos contra LCRMP-1 y Ser-9-fosforilados GSK3 que indica el estado de la forma inactiva GSK3 debido a la activación de Akt mediada por lo que resulta en supresión de la actividad GSK3 a través de la fosforilación en Ser-9 [15]. Nuestros resultados mostraron tinción típica de LCRMP-1 y Ser-9-fosforilados GSK3 en una muestra del paciente (Fig. 5A). De acuerdo con nuestros informes anteriores, alto nivel LCRMP-1 tuvieron una supervivencia global significativamente pobre en comparación con la de bajo nivel LCRMP-1 en pacientes con CPNM [10], [11]. En particular, el análisis del efecto combinado de ambas proteínas en el pronóstico de los pacientes reveló que los pacientes con bajo nivel de expresión de la forma inactiva GSK3 y la expresión de alto nivel de LCRMP-1 tenían peor supervivencia global que los que tienen una expresión de alto nivel de forma inactiva GSK3 y de bajo nivel LCRMP-1 de expresión (Fig. 5B, p & lt; 0,00001). análisis multivariante de regresión de riesgos proporcionales, con un modelo de selección por pasos, estaban presentes para evaluar las asociaciones de diversos factores pronósticos independientes con la supervivencia del paciente (Tabla 2). Estos resultados sugieren que una alta actividad GSK3 y de alto nivel LCRMP-1, posiblemente imitando el estado fosforilado de LCRMP-1, están asociados con el aumento de la invasividad del cáncer y la supervivencia global más pobre.
(A) de expresión de proteínas Típica patrones de fosforilados GSK3 y LCRMP-1 se detectaron mediante inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-fosfo-GSK3 (Ser9) y LCRMP-1-anticuerpos anti (C2) en las disecciones de serie de muestras de tumores primarios de 142 pacientes con CPNM que fueron sometidos a resecciones quirúrgicas. Los resultados se muestran + y - marca tumores con y sin sobre-expresión con la proteína indicada respectivamente. Las barras de escala, 100 m. p-GSK3 fue representada a fosforilados GSK3. (B) Análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global de 142 pacientes con CPNM con p-GSK3
- LCRMP-1
-, p-GSK3
- LCRMP-1
+, p-GSK3
+ - LCRMP-1
-, y p-GSK3
+ - LCRMP-1
+.
valores de P fueron realizados por log-rank pruebas de 2 caras.
Discusión
Nuestro estudio investigó principalmente el mecanismo de regulación de la post -Traducción modificación asociada con la migración de células de cáncer y la invasividad de LCRMP-1. Aquí, mostramos que la fosforilación de GSK3-dependiente de la LCRMP-1 regula positivamente la formación de filopodios, la migración y la invasión de las células cancerosas. Sobre la base de motivos de consenso fosforilados-GSK3, Thr-628 residuos de aminoácidos de LCRMP-1 es el sitio de fosforilación maestro para GSK3 (Fig. 1). Una sustitución de Thr-628 para Ala en LCRMP-1 condujo a perjudicar la formación de filopodios, la migración y la invasión de células de cáncer, mientras que una sustitución de Thr-628 a Asp restaurada en gran medida su función (Fig. 2 y 3). Consistente con estas observaciones, la expresión ectópica de GSK3 quinasa muerta disminuida inducida por LCRMP-1 capacidad invasiva (Fig. 4). Por otra parte, los pacientes con CPNM clínicos con bajo nivel de LCRMP 1-expresión inactiva GSK3 y de alto nivel de proteínas se asocia con una pobre supervivencia global que los que tienen alto nivel forma inactiva GSK3 expresión y de bajo nivel LCRMP-1 de expresión (Fig. 5B) . Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan evidencia para apoyar el mecanismo fundamental de la fosforilación de GSK3-dependiente para controlar la formación LCRMP-1 mediada por filopodios, la migración y la capacidad invasiva de las células cancerosas.
El análisis de secuencia indica que se ha producido un Cdk5 ( cebado sitio quinasa) la fosforilación tanto en LCRMP-1 y CRMP-1 (Fig. 1A). Después de la fosforilación en Ser-636 por Cdk5, GSK3 a su vez fosforila Ser-632 y Thr-628 de forma secuencial. Por lo tanto, GSK3 puede inducir bandas de migración más lenta en LCRMP-1 incluyendo tanto Ser-632 y la fosforilación de Thr-628 en las células, y las bandas inducidas por GSK3 constitutivamente activa eran más activos que la de tipo salvaje GSK3 (Fig. 1B). En análisis detallado, se encontró que LCRMP-1 mutante, T628A, podría bloquear la mayoría de GSK3 fosforilación inducidos bandas de migración (Fig. 1C). Esto puede indicar que Thr-628 de LCRMP-1 puede ser el sitio de fosforilación dominante e importante para la fosforilación GSK3. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que constitutivamente activa GSK3 puede fosforilar otros sitios de LCRMP-1