Extracto
El dependiente de ciclina 1B inhibidor de quinasa (p27Kip1) es una proteína clave en la decisión entre la proliferación y la salida del ciclo celular . Las células quiescentes muestran p27Kip1 nucleares, pero esta proteína se exportan al citoplasma en respuesta a las señales proliferantes. Recientemente hemos informado de que el tratamiento catalasa aumenta los niveles de p27Kip1
in vitro
y
in vivo
en un modelo murino. Con el fin de caracterizar y ampliar estos resultados, se evaluó la regulación de p27Kip1 por el peróxido de hidrógeno (H
2O
2) en células de melanoma humano y melanocitos. Se observó un alto porcentaje de núcleos positivos p27Kip1 en células de melanoma sobreexpresan o tratados con catalasa exógena, mientras que los controles no tratados mostraron una localización citoplasmática de p27Kip1. A continuación, se estudiaron los niveles de p27Kip1 fosforilada (p27p) en la serina 10 (S10) y en la treonina 198 (T198), ya que la fosforilación en estos sitios permite la exportación nuclear de esta proteína, lo que lleva a la acumulación y la estabilización de p27pT198 en el citoplasma. Hemos demostrado por transferencia de western una disminución en los niveles de p27pS10 y p27pT198 en respuesta a H
2O eliminación
2 en células de melanoma, asociado con p27Kip1 nuclear. Los melanocitos también mostraron p27Kip1 nuclear y menores niveles de p27pS10 y p27pT198 que las células de melanoma, que mostraron p27Kip1 citoplasmática. También puso de manifiesto que la adición de H
2O
2 (0,1 M) a las células de melanoma detenidos en G1 por privación de suero induce la proliferación y aumenta los niveles de p27pS10 y p27pT198 que conduce a la localización citoplasmática de p27Kip1. Localización nuclear y las modificaciones post-traduccionales de p27Kip1 también se demostraron por tratamiento catalasa de carcinoma colorrectal y células de neuroblastoma, que se extiende nuestros hallazgos a estos otros tipos de cáncer humano. En conclusión, hemos demostrado en el presente trabajo que H
2O
2 de barrido impide la exportación nuclear de p27Kip1, permitiendo la detención del ciclo celular, lo que sugiere que las células cancerosas se aprovechan de su estado pro-oxidante intrínseca para favorecer la localización citoplasmática de p27Kip1 .
Visto: Ibáñez IL, Bracalente C, C Notcovich, Tropper I, Molinari BL, LL Policastro, et al. (2012) La fosforilación y localización subcelular de p27Kip1 regulada por modulación de peróxido de hidrógeno en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10.1371 /journal.pone.0044502
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Enero, 2012; Aceptado: August 8, 2012; Publicado: September 6, 2012
Copyright: © Ibáñez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT), Argentina (PICT 2007-01628 y PICT 05-14330) y la organización no lucrativa Fundación Florencio Fiorini. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vías de progresión del ciclo celular son el punto final de cascadas implicados en el crecimiento celular y la proliferación celular de señalización. ciclo celular está estrechamente coordinado por la unión secuencial y la activación de los complejos de proteínas quinasas específicas de fase [1], [2], formado por las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas (CDK), que también son reguladas por las proteínas INK4 y los inhibidores de CDK ( CDKIs). De tipo D ciclinas se expresan a través del ciclo en respuesta a mitógenos estimulación [2]. se requieren complejos de ciclina D-CDK4 y ciclina E-CDK2 para el paso de G1 a la fase S. El CDKI 1B (CDKN1B), también conocido como p27Kip1, se identificó primero como un regulador negativo crítico de CDK2 y G1 /S progresión del ciclo celular [2], [3]. Los niveles de este CDKI son altos en las células quiescentes, caen en respuesta a la estimulación mitogénica, mantendrá en los niveles de umbral en la proliferación de las células, y aumentar de nuevo cuando se retiran los mitógenos [2].
En los últimos años, se encontró que p27Kip1 está implicado en la regulación de otros procesos tales como la migración celular [4], junto con la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [5]. Curiosamente, esta proteína puede ejercer funciones tanto positivos como negativos en estos procesos [5]. Las actividades de p27Kip1 son controlados por su estado de concentración, localización subcelular y la fosforilación [5]. Por ejemplo, la fosforilación de p27Kip1 en la serina 10 (S10) media la exportación p27Kip1 al citoplasma [6] - [9], la fosforilación en la treonina 198 (T198) estabiliza la proteína en el citoplasma y aumenta la motilidad celular p27Kip1 dependiente [4 ] y la fosforilación en la treonina 187 (T187) señala p27Kip1 como un objetivo para la proteólisis por polyubiquitination [9] - [11]. La fosforilación de otros sitios de la proteína afecta importación nuclear de p27Kip1 y mejora del conjunto de la ciclina D1-cdk4 complejos [9], [12] - [15] o inicia la transición de p27Kip1 del inhibidor de la ciclina E-CDK2 al sustrato para proteólisis [16], [17]. Las alteraciones en la fosforilación p27Kip1 podrían conducir a la pérdida de la estabilidad, la función aberrante o deslocalización de la proteína que, a su vez, podría contribuir a [5] oncogénesis, [9]. En este sentido, tanto la pérdida de p27Kip1 nuclear y su localización citoplasmática se han propuesto como marcador pronóstico de la progresión del melanoma y peor resultado clínico [18].
Medio ambiente extracelular pueden iniciar la división del ciclo celular o detención activando o desactivando ciclina -CDK Complejos través de diferentes vías
especies reactivas de oxígeno (ROS) son capaces de ejercer diferentes efectos sobre las células de acuerdo con su naturaleza, localización y niveles [19]. En particular, muchos tipos de células de mamíferos pueden aumentar su crecimiento cuando son expuestos a niveles moderados de peróxido de hidrógeno (H
2O
2) y puede inducir la apoptosis [20], la diferenciación terminal [21] o la citotoxicidad [20] Si se expone a altos niveles de H
2O
2. Compactación de H
2O
2 en las células tumorales ya sea tratado con catalasa exógeno o expresar transfectadas catalasa inhibe la proliferación celular [22] - [25]. Está bien documentado que H
2O
2 está involucrada en las vías de transducción de señales [26], [27], por ejemplo, aumento de los niveles de H
2O
2 inducen señales mitogénicas, tales como las relacionadas con las quinasas reguladas por señales Ras /extracelular señales 1 y 2 (ERK1 /2) vía, y de respuesta al estrés, tales como los relacionados con c -jun quinasas N-terminal (JNKs) y de p38 proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) vías [26] - [28]. Por otra parte, ROS, y, en particular H
2O
2, fueron también implicada en la modulación de los receptores tirosina quinasas (RTK) [29] y la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt [30] vías.
se ha informado de que las fluctuaciones observadas en el estado redox intracelular durante la progresión del ciclo celular podrían vincular los procesos metabólicos oxidativos para la regulación del ciclo celular [31], [32]. H
2O
2 fluctuaciones a lo largo del ciclo celular se asociaron con la regulación de la expresión de ciclina D1 [33]. Por el contrario, la eliminación de endógeno H
2O
2 por la sobreexpresión de la catalasa y la glutatión peroxidasa induce la detención G0 /G1 [25] y disminuye la síntesis de ADN de las células [34]. Un estudio reciente de nuestro laboratorio mostraron niveles de p27Kip1 incrementa en respuesta al tratamiento catalasa en un modelo murino de carcinoma de células escamosas
in vitro
y
in vivo
[35]. Sin embargo, los mecanismos implicados en esta regulación de proteínas del ciclo celular mediante H
2O
2 no han sido completamente entendidos. Teniendo en cuenta que p27Kip1 fue propuesto como un biomarcador de pronóstico para melanoma humano [18], y que estos tumores exhibieron un comportamiento pro-oxidante, debido a un desequilibrio en el sistema antioxidante [36], [37] y a la desregulación de melanina [38], humana las células del melanoma se convierten en un modelo interesante a fin de ampliar nuestros resultados anteriores en H
2O
2 regulación de p27Kip1.
el objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos de la modulación de H
2O
2 en la transición G1 /S y, en particular, sobre la regulación de la proteína CDKI, p27Kip1, en el melanoma humano y líneas celulares de melanocitos. Hemos demostrado la relocalización intracelular de p27Kip1 después de catalasa o H
2O
2 tratamientos. Esto se asoció con variaciones en los niveles de p27Kip1 fosforilada en S10 (p27pS10) y T198 (p27pT198), que desempeñan un papel importante en la regulación de la localización subcelular de esta proteína. Resultados sobre la modulación p27Kip1 se extendieron a otros tipos de células de cáncer humano, carcinoma colorrectal y células de neuroblastoma. Nuestros hallazgos pueden proporcionar datos importantes para entender el efecto de H
2O
2 en la modulación de una proteína reguladora clave de transición G1 S /con el consiguiente efecto sobre el ciclo celular y la proliferación celular.
resultados
proliferación celular catalasa Tratamiento del melanoma inhibe por G1 Detención
Se ha sugerido que las células con un cambio oxidativo permanente en el estado redox pueden someterse a la proliferación continua que podría, a su vez, ser un importante evento en la aparición del fenotipo maligno [23], [39]. En este sentido, la producción de grandes cantidades de ROS y, en particular, H
2O
2, se informó en líneas de células tumorales [23], [40]. La catalasa es una enzima antioxidante que se descompone H
2O
2 en agua y oxígeno. Teniendo en cuenta que H
2O
2 puede difundir a través de membranas, la adición de catalasa al medio de cultivo podría producir una disminución en el nivel intracelular de H
2O
2 llegar a un estado estacionario inferior correspondiente concentración dentro y fuera de la célula [26], [33], [35]. Hemos validado nuestro modelo de células de melanoma tratados con catalasa añadió al medio de cultivo mediante la medición de la disminución de los niveles de ROS a través de 2 ', 7'-diacetato de ensayo dichlorodihydro-fluoresceína (DCFH-DA) (Figuras 1A y 1B). Esta disminución de los niveles de ROS inducidos por la catalasa dio como resultado una inhibición significativa (p & lt; 0,01) de la proliferación celular (Figura 2A). Además, las células A375 que sobreexpresan catalasa (A375-CAT-E9) muestran baja tasa de proliferación celular en comparación con las células control (Figura 2B). Este clon, A375-CAT-E9, mostró los niveles más bajos intracelular de ROS de los clones estables geneticina resistente generados (Figura S1A) y una disminución significativa en estos niveles en comparación con células transfectadas con un plásmido vacío (A375-pcDNA3) o no transfectadas (control A375) (figuras 1C y 1D). Estos resultados están de acuerdo con los niveles más altos de expresión de la catalasa y la actividad observada en A375-CAT-E9, en comparación con las células control (Figura S1B y S1C).
(A-D) los niveles intracelulares de ROS disminuyeron en células de melanoma, ya sea cuando son tratados con catalasa o cuando la sobreexpresión de la misma. (A) Histogramas representativos de DCF fluorescencia de las células de melanoma tratados con 500 (línea azul) y 1000 (línea naranja) U /ml de catalasa o sin tratar (línea verde) hacia la izquierda durante 24 h. Las células de control no expuestos a DCFH-DA (línea de color negro) y el control de las células tratadas con catalasa justo antes DCFH-DA incubación (línea roja). (B) DCF fluorescencia media (unidades arbitrarias) frente a la catalasa (CAT) de la dosis. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 frente a células no tratadas (0 U /ml de catalasa). (C) histogramas representativos de DCF fluorescencia de las células de melanoma que sobreexpresan la catalasa (CAT-A375-E9) y sus controles (A375-A375 pcDNA3 y células no tratadas). Las células de control no expuestas a DCFH-DA (línea de color negro), las células de control tratados con catalasa justo antes DCFH-DA incubación (línea roja) y las células se incubaron con DCFH-DA (línea verde). (D) DCF media de fluorescencia (unidades arbitrarias) de A375-CAT-E9, las células A375-pcDNA3 de control y A375. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 frente a control A375. (E-F) Las células de melanoma (A375) exhibieron mayores niveles de ROS intracelulares que su contraparte no tumoral (PIG-1 melanocitos). (E) histogramas representativos de DCF fluorescencia de las células de cerdo-1 y A375: células de control no expuestas a DCFH-DA (líneas negras), las células de control tratados con catalasa justo antes DCFH-DA incubación (línea roja) y las células se incubaron con DCFH- DA (línea verde). (F) DCF fluorescencia media (unidades arbitrarias) de PIG-1 melanocitos y células de melanoma A375. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 vs. PIG-1
tasa de proliferación (A) de la célula de las células de melanoma tratados con catalasa durante 24 h, en relación con las células control, evaluados mediante el ensayo de MTT.. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 frente al control. (B) la tasa de proliferación de A375-CAT-E9, las células A375-A375 pcDNA3 y control. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05 frente a control A375. (C) la tasa de proliferación de no tumoral (PIG-1) y las células tumorales (A375). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 vs. A375. análisis (D-I) del ciclo celular evaluada por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio. (D) Histogramas representativos de contenido de ADN de las células A375 de melanoma tratados con 1000 U /ml de catalasa (CAT) durante 24 h y las células de control de A375. (E) Porcentaje de células de melanoma en las diferentes fases del ciclo celular en respuesta al tratamiento CAT. Se utilizaron células de hambre FBS como el control de la detención en G1. (□) las células de control sin tratar, () 500 U /ml y (■) 1000 U /ml CAT) y células (FBS hambre. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 frente al control sin tratar. (F) histogramas representativos de contenido de ADN de CAT-A375-E9, las células A375-A375 pcDNA3 y control. (G) Porcentaje de A375-CAT-E9 (■), A375-pcDNA3 () y células de control A375 (Box) en las diferentes fases del ciclo celular. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt; 0,01 frente a control A375. (H) histogramas representativos de contenido de ADN de PIG-1 melanocitos y células de melanoma A375. (I) Porcentaje de (■) no tumoral (PIG-1) y (□) tumor (A375) de las células en las diferentes fases del ciclo celular. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P & lt;. 0.01 vs células PIG-1
Con el fin de evaluar no tumorales y las células tumorales en asociación con sus niveles de ROS intracelulares, se analizaron los melanocitos vs células de melanoma. La figura 2C muestra la tasa de proliferación de PIG-1 melanocitos en comparación con las células de melanoma A375. Se confirmó que las células tumorales mostraron altos niveles intracelulares de ROS que su contraparte no tumoral en este melanoma /modelo de melanocitos (Figuras 1E y 1F). No se observaron diferencias significativas en los niveles de ROS y en la tasa de proliferación (Figura S2) entre las células no tratadas y inactivado por calor catalasa tratados en el modelo de melanoma. Por lo tanto, inactivado por calor catalasa se utilizó como control.
Se encontró una detención significativa del ciclo celular G1 asociada con la inhibición de la proliferación celular en células de melanoma tratados con catalasa durante 24 h (Figuras 2D y 2E). Se observaron resultados análogos para el A375-CAT-E9 frente a las células de control A375 (Figuras 2F y 2G) A375-pcDNA3 o. Los melanocitos mostraron un mayor porcentaje de células en fase G1 y un porcentaje menor en la fase S de células de melanoma (Figuras 2H y 2I).
En cuanto a los niveles de las ciclinas y CDK implicados en la transición G1 /S, ciclina D1, ciclina e, CDK4 y CDK2, evaluadas por Western blot, se observó una disminución significativa en los niveles de ciclina D1 después de H
2O
2 de eliminación mediante el tratamiento de la catalasa o la sobreexpresión de la catalasa (Figura S3), de acuerdo con los resultados anteriores [35 ], [41].
Además, la señal para la ciclina D1 detectada por inmunofluorescencia fue extremadamente baja en el núcleo de las células tratadas con catalasa y una disminución significativa del porcentaje de núcleos positivos se encuentran en estas células en comparación con las células control (Figura S4). Las células de melanoma exhiben una cantidad más alta de los dos niveles de ciclina D1 y el porcentaje de núcleos positivos para ciclina D1, evaluada por Western blot y la inmunofluorescencia que su contraparte no tumoral PIG-1 (Figura S3 y S4), que se relaciona con el aumento de los niveles de ROS y el porcentaje de células A375 en fase S. No hay diferencias significativas en la ciclina E, se observaron niveles de CDK2 y CDK4 entre catalasa tratada y control de las células y entre no tumor y células tumorales (Figura S3). Por lo tanto, la disminución de los niveles de ciclina D1 observados estaría involucrado en G1 detención /S inducida por la catalasa en las células A375.
catalasa inducida por el tratamiento de localización nuclear de p27Kip1
Teniendo en cuenta la detención G1 inducida por la catalasa y la importancia de la localización subcelular de la proteína inhibidora de p27Kip1 por su actividad reguladora, el efecto de H
2O
2 de eliminación en la localización de esta proteína se estudió por inmunofluorescencia. Sorprendentemente, p27Kip1 fue localizada principalmente en el núcleo en las células de melanoma tratadas con o sobreexpresión de catalasa en comparación con los controles, en los que la distribución de p27Kip1 era predominantemente citoplásmica (Figuras 3A-3D). Además, los melanocitos mostraron un mayor porcentaje de células positivas p27Kip1 que la de las células de melanoma A375 (Figuras 3E y 3F). Esta proteína se localizó principalmente en el núcleo en las células no tumorales y en el citoplasma en las células tumorales (Figuras 3E y 3F).
(A-F) Localización subcelular de p27Kip1 evaluadas por inmunocitofluorescencia. Las células de melanoma (A-B) tratados con 500 y 1000 U /ml de catalasa (CAT) durante períodos de 6 o 24 h o se dejan sin tratar. Se utilizaron células de hambre FBS como el control de la detención en G1. (C-D) La catalasa modelo de sobreexpresión (células A375-CAT-E9) frente a los controles (A375-pcDNA3 y control de las células A375). (E-F) no tumorales (PIG-1) frente a células tumorales (A375). (A, C y E) Imágenes representativas de p27Kip1 inmunocitofluorescencia que muestran la localización subcelular de la proteína. DAPI: tinción de ADN nuclear; p27Kip1: tinción FITC de proteína p27Kip1. (B, D y F) Porcentaje de (□) citoplasmas positivas y positivas (■) núcleos para p27Kip1 relación con el número total de células contadas. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. (B) ** p & lt; 0,01 frente a control. (D) * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 frente a control A375. (F) * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 frente a células no tumorales. (G-H) El aumento de expresión de p27Kip1 nuclear en las células A375 después de 1000 tratamiento U /ml de catalasa (CAT) en comparación con células de control A375 (tratado con 1000 U /ml de catalasa inactivado por calor, IN-CAT) durante 24 h, detecta por transferencia de Western de extractos nucleares y citosólicas (ver Métodos). se muestran (G) inmunoblot imágenes representativas. C: extractos citoplasmáticos; N: Los extractos nucleares. Los valores de actina y Ku-70 densitométricos se utilizaron para normalizar citoplasmática y nuclear de proteínas de carga, respectivamente. (H) Los valores densitométricos relativas de (□) citoplasmática y los niveles de p27Kip1 nucleares (■). Los resultados se refieren a las células control. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt;. 0,05 frente a control
Con el fin de confirmar los efectos de H
2O
2 de eliminación de la localización p27Kip1 observado por inmunofluorescencia, los niveles de esta proteína en nuclear y citosólico extractos de células de melanoma tratados con catalasa se evaluaron por transferencia de Western. Hemos demostrado un aumento significativo de los niveles de p27Kip1 en extractos nucleares de células tratadas con catalasa, en comparación con el control (Figura 3G y 3H).
Estos resultados demuestran la modulación de la localización intracelular de p27Kip1 en la regulación de la proliferación celular por la catalasa y confirmar nuestros resultados anteriores [35], la ampliación de estos resultados a las células A375 humanas. La persistencia de p27Kip1 en el núcleo inducida por H
2O
2 eliminación favorecería el bloqueo de ciclo celular en G1 /S transición.
H
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2 Conduce a la modulación modificaciones post-traduccionales de p27Kip1
también demostró un aumento significativo en los niveles totales de p27Kip1 en respuesta al tratamiento de la catalasa o la sobreexpresión evaluado mediante transferencia Western (Figura 4). Esto podría estar relacionado con los altos niveles de p27Kip1 observados en el núcleo de las células catalasa tratados (Figura 3E). Por otra parte las células de melanoma mostraron niveles más bajos de esta proteína inhibidora en comparación con los melanocitos (Figura 4). En cuanto a transferencia de Western (Figura 4) e inmunofluorescencia (Figura 3) resultados y considerando que p27Kip1 niveles, la función y localización son regulados por fosforilaciones, los niveles de p27Kip1 fosforilados en S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) y T187 (p27pT187) en respuesta a H
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2 de barrido se evaluaron por Western blot. La fosforilación de p27Kip1 en S10 y T198 es un evento clave para la exportación nuclear de esta proteína y la progresión de ciclo celular y que demostró una disminución significativa en los niveles de p27pS10 y p27pT198 en células que sobreexpresan o tratados con catalasa, en comparación con los controles (Figura 4 ). Por otra parte, PIG-1 melanocitos revelaron niveles más bajos de p27pS10 y p27pT198 que su homólogo del tumor (Figura 4).
La expresión de p27Kip1 y p27Kip1 fosforilada en S10 (p27pS10) y T198 (p27pT198) fue analizada por Western Blot . (A-B) células A375 de melanoma tratados con catalasa (CAT) para 6 y 24 h. Se utilizaron células de hambre FBS como el control de la detención en G1. (C-D) La catalasa modelo de sobreexpresión (células A375-CAT-E9) frente a los controles (A375-pcDNA3 y control de las células A375). (E-F) no tumorales (PIG-1) frente a células tumorales (A375). (A, C y E) imágenes de inmunotransferencia representativos. (B, D y F) los valores densitométricos relativas de los niveles de p27Kip1 (), (□) y p27pS10 (■) p27pT198. valores densitométricos de actina se utilizaron para normalizar la carga de proteínas. Los resultados se refieren a controlar sin tratamiento (en B y D) y a las células (en F) no tumoral (PIG-1). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. (B) * p & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 frente al control sin tratar. (D) ** p & lt; 0,01 frente a control A375. (F) ** p & lt;. 0.01 vs células no tumorales
Estos hallazgos sugieren que la reducción de los niveles de H
2O
2 por la catalasa evitar la fosforilación de sitios específicos de p27Kip1 por lo tanto evitando la exportación nuclear de la proteína y que conduce a la detención del ciclo celular a través de la acumulación de p27Kip1 en el núcleo. Además, se evaluó la fosforilación de p27Kip1 en T187, que está implicada en el desencadenamiento de la proteolisis de esta proteína, en células de melanoma tratados con catalasa y no se observaron diferencias significativas frente a los controles no tratados (Figura S5).
Teniendo en cuenta que los factores de crecimiento activan H
2O
2 de producción que conduce a la activación de las vías que regulan la proliferación celular [27] de señalización, se evaluó la forma H
2O
2 está implicada en la modulación de p27Kip1 en G1- Las células A375 detenidos por inanición FBS incubadas con diferentes niveles de H
2O
2 durante 24 h. La Figura 5A muestra aumento de los niveles intracelulares de ROS en una forma dependiente de la dosis en las células tratadas con 0,1 a 10 mM H
2O
2 en comparación con células FBS hambre. Se ha informado anteriormente que la aplicación de 0,1-7 M H
2O
2 a las células cultivadas en resultados intracelular H
2O
2 niveles de aproximadamente 0,01-0,07 M y estimula directamente la proliferación celular. Por otro lado, cantidades crecientes de la muerte celular se producen con concentraciones aplicadas de H
2O
2≥10 mu M [revisado en 26]. En nuestro modelo celular, la incubación de las células de hambre FBS con 0,1 M H
2O
2 indujo un aumento en la tasa de proliferación en comparación con las células no tratadas FBS hambre. Por otro lado, no se observó efecto en la proliferación celular con las otras dosis de H
2O
2 utilizado (Figura 5B). Las células tratadas con 0,1 M H
2O
2 mostraron una distribución p27Kip1 predominantemente citoplasmática; similares a las células incubadas con 10% de FBS mientras p27Kip1 se encuentra principalmente en el núcleo en las células FBS hambre no tratados (Figuras 5C y 5D). La localización subcelular de esta proteína en las células tratadas con 0,01 M de H
2O
2 fue comparable al patrón observado en las células de hambre FBS y la adición de 1 a 10 mM de H
2O
2 A375 a las células de hambre FBS resultado en un porcentaje similar de p27Kip1 nuclear y citoplasmática (Figuras 5C y 5D). Western blots mostraron disminución de los niveles de p27Kip1 en células tratadas con 0,01 M de H
2O
2 en comparación con células FBS desnutridos y con las células tratadas con 0,1 a 10 mM de H
2O
2 (Figuras 5E y 5F). Los niveles de p27pS10 y p27pT198 en células tratadas con 0.1 M de H
2O
2 aumentó como en las células incubadas con 10% de FBS mientras que las células de hambre FBS mostraron bajos niveles de p27pS10 y p27pT198 (Figuras 5E y 5F). Por el contrario, no se encontraron diferencias significativas en los niveles de p27pT187 en las células tratadas con exógenos H
2O
2 (0,1 y 10 M) en comparación con las dos células de control FBS Starved y 10% de FBS incubó (Figura S5 ). Estos hallazgos sugieren que H
2O
2 en un nivel mitogénica de 0,1 M para nuestro modelo celular regula la fosforilación p27Kip1 que conduce a la localización citoplasmática de esta proteína y favoreciendo la proliferación celular.
melanoma células
(A375) crecido en medio completo con FBS al 10% de SFB fueron detenidos por inanición (0% de FBS) durante un periodo de 24 h, y después las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de h
2O
2 (0,01-10 mM) o para 10% de FBS. niveles (A) ROS intracelular medido por el ensayo de DCFH-DA. (B) la tasa de proliferación celular evaluada por el ensayo MTT. (C) Imágenes representativas de p27Kip1 inmunocitofluorescencia que muestran la localización subcelular de la proteína. DAPI: tinción de ADN nuclear; p27Kip1: tinción FITC de proteína p27Kip1. (D) Porcentaje de (□) citoplasmas positivas y (■) núcleos positivos para p27Kip1 relación con el número total de células contadas. (E) La expresión de p27Kip1, p27pS10 y p27pT198 analizados por Western blot. (F) Los valores relativos densitométricos de los niveles de p27Kip1 (), (□) y p27pS10 (■) p27pT198. valores densitométricos de actina se utilizaron para normalizar la carga de proteínas. Los resultados se refieren al control que se incubaron con 10% de FBS. (A, B, D y F) Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001 en comparación con las células incubadas con 10% de FBS;
#p & lt; 0,05,
## p & lt; 0,01 y
### p & lt; 0,001 frente a las células de hambre-FBS no-expuestos a H
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2
por lo tanto, hemos demostrado que H
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2 podría estar implicado en la modulación de las modificaciones post-traduccionales de proteínas reguladoras clave de p27Kip1 en células de melanoma.
catalasa también modula la proliferación celular y localización subcelular de p27Kip1 en carcinoma colorrectal y Neuroblastoma Cells
con el fin de extender los resultados observados para células de melanoma tratados con catalasa a otros tipos de células de cáncer humano, se evaluó la proliferación celular, el ciclo celular y p27Kip1 distribución intracelular en colorrectal El carcinoma (LoVo) y células de neuroblastoma (Paju). La caracterización de nuestros modelos celulares a nivel de ROS mostró que las células LoVo exhibieron niveles de ROS intracelulares bajas que Paju y las células A375 (Figura S6). Curiosamente, se observó una baja tasa de proliferación (p & lt; 0,01) tanto para las células Paju (Figura 6) LoVo y en respuesta a los niveles reducidos de ROS inducidos por la adición de catalasa a los cultivos celulares (Figura 6). células LoVo y Paju tratados con catalasa durante 24 h mostraron una detención del ciclo celular G1 significativa (Figura 6) asociada con una disminución en los niveles de ciclina D1 (Figura S7). De acuerdo con estos resultados, la señal para la ciclina D1 detectada por inmunofluorescencia fue extremadamente baja en el núcleo de las células tratadas con catalasa y una disminución significativa del porcentaje de núcleos positivos se encuentran en estas células en comparación con las células control (Figura S8). No hay diferencias significativas en la ciclina E, se observaron niveles de CDK2 y CDK4 entre las células tratadas con catalasa y no tratados (Figura S7).
células LoVo y Paju se trataron con 0 a 1.000 U /ml de catalasa (CAT) por 24 h. (A-B) los niveles de ROS intracelulares determinados por ensayo de DCFH-DA. (A) Histogramas representativos de DCF fluorescencia de las células tratadas con 500 (línea azul) y 1000 (línea naranja) U /ml de catalasa o sin tratar (línea verde) hacia la izquierda durante 24 h. Las células de control no expuestos a DCFH-DA (línea de color negro) y el control de las células tratadas con catalasa justo antes DCFH-DA incubación (línea roja). (B) DCF fluorescencia media (unidades arbitrarias) frente a la dosis catalasa. tasa de proliferación (C) de la célula de las células LoVo y Paju tratados con catalasa durante 24 h, en relación con las células control, evaluada por el ensayo de MTT. (D-E) Análisis del ciclo celular evaluada por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio. (D) Histogramas representativos de células de contenido de ADN tratados con catalasa (CAT). (E) porcentaje de células en las diferentes fases del ciclo celular en respuesta al tratamiento CAT. Se utilizaron células de hambre FBS como el control de la detención en G1. (□) las células de control sin tratar, () 500 U /ml y (■) 1000 U /ml CAT) y células (FBS hambre. (B, C y E) Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0,01 vs. control
(A y B) la localización nuclear de p27Kip1 con catalasa (CAT) se detectó por inmunocitofluorescencia. (A) Imágenes representativas de p27Kip1 inmunocitofluorescencia que muestran la localización subcelular de la proteína. DAPI: tinción de ADN nuclear; p27Kip1: tinción FITC de proteína p27Kip1. (B) Porcentaje de citoplasmas positivos (Box) y los núcleos positivos (■) para p27Kip1 relación con el número total de células contadas. (C y D) Aumento de los niveles de p27Kip1 y disminución de p27Kip1 fosforilada en S10 (p27pS10) y T198 (p27pT198) en respuesta a H
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2 de barrido, se analizó mediante western blot. (C) Las imágenes representativas de inmunoblot. (D) los valores densitométricos relativas de () los niveles de p27Kip1, (□) y p27pS10 (■) p27pT198. valores densitométricos de actina se utilizaron para normalizar la carga de proteínas. Los resultados se refieren a controlar sin tratamiento. (B y D) Los datos se expresan como media ± desviación estándar. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 frente al control sin tratar. (A-D) FBS células de hambre fueron utilizados como control de detención en G1.
células de carcinoma colorrectal y de neuroblastoma tratados con catalasa también mostraron p27Kip1 localizada principalmente en el núcleo en comparación con los controles, en el que la distribución p27Kip1 era predominantemente citoplásmica (Figuras 7A y 7B muestran los tratamientos por 24 h y las figuras S9a y S9B Mostrar tratamientos durante 6 h). Además, hemos demostrado por transferencia de western un aumento significativo en los niveles de p27Kip1 en respuesta al tratamiento catalasa tanto para LoVo y Paju células (tratamientos Figuras 7C y 7D para 24 h y figuras tratamientos S9C y S9D de 6 h). Finalmente, reproducido una disminución significativa en los niveles de p27pS10 y p27pT198 en células de carcinoma colorrectal y de neuroblastoma tratadas con catalasa, en comparación con los controles (tratamientos Figuras 7C y 7D para 24 h y las figuras tratamientos S9C y S9D de 6 h).
Estos resultados confirmaron y ampliaron nuestros resultados anteriores. Sugerimos que ROS disminuir en diferentes células de cáncer humano por la catalasa regula la localización subcelular de p27Kip1 evitando la fosforilación de la proteína en sitios clave (S10 y T198) que conduce a la acumulación de p27Kip1 en el núcleo que favorece la detención del ciclo celular.