Extracto
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que está regulado en el cáncer de pulmón, implica la activación de señales mitogénicas y desencadena múltiples cascadas de señalización. Para diseccionar estas cascadas de EGFR, hemos utilizado 14 anticuerpos fosfo-EGFR diferentes para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un
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ensayo de ligamiento por proximidad (
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PLA). Fosforilación en Thr654-EGFR y -Ser1046 era dependiente de EGF en el receptor de tipo salvaje (WT), pero EGF-independiente en una línea celular que porta la mutación de EGFR-L858R. El uso de un ProtoAarray ™ que contiene ~5000 proteínas recombinantes en el chip de proteínas, se encontró que AURKA interactuó con el mutante de EGFR-L861Q. Por otra parte, la sobreexpresión de EGFR podría formar un complejo con AURKA, y los inhibidores de EGFR AURKA y disminución de EGFR-Thr654 y la fosforilación -Ser1046. La tinción inmunohistoquímica de tejidos de adenocarcinoma de pulmón en estadio I demostró una correlación positiva entre la expresión AURKA y la fosforilación de EGFR en Thr654 y Ser1046 en
EGFR
especímenes -mutant, pero no en
EGFR
-WT especímenes. La interacción entre EGFR y AURKA proporciona una explicación para la diferencia en la dependencia entre EGF
EGFR
-WT y
EGFR
-mutant células y puede proporcionar una nueva estrategia terapéutica para pacientes con cáncer de pulmón que llevan
EGFR mutaciones
Visto:. Chen TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou TY, Wu TA, et al. (2013) La fosforilación de proteínas de perfiles El uso de un
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proximidad ligadura de ensayo: La fosforilación de EGFR AURKA-suscitó-Thr654 y EGFR-Ser1046 en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10.1371 /journal.pone.0055657
Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Agosto, 2012; Aceptó 3 de enero de 2013; Publicado: 8 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia (NSC101-2325-B-010-011 y NSC101-2627-B-010-001), el Centro de Excelencia para la Investigación del cáncer en el hospital general de Veteranos de Taipei (DOH101-TD-C- 111-007), y el Ministerio de Educación, apunte para el plan Universitario superior (Universidad Nacional Yang Ming) para CYH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo, y la tasa de supervivencia relativa a cinco años de los pacientes con cáncer de pulmón es inferior al 15% [1]. Hay dos tipos principales de cáncer de pulmón: cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, aproximadamente el 20% de los cánceres de pulmón) y los cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, aproximadamente el 80% de los cánceres de pulmón) [2], [3]. Factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), que es un receptor tirosina quinasa (RTK), inicia múltiples vías de señalización relacionadas con la progresión del cáncer, tales como los implicados en la proliferación celular, la migración /invasión y el ciclo celular [4] - [7]. La sobreexpresión de EGFR se observa en aproximadamente el 50% de NSCLC y también se asocia con un mal pronóstico y un curso de una enfermedad más agresiva [8], [9].
EGFR
mutaciones se detectan con frecuencia en pacientes con CPNM (10-40%) [10], [11]. Aproximadamente el 50% de
EGFR
mutaciones consisten de deleciones en el exón 19, mientras que 35 a 45% consiste en la mutación L858R y 5% constan de inserciones en el exón 20 o la mutación L861Q [10] - [12]. Gefitinib (Iressa) y erlotinib (Tarceva) son inhibidores de EGFR que se utilizan clínicamente para el tratamiento de NSCLC avanzado, sobre todo que con
EGFR
mutaciones en los dominios de tirosina quinasa [13] - [16].
EGFR se activa por la unión de sus ligandos afines, tales como EGF y TGF?. La unión del ligando de tipo salvaje (WT) Resultados de EGFR en la dimerización del receptor y la activación del dominio quinasa intrínseca, seguido por la fosforilación de residuos de tirosina específicos en la cola citoplásmica [17] - [19]. La desregulación de las vías de EGFR activado puede ser el resultado de mutaciones que causan la dimerización independiente de ligando del receptor, la activación y la señalización aguas abajo [16], [20]. Tras la estimulación de EGF, la fosforilación de la tirosina de EGFR es un "evento temprano", mientras que el EGFR fosforilación de la serina /treonina, por ejemplo, Ser967, se produce con un retraso de tiempo [21], [22]. La fosforilación de EGFR en muchos sitios de tirosina después de la estimulación ligando inicia cascadas de señalización corriente abajo, y de la fosforilación de EGFR en la serina /treonina se ha informado para atenuar estas señales a través de la retroalimentación negativa [23] - [25]. Muchos sitios de serina y treonina están presentes en EGFR, pero su función sigue siendo poco clara. Por otra parte, el resultado de señalización inducida por la fosforilación de diferentes sitios en EGFR es complicado y aún no se ha dilucidado para el desarrollo de aplicaciones terapéuticas.
La proteína quinasa AURKA ha atraído la atención debido a su sobreexpresión se ha encontrado en diversas epitelial tumores malignos [26], [27], como el de mama [28], colon [29], de ovario [30] y de pulmón [31], como resultado de la amplificación del gen, la desregulación transcripcional o defectos en la estabilidad de la proteína y el control de la actividad de quinasa [32]. La desregulación de AURKA y EGFR se observa en diferentes tipos de cáncer y es un indicador importante de pronóstico en el desarrollo del cáncer [33]. Un estudio previo demostró que la contratación inducida por EGF de EGFR nuclear y STAT5 al promotor AURKA aumentó aún más la expresión génica AURKA [34]. Por otra parte, EGFR incrementa la expresión de la proteína de AURKA mediante la activación de la maquinaria de traducción a través de las ERK y AKT vías [35]. Estos resultados plantean la posibilidad de que estas dos proteínas están vinculados funcionalmente.
Recientemente, el
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ensayo de ligamiento por proximidad (
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PLA) fue desarrollado para detectar y visualizar IBP endógenos y modificaciones post-traduccionales de las proteínas, por ejemplo, fosforilación, con alta sensibilidad y especificidad [36], [37]. Para detectar la fosforilación de proteínas, se seleccionaron los objetivos duales de pares de anticuerpos primarios [uno que reconoce la proteína diana (por ejemplo, EGFR) y otra que reconoce la fosfo-sitio de la diana (por ejemplo pEGFR-Tyr1068)]. Si los objetivos de un par de anticuerpos están en estrecha proximidad, los anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos será lo suficientemente cerca para servir como plantillas para la ligación de dos oligonucleótidos lineales adicionales en un círculo de ADN. El círculo de ADN se puede amplificar con el oligonucleótido de uno de los anticuerpos secundarios utilizando amplificación por círculo rodante (RCA). El producto RCA entonces se puede hibridar con oligonucleótidos marcados con fluorescencia para generar una señal de punto que indica la ubicación subcelular y la frecuencia de la fosforilación de [36], [37]. Esta técnica tiene una alta especificidad y sensibilidad para la evaluación de la fosforilación de proteínas y proporciona nuevas oportunidades para cuantificar con precisión la fosforilación de proteínas y la transducción de señales en las células.
A continuación, hemos utilizado 14 anticuerpos dirigidos de sitio de fosforilación de EGFR con diferentes
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PLA para dilucidar diferencias entre EGFR-WT y mutante EGFR-L858R en células de cáncer de pulmón. De particular interés es la identificación de dos sitios de fosforilación de EGF-independiente (EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046) en las células que llevan la mutación de EGFR-L858R. Por otra parte, los receptores EGFR-WT y mutante EGFR-L858R mostraron interacciones físicas con AURKA bajo la estimulación de EGF. EGFR-Thr654 y la fosforilación de EGFR-Ser1046 disminuyeron tras la aplicación de un inhibidor AURKA, pero sólo en líneas de células mutantes EGFR-L858R, que plantearon la posibilidad de la aplicación terapéutica de los inhibidores de AURKA en pacientes con cáncer de pulmón.
Resultados
Perfilado de la fosforilación de EGFR en células de cáncer de pulmón
fosforilación de EGFR desempeña un papel clave en la modulación de la activación de las vías relacionadas con la progresión del cáncer de señalización [4] - [7]. Hay numerosos sitios de fosforilación de EGFR (http://www.phosphosite.org) [38], y muchos de ellos no se han estudiado extensamente (Figura 1), debido a la falta de anticuerpos y los métodos de detección. En el presente estudio, 14 anticuerpos EGFR fosforilados se utilizaron para
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PLA para cuantificar el nivel basal de la señalización de EGFR en células HeLa, que es la línea celular común para el cribado (Tabla 1). Todos los anticuerpos dado negativo en el
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ensayo de PLA en células HeLa, que es coherente con la idea de que EGFR se activa tras la unión de su ligando y desencadena efectores aguas abajo a través de la dimerización del receptor y la fosforilación de tirosina específica residuos en la cola citoplásmica [17] - [19]. Para confirmar la sensibilidad y especificidad de las células A431
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PLA, que luego se usa, que son bien conocidos para expresar altos niveles de EGFR y la hiper-fosforilados EGFR-Tyr1068 bajo la estimulación de EGF. (Figura 2, las imágenes representativas de superposición BlobFinder se muestran en la Figura S1). Así, las células A431 se eligieron como control positivo. El pEGFR-Tyr1068 se upregulated por un aumento de aproximadamente 15 veces a la estimulación de EGF como se determina por
in situ
ensayo PLA (Figura 2A y 2B), mientras que sólo se upregulated por 2,6 veces, determinado por inmunotransferencia ( Figura 2C), que indica la alta sensibilidad de la
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ensayo de PLA.
la información EGFR sitio de fosforilación se obtuvo de PubMed y PhosphoSitePlus (http://www.phosphosite.org) .
células A431 fueron suero de hambre durante 16 horas y después se trató con EGF (10 ng /ml) en medio libre de suero durante 10 minutos. (A)
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PLA es altamente sensible para la detección de la fosforilación de pEGFR-Tyr1068 después de la estimulación de EGF. se muestra (B) La cuantificación de estas dos señales. (C) EGFR y pEGFR-Tyr1068 se detectaron en las células A431 mediante análisis de inmunotransferencia.
Expresión diferencial de fosforilación de EGFR después de la estimulación de EGF entre EGFR-WT y células EGFR mutante
activación de EGFR inicia múltiples vías de señalización, y la desregulación de las vías de EGFR activado puede ser una consecuencia de varios
EGFR
mutación [39]. Para determinar el estado de fosforilación diferencial de los sitios de fosforilación de EGFR, se detectó la fosforilación de EGFR en diferentes sitios en las células cancerosas H1299 pulmonares que expresaban de forma estable un vector vacío, EGFR-WT o mutante EGFR-L858R con o sin estimulación de ligando. En las células estables H1299-EGFR-WT, 9 de 14 sitios de fosforilación de EGFR fueron fosforilada tras la estimulación de EGF. El resto de los anticuerpos pEGFR no logró mostrar una señal en inmunotransferencia. Por el contrario, en las células mutantes de EGFR-L858R, inducida por EGF (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 y EGFR-Tyr1148) y la fosforilación de EGF-independiente (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, y EGFR-Tyr1101) se identificaron (Figura 3A-3C). Comparando los resultados de
in situ
PLA y la inmunotransferencia, se observaron patrones de fosforilación similares para todos los sitios de fosforilación seleccionados (Tabla S1 y Figura S2). Los patrones de fosforilación de los 14 sitios de fosforilación de EGFR diferentes según lo determinado por
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PLA y la inmunotransferencia se resumen en la Tabla 1.
H1299 células expresan de forma estable el vector vacío, EGFR-WT o mutante EGFR -L858R. (A) Después de la estimulación con EGF (10 ng /ml) en medio libre de suero durante 10 minutos, los extractos celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia con los anticuerpos fosfo-tirosina indicados. Dependiente de EGF (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 y -Tyr1068) y EGF-independiente [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 y -Tyr1101, -Thr654 (ver abajo) y -Ser1046 (véase más adelante)] se observó fosforilación en H1299 células que expresan EGFR mutante-L858R. La fosforilación de EGFR-Thr654 (B) y -Ser1046 (C) con o sin tratamiento con EGF en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón se controló a través de
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PLA. La cuantificación de los
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PLA se muestra a la derecha. EGFR-Thr654 y -Ser1046 fueron fosforilados en el tratamiento de EGF en las células H1299-EGFR-WT, mientras que su fosforilación fue EGF-independiente en las células H1299-EGFR-L858R. (D) Análisis de inmunotransferencia de EGFR-Thr654 y -Ser1046 se realizó en células de EGFR mutantes (H1975, que contiene el EGFR-L858R y mutantes -T790M) y células que expresan EGFR-WT (A549). La fosforilación de EGFR-Tyr1068 fue inducida por EGF. La fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046 era EGF-independiente en el H1975 y H1299 células-EGFR-L858R como se determinó por inmunotransferencia.
fosfo-EGFR-Thr654 y fosfo-EGFR-Ser1046 exhibición EGF fosforilación independiente en las células mutantes H1299-EGFR-L858R
en la línea celular H1299-EGFR-L858R, la fosforilación de EGFR-Thr654 (Figura 3B) y EGFR-Ser1046 (Figura 3C) se identificó como EGF-independiente fosforilación por
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PLA y análisis Western blot (las imágenes de superposición BlobFinder representativos se muestra en la Figura S3 y S4 Figura). Sin embargo, estos dos sitios de fosforilación exhiben fosforilación dependiente de EGF en las células que expresan EGFR H1299-WT. Además, pEGFR-Thr654 y pEGFR-Ser1046, los cuales fueron considerados para ser fosforilada por otras quinasas [40] - [42]. Pero no por EGFR auto-fosforilación, fueron seleccionados para verificar los efectos funcionales de la vía de señalización del EGFR
además, evaluó si la fosforilación de EGF-independiente de EGFR-Thr654 y -Ser1046 sólo se produce en las células con sobreexpresión de EGFR-L858R y es causada por la desregulación de la ruta de señalización de EGFR. Utilizamos A549 (células de cáncer de pulmón con EGFR-WT endógenos) (células de cáncer de pulmón con EGFR endógeno-L858R-T790M mutado) y H1975 el correspondiente seguimiento. La Figura 3D muestra que la fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046 era EGF-independiente en células que expresan EGFR endógeno y exógeno-L858R. Por lo tanto, se observaron diferentes patrones de fosforilación /treonina EGFR serina como la fosforilación de EGF-independiente en las células mutantes de EGFR-L858R.
La interacción física entre AURKA y EGFR
AURKA es una quinasa que se expresa altamente en la mitosis y ha sido implicado en los procesos de transformación de células [43]. En una búsqueda de sustratos adicionales y proteínas que interactúan con un ProtoAarray ™ [44] que contenía ~5000 proteínas recombinantes en el chip de proteínas (www.invitrogen.com/protoarray), encontramos que AURKA interactuó con el mutante de EGFR-L861Q, que comprende ~ 5% de
EGFR
mutaciones en pacientes con cáncer de pulmón [10], pero no EGFR-WT (Figura 4A). Para confirmar esta interacción, que podría ser regulada por la actividad quinasa de AURKA, AURKA-WT y AURKA-KD (mutante AURKA-K162I, que es la quinasa-muertos), se utilizaron para la co-inmunoprecipitación, que mostró que el EGFR-WT y EGFR-L858R interactuó con AURKA-WT y AURKA-KD bajo la sobreexpresión de EGFR y AURKA (Figura 4B). Los resultados indicaron que la actividad catalítica de AURKA no modula la interacción con EGFR. Desde mutante EGFR-L858R frecuencia (aproximadamente 35-45%) aparece en pacientes con NSCLC [12], hemos elegido H1299-EGFR-L858R células estables para caracterizar mejor la interacción con AURKA. Para examinar si se dan las interacciones endógenas EGFR-AURKA en células de cáncer de pulmón y si es dependiente de EGF, se aplicó
In situ
PLA para determinar la interacción de EGFR-AURKA en A549 y H1975 con o sin estimulación EGF (Figura 4C). Mostró tanto EGFR-WT y EGFR-L858R interactuaron con AURKA bajo la estimulación de EGF
.
(A) Se utilizó ProtoArray ™ para identificar EGFR como nuevo compañero de interacción para AURKA. Brevemente, expresado, recombinante marcada con His AURKA humano se sondeó en ProtoArray ™ microarrays de la proteína humana en siete concentraciones (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 y 100 ng /l) por duplicado. Cabe señalar que el EGFR-L861Q, pero no EGFR-WT, se identificó inicialmente para interactuar con AURKA. (B) HEK293T fueron co-transfectadas con Myc-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R y -L861Q mutantes) y Bandera-AURKA [AURKA-WT y muertos AURKA-quinasa (KD)]. Después de la transfección durante 48 horas, los extractos celulares se sometieron a co-inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-FLAG M2. expresión de proteína se determinó por inmunotransferencia con anticuerpos anti-FLAG anti-Myc y. Se demostró que ambos asociados EGFR EGFR-WT y mutado con AURKA-WT y AURKA-KD. Se observaron resultados similares en al menos tres experimentos independientes. (C) La interacción de EGFR-AURKA con o sin estimulación de EGF (10 ng /ml durante 10 minutos) se determinó a través de
In situ
PLA en el A549 (EGFR-WT) y H1975 (EGFR-L858R-T790M mutaciones ). Tanto EGFR-WT y mutante -L858R se asociaron con AURKA bajo la estimulación de EGF. La cuantificación de los
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señales de PLA se muestra a la derecha. (D) Los sitios de fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046 acertaron las secuencias de sustrato de consenso para AURKA. (E) H1975 células mostraron fosforilación más evidente en EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 y AURKA-Thr288 en fase M-nocodazole detenidos que en la interfase.
EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 partido AURKA secuencias de fosforilación de consenso
Debido a AURKA asociado a EGFR, el próximo investigó si AURKA fosforila EGFR en Thr654 y Ser1046. Las secuencias de vecinos de los sitios de fosforilación de EGFR en Thr654 y Ser1046 son RHIVRKRT
654LRRLLQE y DSFLQRYS
1046SDPTGAL, respectivamente. Los motivos de fosforilación AURKA contienen R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T y R-X-X-S /T (X indica cualquier aminoácido) [45]. En base a estos motivos, EGFR-Thr654 se correspondía con la X X S-R-secuencia /T consenso y EGFR-Ser1046 coincidía con la secuencia de consenso R-X-S /T de AURKA (Figura 4D). Aunque se informó de EGFR-Thr654 ser fosforilados por la proteína quinasa C (PKC) [42], PKC no puede ser la única quinasa que fosforila EGFR en este resto. Debido a que la actividad de la quinasa de AURKA aumentos de la fase M [46], que primero caracteriza la fosforilación de EGFR endógeno-Thr654 y EGFR-Ser1046 a M-fase en A549 y H1975 células. células H1975 demostraron fosforilación más obvia de EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 y AURKA-Thr288 que las células A549. Por el contrario, EGFR-Tyr1068 demostró el mismo patrón de fosforilación en la M-fase y de interfase (Figura 4E), que sugiere que los patrones de expresión de fosforilados EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 eran la misma que la de AURKA particularmente en células EGFR mutante .
EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 fosforilación se produce más tarde de la fosforilación de EGFR-Tyr1068 después de la estimulación de EGF
La fosforilación de EGFR-Tyr1068 después de la estimulación de EGF observado a las 0, 2, 5, 10 y 30 minutos en H1299 células que expresan EGFR-WT era más rápido que la fosforilación de Thr654 y Ser1046. La fosforilación de EGFR-Tyr1068 alcanzó un máximo de 2 minutos después de la estimulación de EGF, pero la fosforilación de EGFR en Thr654 y Ser1046 alcanzó su punto máximo a los 10 minutos después de la estimulación de EGF (Figura 5A). Por el contrario, en las células EGFR-L858R, no hubo diferencia en la cinética de fosforilación entre Thr654 y Ser1046 (Figura S5). Por lo tanto, la fosforilación de tirosina de EGFR se produce antes de la otra fosforilación de la serina /treonina en Thr654 y Ser1046, que consistía en el estudio anterior de EGFR serina fosforilación /treonina con retardo de tiempo [21], [22].
(A) la fosforilación de EGFR-Tyr1068 era más rápido que el de EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 bajo el EGF (10 ng /ml) de estimulación. (B) Las células se privaron de suero en presencia de VE-465 (1 nM o 100 nM), que es un inhibidor AURKA, durante 16 horas y después se trató con EGF (10 ng /ml) durante 10 minutos. La fosforilación de EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046, pero no pEGFR-Tyr1068, fue suprimida por VE-465. (C) Las células se privaron de suero en presencia de Iressa (10 M) durante 16 horas y después se trató con EGF (10 ng /ml) durante 10 minutos. Iressa, que es un inhibidor de EGFR, se utiliza para controlar la señalización de EGFR en células H1299 que expresa de forma estable EGFR-WT y mutante EGFR-L858R. La fosforilación por AURKA en Thr288 fue suprimida por Iressa en ambas líneas celulares. (D) H1975 células fueron tratadas con VE-465 y /o Iressa (10 M) durante 16 horas. VE-465 y Iressa pueden suprimir pEGFR-Thr654 y -Ser1046 en H1975.
suprime inhibidor de EGFR AURKA serina /treonina fosforilación
Para investigar la relación entre la serina EGFR /treonina y AURKA, un inhibidor AURKA (VE-465), que suprime la actividad AURKA medido por Thr288 fosforilación [47], pero no el nivel de proteína de AURKA, se aplicó para controlar la fosforilación de EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046, así como el EGFR vía de señalización (pAKT-Ser473). Bajo tratamiento VE-465, la fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046 disminuyó, pero EGFR-Tyr1068 fosforilación no se vio afectada (Figura 5B), lo que indica que la fosforilación de EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 estaba regulado por la actividad de quinasa AURKA.
Iressa es un inhibidor de EGFR que suprime la vía AKT e inhibe la fosforilación AURKA
para evaluar la regulación de EGFR y AURKA en la vía de señalización de EGFR, un inhibidor de EGFR (Iressa) se utilizó para bloquear autofosforilación de EGFR y su señalización aguas abajo. Iressa suprime la actividad AURKA y la fosforilación de EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 (Figura 5C), lo que sugiere que AURKA puede servir como una diana aguas abajo de EGFR. Además de las células EGFR sobreexpresado, también mostró el estado de fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046 en las células mutantes L858R endógeno (H1975) en tratamiento de VE-465 y Iressa (Figura 5D). Se observó disminución de la pEGFR-Thr654 y -Ser1046 en H1975 con VE-465 tratamiento. Aunque Iressa inhibe pEGFR-Thr654 y -Ser1046 en H1975, la combinación de Iressa y VE-465 puede disminuir aún más pEGFR-Thr654 y -Ser1046 en H1975, lo que implica que estos dos sitios pEGFR estaban regulados tanto por EGFR y la actividad quinasa AURKA.
IHC análisis de AURKA, pEGFR-Thr654 y pEGFR-Ser1046 en la etapa I adenocarcinoma de pulmón
para evaluar más a fondo la relación entre AURKA y la fosforilación de EGFR, muestras de adenocarcinoma de pulmón I 25 etapa se sometieron a tinción IHC de pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 y AURKA (Figura 6). Dieciocho de estas muestras de NSCLC tenían
EGFR mutaciones
según lo determinado por análisis de la secuencia de la
EGFR dominios quinasa de tirosina
. La expresión de pEGFR-Ser1046 y AURKA fue significativamente mayor en tumores que en el tejido adyacente normal (p = 0,001) de 25 pacientes con CPNM (Tabla 2). Por otra parte, la expresión de AURKA mostró una correlación positiva con un coeficiente de correlación significativa con pEGFR-Thr654 (p & lt; 0,05) y pEGFR-Ser1046 (p & lt; 0,001) en los pacientes con
EGFR
mutante, pero no con
EGFR
-WT, como se analizó mediante la prueba de correlación no paramétrico de Spearman (Tabla 3). En resumen, esta tinción inmunoquímica proporciona evidencia de un posible vínculo entre AURKA y EGFR mutado a través -Thr654 y -Ser1046.
Cada columna indica un paciente y cada fila indica un anticuerpo. La intensidad de IHC en los pacientes se define como 0, 1 y 2 para AURKA, pEGFR-Thr654 y pEGFR-Ser1046 tinción.
En conclusión, la interacción entre AURKA y la EGFR-L858R mutante puede explicar la diferencia de caminos entre
EGFR
células en peso y mutante, que se observan con frecuencia en pacientes con CPNM, y por lo tanto pueden proporcionar información valiosa para aplicaciones terapéuticas.
Discusión de señalización
la desregulación en la vía EGFR activado se asocia a menudo con mutaciones en el receptor y predice la respuesta a los inhibidores de la tirosina cinasa en pacientes con NSCLC [48], [49]. El perfil de la fosforilación de EGFR en
EGFR mutantes
células de cáncer de pulmón sigue siendo poco clara. En este estudio, hemos (1) considerado sistemáticamente cambios de fosforilación de EGFR endógeno para identificar la dependencia EGF distinta en diferentes
EGFR
genotipos en las células de cáncer de pulmón; (2) demostró una novela relación entre AURKA y EGFR, lo que podría ser mediada a través de un evento de fosforilación-suscitó AURKA en EGFR-Thr654 y -Ser1046 en células de cáncer de pulmón; y (3) determinado la expresión de AURKA, EGFR-Thr654 y EGFR-Ser1046 en tejidos de adenocarcinoma de pulmón. Estos datos ponen de relieve la necesidad de un análisis más detallado de la relación entre EGFR y AURKA en
EGFR
pacientes -mutant y proporciona una nueva visión de la aplicación terapéutica de los inhibidores de AURKA en pacientes con cáncer de pulmón.
EGFR Thr654 se sabe que está fosforilado por la PKC y está implicado en la regulación negativa de la señalización de EGFR después de la estimulación de EGF [50], [51]. Por otra parte, la fosforilación de EGFR en el residuo se informó de Thr654 a estar asociada con la translocación nuclear EGFR inducida por la radiación, lo que promueve la proliferación celular y la metástasis mediante el aumento de la transcripción de la ciclina D1, iNOS y B-Myb [52] - [54]. Después de que la célula se somete a la radiación ionizante, la quinasa dependiente de ADN (DNA-PK) interactúa con EGFR y reparaciones no homólogas unión de los extremos de ADN de doble filamento se rompe nuclear, que causa radioresistance en radioterapia. En el presente estudio, el EGFR-Thr654 era constitutivamente fosforilada en células mutantes de EGFR-L858R. Sería de interés para examinar si EGFR-Thr654 fosforilación afecta radioresistance durante la radioterapia en las células mutantes de EGFR-L858R. Por otra parte, también hemos demostrado que un inhibidor AURKA disminuyó la fosforilación de EGFR-Thr654, lo que podría proporcionar una posible vía para una nueva estrategia clínica con un inhibidor de AURKA.
factores de estrés celular, como el TNF-α y la irradiación UV , se ha informado de inducir la fosforilación de EGFR-Ser1046 vía MAPK p38 y después causar la desensibilización EGFR con la estimulación de EGF y la endocitosis [55], [56]. En la activación de EGFR inducida por ligando, varios residuos de tirosina, por ejemplo, Tyr-1045 y Tyr-1068, son principalmente fosforilada. Grb2 se une a tirosina fosforilada para activar MAPKs. Posteriormente, las MAPKs fosforilan residuos de serina /treonina, tales como Ser-1046, en EGFR como un control de retroalimentación. La fosforilación de EGFR-Ser1046 por p38 también se determinó recientemente que ser una señal clave que impide la escisión de pro-apoptóticos de la caspasa y PARP en TNFa estimulación [57]. Tras la estimulación de EGF, EGFR está sólo ligeramente fosforilada en Ser1046 para proporcionar un efecto anti-apoptosis [57]. En este estudio, hemos demostrado que EGFR-Ser1046 fosforilación es EGF-independiente en las células mutantes de EGFR-L858R, mientras que EGFR-Ser1046 fosforilación es dependiente de EGF en las células EGFR-WT. Por lo tanto, si la fosforilación de EGFR-Ser1046 en EGFR-L858R células mutantes resultados en un anti-apoptóticos órdenes efecto mayor investigación.
células H1299-EGFR-L858R tienen un nivel de EGFR menor que en el H1299-EGFR-WT Células; sin embargo, los niveles de fosforilación basal de EGF-independiente en las células L858R en varios residuos de Ser, Thr, y Tyr son más fuertes que los de las células EGFR-WT (Figura 3). Esto indica que, mientras que el receptor mutante L858R mostró un nivel de expresión inferior, era hiper-fosforilado que el receptor de tipo salvaje. Por otra parte, EGFR L858R mutante se sabe que es más activo que el EGFR-WT en el estudio anterior [16]. En general, la fosforilación de EGFR en células L858R era menos sensible a EGF. Esto podría ser debido a los niveles de fosforilación basales superiores del receptor mutante o debido a su nivel de expresión inferior. Debido a que la señalización de EGFR puede aumentar la expresión de la proteína de AURKA [34], [35], AURKA también puede regular la fosforilación de EGFR. Aquí, hemos demostrado que la interacción EGFR-AURKA sólo se produjo después de la estimulación de EGF (Figura 4C), lo que implica que AURKA podría participar en cascada de señalización del EGFR. Dentro de la fase M-nocodazole detenidos, las células EGFR mutante mostraron fosforilación más evidente en EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 y AURKA-Thr288 que las células que expresan EGFR-WT (Figura 4E). la activación del EGFR se produce a través de la vía de AKT y EGFR puede regular al alza la expresión AURKA mediante la activación de la maquinaria de traducción a través de la vía de AKT [35]. El AURKA inhibidor de VE-465 suprime la vía de AKT y se inhibe EGFR serina /treonina, especialmente en las células que llevan
EGFR
mutaciones, pero no afectó a la fosforilación de tirosina de EGFR (Figura 5B). Cuando las células fueron tratadas con el inhibidor de EGFR Iressa para bloquear la autofosforilación de EGFR, la fosforilación de AURKA desapareció (Figura 5C), lo que sugiere que los mutantes de EGFR pueden activar constitutivamente fosforilación y mejorar la señalización aguas abajo para promover la carcinogénesis. Sin embargo, la relación de AURKA, EGFR-WT y EGFR mutante debe ser evaluada adicionalmente para identificar dianas terapéuticas para pacientes con cáncer de pulmón.
En resumen, mediante el perfilado de la fosforilación de EGFR de tipo salvaje y las células de cáncer de pulmón mutantes, hemos identificado una relación entre el
EGFR
mutaciones y la fosforilación de EGFR-Thr654 y -Ser1046, que se asoció con la expresión AURKA en pacientes con cáncer de pulmón y puede ser provocada por AURKA. La interacción entre EGFR y AURKA en
EGFR
células de mutación sugiere que los inhibidores de AURKA pueden tener impacto terapéutico. Anticipamos que este estudio facilitará el desarrollo de una estrategia terapéutica eficaz para el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, la sincronización del ciclo celular y la estimulación de EGF
La establecimiento de clones H1299 expresan de forma estable un vector vacío (H1299-Vec), EGFR-WT (H1299-EGFR-WT) o mutante de EGFR-L858R (H1299-EGFR-L858R) se describió anteriormente [16]. A549 (con EGFR-WT), H1975 (con endógeno mutado EGFR-L858R-T790M) y H1299 clones estables se cultivaron en medio RPMI-1640, y las células A431 se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fatal (FBS), 100 U de penicilina, 0,1 mg /ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina. Todos los reactivos de cultivo de células eran de Invitrogen. Para sincronizar el ciclo celular de A549 y líneas celulares de cáncer de pulmón H1975, de manera exponencial células en crecimiento se incubaron con 100 ng /ml nocodazole (Sigma) durante 16 horas. Para estimular las células con EGF, las células se privaron de suero durante 16 horas, seguido de un tratamiento de 10 minutos con EGF (10 ng /ml) en medio libre de suero.
análisis de inmunotransferencia
los lisados celulares (50 g) se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y posteriormente se transfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore) utilizando el sistema de transferencia de Bio-Rad. La membrana de PVDF se bloqueó con 5% no grasa de leche desnatada (BD Bioscience) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la incubación con el anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche. Todos los anticuerpos EGFR fosfo-policlonal (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101