Extracto
Fondo
La galectina-3 es conocido para regular la metástasis del cáncer. Sin embargo, el mecanismo subyacente no se ha definido. A través de los estudios de microarrays de ADN después de la galectina-3 silenciamiento, hemos demostrado aquí que la galectina-3 juega un papel clave en hasta la regulación de la expresión de la proteasa activada por receptor-1 (PAR-1) y la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1) PAR-1 promoviendo así la metástasis del cáncer gástrico.
Metodología /Principales conclusiones
Se examinaron los niveles de expresión de galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en tejidos de pacientes con cáncer gástrico y también los efectos de silenciamiento de estas proteínas con siRNAs específicos y de sobre-expresión de ellos usando construcciones Lenti-virales específicos. También empleamos modelo de embrión de pez cebra para el análisis de los
in vivo
la invasión de células de cáncer gástrico. Estos estudios demostraron que: a) la galectina-3 silenciamiento disminuye la expresión de PAR-1. b) la galectina-3 sobre-expresión aumenta la migración celular y la invasión y este aumento puede ser revertido por PAR-1 silenciamiento, lo que indica que la galectina-3 aumenta la migración celular y la invasión a través de PAR-1 regulación. c) la galectina-3 interactúa directamente con AP-1 factor de la transcripción, y este complejo se une a PAR-1 promotor y conduce PAR-1 de transcripción. d) la galectina-3 también amplifica fosfo-paxillin, un objetivo corriente abajo PAR-1, mediante el aumento de MMP-1 de expresión. MMP-1 bloquea silenciamiento fosfo-paxillin amplificación y la invasión celular causada por la galectina-3 sobre-expresión. e) El silenciamiento de cualquiera de galectina-3, PAR-1 o MMP-1 redujo significativamente la migración de las células en los vasos en el modelo de embrión de pez cebra. f) La galectina-3, PAR-1 y MMP-1 son altamente expresado y co-localizan en los tejidos malignos de pacientes con cáncer gástrico.
Conclusiones /Importancia
galectina-3 desempeña la tecla papel de la activación de receptor de la superficie celular a través de la producción de la proteasa y aumenta la metástasis del cáncer gástrico. La galectina-3 tiene el potencial de servir como una diana farmacológica útil para la prevención de la metástasis del cáncer gástrico
Visto:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Parque SH, et al. (2011) La galectina-3 Facilita la motilidad celular en el cáncer gástrico por encima de regulación activado por proteasa del receptor-1 (PAR-1) y MMP-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10.1371 /journal.pone.0025103
Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de génomique Fonctionnelle de Lyon, Francia |
Recibido: 18 de mayo de 2011; Aceptado: 23 Agosto 2011; Publicado: 22 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro Nacional del cáncer (NCC) de la República de subvención Corea (NCC-0.910.150 y NCC-0810060), Innovative Research Institute de Terapia celular, República de Corea (A062260) y esta investigación fue apoyada por el Programa de investigación Basic442 Ciencia a través de la Fundación nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (1031790-1), República de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cánceres que se diseminan (metástasis) desde su sitio original a otra zona del cuerpo, se llaman cánceres metastásicos. cánceres metastásicos tienen mal pronóstico y alta mortalidad [1]. Una comprensión completa del mecanismo biológico (s) que participan en la metástasis y procedimientos racionales para prevenir o controlar la metástasis puede conducir a enfoques prácticos para mejorar la tasa de supervivencia de los pacientes que sufren de cáncer metastásico. En estudios previos, se encontró que la galectina-3 aumenta gástrico motilidad de células de cáncer por hasta la regulación de fascin-1, una proteína del citoesqueleto de actina agrupación [2]. La galectina-3 es una proteína de 31 kDa de hidratos de carbono de reconocimiento, implicado en la tumorigénesis, crecimiento de células cancerosas y la metástasis [3], [4], [5] y su alta expresión en varios tipos de cáncer humanos se ha encontrado que se correlaciona con el mal pronóstico de cánceres metastásicos.
Para aclarar el papel de la galectina-3 en la metástasis del cáncer, hemos derribado su expresión en células de cáncer gástrico utilizando su siRNA y examinaron los resultados en la expresión génica de análisis de microarrays de ADN [6]. Entre los resultados anteriores, se encontró una reducción significativa en el nivel de la proteasa activada por receptor-1 (PAR-1), un miembro de la familia de receptores transmembrana acoplados a la proteína G [7], y su activador, metaloproteasa de matriz-1 ( MMP-1) (Figura S1). Cleaved PAR-1 es auto-fosforilados y transducidas por señal extracelular (s) a través de diversas vías, y juega un papel crítico en la metástasis tumoral [7], [8], [9]. La sobreexpresión de PAR-1 ha sido reportado en varios tipos de cáncer, incluyendo melanomas y cánceres de mama, gástrico. MMP-1 es también regulado hasta en una amplia variedad de cánceres avanzados, y una correlación negativa significativa se ha observado entre su expresión y la supervivencia de los pacientes [10], [11], [12], [13]. También varios estudios encontraron que la MMP-1 juega un papel crucial en la metástasis del cáncer de mama [14], el hígado y los cánceres de colon [15], y el cáncer gástrico [16], [17], entre otros. Parece ser que una vez secretado, MMP-1 promueve la invasión de células de cáncer a través de la degradación de matrices extracelulares y /o capas submucosas de vasos linfáticos [10], [14]. Numerosos estudios han demostrado que la inhibición de MMPs conduce a la inhibición de la invasión de células [18], [19].
hallazgos stos nos llevó a formular la hipótesis de que la galectina-3, PAR-1 y MMP-1 puede estar implicado en el aumento de la migración y la invasión del cáncer gástrico. Para probar esta hipótesis, se realizaron estudios por su papel en células de cáncer gástrico. En ambos
in vitro
y
in vivo
estudios, se utilizó el modelo de embrión de pez cebra para determinar sus efectos sobre la migración y la invasión de las células cancerosas con orgánulos que viven. También determinamos los niveles de expresión de galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en tejidos malignos de pacientes con cáncer gástrico para las correlaciones clínicas entre estas proteínas en muestras humanas.
Resultados
Cómo silenciar la galectina -3 o PAR-1 reduce la migración y la invasión de células de cáncer gástrico humano
los niveles de expresión de galectina-3 y PAR-1 eran elevados en líneas celulares de cáncer más gástricos. Silenciamos la galectina-3 y PAR-1 en las células MKN-28 que emplean los respectivos siRNAs. El tratamiento con galectina-3 siRNA disminución de los niveles de expresión de ambos galectina-3 y PAR-1, mientras que PAR-1 ARNsi tratamiento sólo disminuyó PAR-1 de expresión, mientras que no se observó ninguna diferencia en la galectina-3 (Figura 1A). La transfección de células SNU-638, que muestran originalmente no expresión de galectina-3, con la galectina-3-codificación plásmido dio como resultado un aumento de la expresión tanto de PAR-1 y galectina-3 (Figura 1B). Silenciando ya sea la galectina-3 o PAR-1 reduce el número total de migrar (
p Hotel & lt; 0,001) (Figura 1C) y la invasión de las células (
p Hotel & lt; 0,001) (Figura 1D), casi a la mitad. Estos datos mostraron que la galectina-3 aumentó PAR-1 y la expresión tanto de la galectina-3 y PAR-1 modulada la migración de células de cáncer gástrico y la invasión.
A, ARNm y la expresión de proteínas después de la transfección los niveles de cáncer gástrico humano MKN- 28 células con 20 nM scARN, o ARNip de la galectina-3 o PAR-1. Total RNA y proteínas obtenidas después de la transfección durante 48 horas. Las células se recogieron y se analizaron por RT-PCR y Western Blot. β-actina se utilizó como control de carga. B, niveles de proteína de la galectina-3 y PAR-1 por el Western Blot después de la transfección con pcDNA3.1 /NT-GFP-galectina-3 y el control de vectores de pcDNA3.1 /NT-GFP en células SNU-638. C, ensayo de migración de la célula lleva a cabo de la galectina-3 o PAR-1 en las células MKN-28 silenciados. Los resultados estuvieron presentes como un histograma (*
p Restaurant & lt; 0,001 frente a grupo Cont), y los teléfonos fotos de los ensayos de migración celular. D, histograma estaba presente que los ensayos de invasión de células de la galectina-3 o PAR-1 en células MKN-28 con silenciador (*
p Hotel & lt; 0,001 frente a grupo Cont).
la galectina-3 mejora la migración de células de cáncer gástrico /invasión mediante el aumento de PAR-1 expresión
se examinó la relación entre los aumentos inducidos por la galectina-3 en la migración celular y la invasión por un lado y PAR-1 expresión en el otro mano. Estamos infectados SNU638 células con un lentivirus que contiene el casete de expresión de galectina-3, y examinamos la expresión de galectina-3 y PAR-1, y la migración celular medido. Encontramos que la sobre-expresión de galectina-3 ha estado acompañado por el aumento de expresiones PAR-1 ARNm y proteínas (Figura 2A), así como la migración celular (
p Hotel & lt; 0,001) (Figura 2B) y la invasión celular (
p Hotel & lt; 0,001) actividades (Figura 2C). Estos incrementos se redujeron en un PAR-1 silenciamiento. Estos resultados sugieren que la galectina-3 promueve la migración y la invasión de células de cáncer gástrico a través de la regulación de PAR-1.
A, ARNm y los niveles de proteína de la galectina-3 y PAR-1 detectada por RT-PCR y análisis de transferencia Western en las células SNU-638, infectadas con lenti-virus que contiene LacZ o galectina-3, a continuación, transfectadas con PAR-1 siRNA o scARN para un control negativo. β-actina se utilizó como control de carga. B y C, Migración (B) y ensayos de invasión (C) se llevaron a cabo de las células SNU-638 infectadas con lenti-virus que contiene LacZ o células galectina-3, a continuación, transfectadas con PAR-1 siRNA o scARN para un control negativo. Los resultados se muestran como histograma (*
p Hotel & lt; 0,001 frente a grupo Cont). D, Modelo esquemático del PAR-1 promotor con la AP-1 sitio de unión, Los cebadores utilizados para chip de ensayo fueron preparados para detectar AP-1 sitio de unión (-463~-474) a partir de -666 a -307. E, galectina-3 interactúa con c-Jun y fra-1 (como, un complejo AP-1 [20]) en MKN-28 células. La inmunoprecipitación se realizó tal como se describe en "Materiales y Métodos", y luego la galectina-3, c-Jun y fra-1 detectada por Western blot. Lisados de células enteras (WCLs) se utilizaron como control positivo. F, Análisis de ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina utilizando anticuerpos para la galectina-3, c-Jun y Fra-1 en las células MKN-28 transfectadas con scARN y galectina-3 siRNA. Cebador de PCR para el promotor del gen de PAR-1 se utilizó para detectar fragmento del promotor en los inmunoprecipitados. carril de entrada, el ADN genómico total utilizado como control para la reacción de PCR. G, la actividad de la luciferasa de la AP-1 en lacZ y el exceso de células que expresan galectina-3. Ensayo de la luciferasa se realizó mediante AP-1 de expresión de luciferasa vector de transfección a lacZ y la galectina-3 que sobreexpresan las células (*
p Hotel & lt; 0,001 frente Cont). β-galactosidasa se utilizó como control negativo.
La galectina-3 promueve PAR-1 transcripción a través de la interacción con el complejo AP-1
Luego trató de dilucidar cómo la galectina-3 regula PAR expresión -1. Debido a que se informó de que la AP-1 actividad transcripcional está regulada por la galectina-3 [20], nos hemos centrado en el papel de este factor de transcripción en este sentido (Figura 2D). Realizamos estudios de inmunoprecipitación y determinamos que la galectina-3 interactuaron directamente con tanto Fra-1 y c-Jun en el complejo AP-1, y que esta interacción se asoció con la sobre regulación de la AP-1 actividad transcripcional (Figura 2E). A continuación, se analizó la actividad de unión al ADN de la AP-1 con y sin la galectina-3 mediante ensayos de chip (Figura 2F). Se encontró que el AP-1 complejo unido el promotor de PAR-1 en presencia de galectina-3, pero no en su ausencia. También se evaluó la actividad transcripcional de AP-1 mediante el ensayo de la luciferasa después de la transfección de un plásmido indicador que contiene AP-1 secuencia de unión delante de un promotor mínimo de luciferasa-conducción en LacZ o galectina-3 que sobreexpresan las células SNU-638 (
p Hotel & lt; 0,001) (Figura 2G). La actividad transcripcional de AP-1 aumentó significativamente en la galectina-3 sobre-expresión de las células, pero no en LacZ sobre-expresión de células. Estos resultados sugieren que la galectina-3 facilitó la unión del promotor de PAR-1 mediante la interacción con AP-1 compleja, lo que aumenta PAR-1 de expresión por regulación de la transcripción.
galectina-3 aumenta la expresión de MMP-1 y la activación de PAR-1 de señalización
MMP-1 se ha informado de regular la activación de PAR-1 a través de la escisión de PAR-1 de señalización intracelular conectado al ordenador, y para influir en la invasión de células [21]. Tal como se presenta en la Figura S1, hemos demostrado que la galectina-3 regula la expresión de MMP-1. Por lo tanto, confirmamos las interrelaciones de la galectina-3, MMP-1 y PAR-1. Se analizaron los niveles de expresión de mRNA de MMP-9, que es un objetivo corriente abajo de PAR-1 [8], después de silenciar la galectina-3, MMP-1 y PAR-1 individual (Figura 3A). Mientras que la galectina-3 silenciamiento reduce la expresión de las tres moléculas (MMP-1, PAR-1 y MMP-9), MMP-1 silenciamiento reduce sólo MMP-9 expresión y no los de la galectina-3 o PAR-1. Curiosamente, PAR-1 silenciamiento produce los mismos efectos que la MMP-1 silenciamiento. También se detectó la fosforilación de la proteína del citoesqueleto paxillin (pY181), un sello distintivo de PAR-1 de activación [22], [23]. Después de silenciar la galectina-3, MMP-1 y PAR-1 de forma individual, se disminuyó la phosphorylaion de paxillin, lo que sugiere la galectina-3 también regulado actividad PAR-1. También se verificaron la reducción de la actividad de MMP-9 después de silenciamiento de la galectina-3, MMP-1 y PAR-1 individual (Figura 3A).
A, la galectina-3, PAR-1, MMP-1 y MMP-9 mRNA y la galectina-3, PAR-1, MMP-1, los niveles de fosfo-paxilina (pY181) y proteínas paxillin después de la transfección con scARN o cada siRNAs de galectina-3, PAR-1, MMP-1 en MKN-28 Células. El ARN total y proteínas obtenidas después de la transfección durante 48 horas y se recogieron las células y se analizaron por RT-PCR y Western blot. la actividad de MMP-9 se ensayó mediante zimografía de gelatina usando el medio de MKN-28 células. B, los niveles de expresión de ARNm de la galectina-3, PAR-1 y MMP-1 por RT-PCR; los niveles de expresión de proteínas de la galectina-3, PAR-1, MMP-1, fosfo-paxillin (pY181) y paxillin por análisis de transferencia Western en las células SNU-638, que fueron infectadas con lenti-virus que contiene LacZ o galectina-3, y luego transfectadas con MMP-1 siRNA o scARN para un control negativo. C, ensayo de invasión de las células SNU-638 infectadas con lenti-virus que contiene LacZ o células galectina-3, a continuación, transfectadas con MMP-1 siRNA o scARN para un control negativo. Los datos se presentan como histograma (*
p Hotel & lt; 0,001 frente a grupo Cont).
La galectina-3 que sobreexpresan SNU638 células mostraron un incremento en los niveles de expresión de MMP-1 y proteína de PAR-1, así como sus mRNAs, además de paxillin fosforilada (pY181). En estas células, MMP-1 silenciamiento reduce la fosforilación de paxilina sin cambiar la expresión de galectina-3 o PAR-1 (Figura 3B). Además, MMP-1 silenciamiento reduce la invasión de células, que se desencadena por la galectina-3 sobre-expresión (
p
& lt; 0,001) (Figura 3C), lo que implica que la galectina-3 aumentó MMP-1 que conduce a la expresión la activación de PAR-1 de señalización.
la sobreexpresión de MMP-1 en células de cáncer aumenta la invasión de células a través de la activación de PAR-1 de señalización
Se confirmó que la regulación de MMP-1 por galectina-3 que es importante para la activación de PAR-1 de señalización y aumento de la invasión de células de cáncer gástrico. A lentivirus (pLECE3 Vector) que contiene MMP-1 casete de expresión regulada por el promotor de CMV se preparó y se infectó en células de cáncer gástrico AGS (Figura 4A-B). Como era de esperar, MMP-1 sobre-expresión aumentó el potencial de invasión de células de cáncer gástrico, y PAR-1 silenciamiento invierte significativamente este aumento (
p
& lt; 0,001) (Figura 4B). Esto también fue confirmado por el hecho de que la sobre expresión de MMP-1 aumentó la fosforilación de paxilina, y que el silenciamiento adicional de PAR-1 bloquea dicha fosforilación (Figura 4A). En MMP-1 células que sobreexpresan, galectina-3 silenciamiento reduce la expresión de PAR-1, pero no la de MMP-1, y también la fosforilación de paxilina y potencial invasivo de células (Figura 4A-B). Estas observaciones sugirieron que la sobre expresión de MMP-1 aumentó invasividad de células de cáncer mediante la activación de PAR-1 de señalización. En conjunto, estos resultados sugieren que la galectina-3 incrementó la expresión tanto de PAR-1 y MMP-1, y que el aumento de la MMP-1 activada expresión PAR-1 de señalización, que a su vez, facilita la invasión de células de cáncer. Estos eventos se representan esquemáticamente en la Figura 4C.
A, expresión de la proteína de la galectina-3, PAR-1, MMP-1, los niveles de fosfo-paxilina (pY181) y paxillin se midieron por análisis de transferencia Western, después de la infección con la construcción lenti-viral que contiene pLECE3 (sólo vector) y pLECE3-MMP-1 en las células AGS, transfectadas con PAR-1 siRNAs galectina-3 o. B, la invasión de la célula realizado por las células anteriores presente como un histograma (*
p Hotel & lt; 0,001 frente a grupo Cont). C, Galecitn-3 mejora PAR-1 de expresión a través de la unión con la AP-1 factor de transcripción, también, la regulación de la galectina-3 de la MMP-1 de expresión. MMP-1 aumento provoca efectos duales en la invasión del cáncer gástrico; 1) la escisión del PAR-1 ligando atado y PAR-1 de activación 2) la degradación de las matrices extracelulares (ECM).
El silenciamiento de galecin-3, PAR-1 o MMP-1 bloquea celular de cáncer gástrico la migración
in vivo
en un modelo de pez cebra
pez cebra transgénico,
Tg (kdrl: EGFP)
s843
[24], expresa EGFP específicamente en la vasculatura. Los embriones de pez cebra son transparentes correspondientes con los vasos fluorescentes verdes. Empleamos estos peces para llevar a cabo
in vivo
estudios de la migración de células de cáncer gástrico humano (Figura 5A). Cuando el rojo fluorescente marcada células AGS se inyecta en el saco vitelino de los embriones de pez cebra a las 48 HPF (horas después de la fertilización), la mayoría de las células AGS transplantados fueron ubicados en el centro del saco vitelino de los embriones por 4 horas después del trasplante ( HPT). Después de 26 hpt, tanto las células normales y transfectadas scARN emigraron a la región del tronco, y residían en el recipiente de tronco y /o la cola de los embriones a los 50 HPT. Sin embargo, el número de células AGS migrados, en el que cada uno de galectina-3, son silenciados PAR-1 o MMP-1, se redujo significativamente (Figura 5B). También se contó el número de embriones de pez cebra que muestran células que migran y se muestran los resultados (Figura S2). Ochenta y cuatro a la el noventa por tres por ciento de embriones de pez cebra, que fueron trasplantados con células de control o scARN células tratadas las células que migran mostradas en sus vasos del tronco y de la cola a 50 HPT. Sin embargo, sólo un 7 a un 11% de los embriones que fueron trasplantados con células en las que fueron silenciadas galectina-3, PAR-1 o MMP-1, muestra la migración de las células. Estos resultados sugirieron que primero, el modelo de embrión de pez cebra se pueden utilizar para controlar la migración de células de cáncer gástrico como un animal vivo, y segundo, que el silenciamiento de cada uno de galectina-3, PAR-1 y MMP-1 causó una reducción significativa en la migración de células de cáncer gástrico
in vivo
.
a, a 53 horas después de la fecundación (hPF), las células trasplantadas, que AGS transfectadas galectina-3, PAR-1, MMP-1 siRNA y scARN (rojo) se encuentra en el centro del saco vitelino de vida del pez cebra transgénico en el que los vasos embrionarios se visualizan con fluorescencia verde a las 4 horas después del trasplante (HPT); hasta el 50 TPM fueron claramente detectado solamente las células cancerosas. B, Se contó el número de células migradas por embrión, y se muestra como histograma. Estos datos se obtuvieron a partir de tres experimentos replicados.
Las barras de escala
, 200 micras y 50 micras en los últimos paneles. C y D, el aumento de expresión de galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en pacientes con cáncer gástrico. C, expresión y localización de la galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en tejidos malignos de pacientes con cáncer gástrico utilizando staing inmunohistoquímica (marrón) con H & amp; E por microscopía de fluorescencia. Ampliación: (panel superior) x 200; (Panel inferior) x 400. D, el ARNm de la galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en los niveles en los tejidos de pacientes con cáncer gástrico detectados por RT-PCR (Figura S3). tejidos malignos y normales se obtuvieron de 20 pacientes gástricos sometidos a RT-PCR, cuantifican y se analizaron mediante analizador de imágenes NIH. Altos niveles de expresión de galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en tejidos malignos se muestran como porcentaje aumenta más de sus niveles en los tejidos normales.
Expresiones de la galectina-3, PAR-1 y MMP -1 son elevados, de forma paralela, en los tejidos malignos de los pacientes con cáncer gástrico
se determinó los niveles de mRNA y de expresión proteica de la galectina-3, PAR-1 y MMP-1 en tejidos normales y malignos de 20 gástrica pacientes con cáncer, a continuación, emplean RT-PCR utilizando un analizador de imagen J. Como se muestra en la figura 5C y la figura S3, 73,7% de los pacientes de cáncer mostró mayores niveles de expresión de galectina-3 y 70% de ellos mostraron mayores niveles de PAR-1 y MMP-1 en sus tejidos malignos que en sus homólogos normales. Por otra parte, entre la galectina-3 pacientes positivos, el 71,4% eran también PAR-1 positivo, mientras que el 64,3% eran también MMP-1 positivo (Figura 5D). Estos datos indicaron que hay un aumento paralelo en la expresión de galectina-3, así como PAR-1 y MMP-1, en los tejidos gástricos malignos. También se encontró que estas proteínas co-localizados en las áreas malignos de los tejidos, y no en las zonas no malignos (Figura 5C). La galectina-3 estaba presente tanto en el citosol y el núcleo, mientras que PAR-1 y MMP-1 se observaron generalmente en el citosol y la membrana dentro de la misma zona (Figura 5C). Estos hallazgos sugieren que ambas expresiones PAR-1 y MMP-1 se correlacionaron significativamente con galctin-3 en pacientes con cáncer gástrico.
Discusión
Este estudio demostró que la galectina-3 mejorado la migración celular de cáncer gástrico y la invasión. Mecánicamente, este ligado galectina-3 para la regulación de receptor de la superficie-1 PAR celular, y la actividad de MMP-1 proteasa. Esto está de acuerdo con los informes que demuestran una correlación entre la expresión de PAR-1 y la invasión tumoral y la metástasis en gástricas y varios otros tipos de cáncer [25], [26], [27]. Este estudio es el primero en demostrar una interacción directa de la galectina-3 y AP-1 componentes complejos, c-Jun y Fra-1, y la regulación de la expresión de PAR-1 por AP-1 factor de transcripción. Dado que ya se ha demostrado por otros que la sobre-expresión de Fra-1 promueve la invasión de las células del cáncer y la metástasis [28], sobre regulación de PAR-1 por c-Jun y Fra-1 parecía ser un posible mecanismo que explica la vinculación de la galectina-3 inducida sobre regulación de receptor de la superficie celular PAR-1, y la actividad de MMP-1 proteasa. Esta posibilidad es apoyada por nuestra conclusión de las expresiones paralelas y co-localizada de la galectina-3 y PAR-1 en tejidos malignos de pacientes con cáncer gástrico.
Es una nueva observación de que los aumentos de galectina-3 MMP-1 de expresión . Claramente, la sobre-expresión de MMP-1 puede aumentar la actividad de la invasión de células de cáncer gástrico mediante el bloqueo de célula a célula y célula a las interacciones de la matriz por la degradación de ECM. Por lo tanto, un aumento de la MMP-1 expresión promovida por galectina-3 podría tener efectos duales, es decir, PAR-1 de activación y la degradación de ECM, y ambos son críticos para la metástasis del cáncer gástrico. Sin embargo, cómo la galectina-3 regula MMP-1 de expresión todavía no está claro, ya que la expresión de MMP-1 está regulada por una serie de eventos complejos incluyendo la diafonía entre varios factores de transcripción, tales como-1 AP, transductor de señales y activador de la la transcripción-3, MAP quinasa, y la hipoxia-inducible factor-1 de la hipoxia [29], [30], [31].
Establecer el pez cebra (
Danio rerio
) modelo de embrión el estudio de la migración y la invasión de células de cáncer gástrico es una realización particular de este estudio porque los modelos animales adecuados no estaban disponibles para el estudio de la metástasis del cáncer gástrico humano hasta ahora. El modelo de pez cebra para el estudio de cáncer de ingeniería genética y /o xenoinjertos de tumores, tiene muchas ventajas, incluyendo viabilidad de hacia delante y los análisis de genética inversa, la transparencia de los embriones [32], y la idoneidad para el etiquetado GFP de los vasos [32], [33], [34]. Este estudio mostró que la etiqueta RFP células de cáncer gástrico invadieron los vasos sanguíneos, mientras que la galectina-3, MMP-1 o PAR-1 silenciada células de cáncer gástrico no podía. Por lo tanto, el embrión de pez cebra parece ser un modelo prometedor para el estudio de la invasión y la metástasis de las células cancerosas, aunque otros estudios son claramente necesarios para confirmar este hallazgo.
En conclusión, nuestros estudios demostraron que la galectina-3 acelera el cáncer gástrico la motilidad celular por hasta la regulación de PAR-1 y MMP-1. Otros estudios son claramente necesarios para establecer el papel de la galectina-3 en la metástasis del cáncer y su idoneidad como una diana terapéutica para el cáncer seleccionados.
Materiales y Métodos
Tejidos
Parejas de 2 mm se obtuvieron muestras de biopsia de tamaño a partir de tejidos adenocarcinoma gástrico de 20 pacientes sometidos a endoscopia diagnóstica y la disección endoscópica de la submucosa, al centro Nacional del cáncer en Corea, después de obtener su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido se congelaron en nitrógeno líquido a -70 ° C inmediatamente después de la biopsia hasta su uso. Algunas de las muestras de tejido fueron paraffindized para los estudios inmunohistoquímicos, como sea necesario. Estos estudios fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Centro Nacional del Cáncer (# NCCNSH 03-024).
Cultivo celular y transfecciones siRNA
líneas celulares de adenocarcinoma gástrico humano moderadamente diferenciado, AGS, MKN- 28 y SNU-638 se obtuvieron de la célula Corea Line Bank y mantiene como se describe anteriormente [35]. siRNAs utilizado en transfecciones, eran proporcionados por Invitrogen (Carlsbad, CA). Sus secuencias son galectina-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', y MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Las transfecciones se llevaron a cabo usando el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La inducción de la transitoria galectina-3 sobreexpresión en células SNU-638 se consiguió usando pcDNA3.1 /NT-galectina-3 con pcDNA3.1 /NT-GFP. Para el tratamiento de control de la normalización, las líneas celulares de cáncer gástrico fueron tratados con 1 mg por reactivos LTX (Invitrogen).
aislamiento de ARN y el análisis de RT-PCR
ARN total fue aislado de las células de cáncer gástrico humano y muestras de tejido del paciente, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La transcriptasa inversa PCR se realizó usando un sistema de transcripción inversa (Promega Corp. EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los cebadores: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sentido) y 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-sentido) para LGAL3 humano gen (galectina-3); 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sentido) y 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (antisentido) para el gen humano F2R (PAR-1); 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(sentido) y 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (antisentido) para el gen de MMP-1 humana; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(sentido) y 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (antisentido) para el gen de MMP-9 humana; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(sentido) y 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (antisentido) para el gen de β-actina humana; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(sentido) y 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sentido) para la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa humana (GAPDH). PCR se realizó en un volumen de 20 l usando una Taq Ex (Takara). El ciclo de amplificación (desnaturalización 95 ° C durante 1 min, hibridación a 60 ° C durante 1 min y extensión paso a 72 ° C durante 2 min) se repitió 32 veces, seguido de extensión final de 10 min a 72 ° C.
Construcción de la galectina-3 que expresan el vector y la infección viral Lenti-
la larga duración humana galectina-3 que expresa la construcción pcDNA3.1-NT-GFP-Gal3, el vector pcDNA3.1-NT-GFP y el vector lenti-viral a la sobre-expresa LacZ, galectina-3 (1-250) en pLL3.7 se han descrito anteriormente [2]. F2R humana se clonó en pLECE3 en los sitios de enzimas de restricción BamH1 y Not1, creando la pLECE3-F2R (PAR-1) construir. ADNc de longitud completa de F2R, MMP-1, y el control mRFP se utilizaron para la amplificación por PCR, junto con los cebadores enumerados en datos S1, y resultantes fragmentos de PCR se clonaron en el vector pLECE3 el uso de sitios de enzimas de restricción Pac1 y HPA1, creando la pLECE3 -MMP-1 constructo. Además, el sitio mRFP del vector pGEM-T-Fácil fue transferido al vector pLL3.7 sustitución de la región GFP usando edad1 y sitios de enzimas de restricción EcoR1, para hacer pLL3.7-mRFP. la producción de vectores Lenti-viral se ha descrito anteriormente [2]
análisis de transferencia de Western
extracciones lisado de células se prepararon con tampón RIPA (1% NP-40;. 0,1% de dodecil sulfato de sodio; 0,5 % desoxicolato; NaCl 150 mM; Tris 50 mM, pH 7,5) y la proteasa inhibidor cóctel. 20 g de proteína total de cada lisado se resolvió en 8-12% de geles de SDS PAGE y se transfirió-electro a una membrana de PVDF, y a continuación bloqueada en la leche desnatada 5% en 0,05% de Tween-20 con 1 x PBS (PBST). anticuerpos primarios policlonales, anti-galectina-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 y anti-β-actina (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxilina y paxillin anti-fosfo (pY181) (Epitomics) se incubaron con borrones a una dilución 1:1000 en volúmenes mínimos de 5% de BSA (albúmina de suero bovino) en tampón PBST para temperatura ambiente 1 hr o más de la noche en 4 ° C. Anti-ratón o anti-conejo anticuerpos secundarios de cabra conjugado con HRP (GE Healthcare UK Limited) se incubaron a 1:5000 dilución de 5% de BSA en tampón PBST durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Las proteínas de interés fueron detectados por un aumento de quimioluminiscencia (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, EE.UU.).
inmunoprecipitación
extractos de lisados celulares se prepararon con tampón IP + (20 mM Hepes, 1 % de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100, pirofosfato de sodio 10 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, PMSF 0,2, 10 mg /ml de cóctel inhibidor de la proteasa) en hielo durante 30 min. Después de la remoción de escombros por centrifugación (13.200 rpm a 4 ° C durante 20 min), los sobrenadantes se someten a una etapa preclearing con /G perlas de agarosa con proteína A a 4 ° C durante 30 min en los rotadores. Los sobrenadantes obtenidos después de una breve centrifugación (2.000 rpm a 4 ° C durante 4 min) fueron sometidas a inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-IgG de ratón y galectin3 normal (control negativo). Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces en tampón IP (Hepes 20 mM, 1% de Triton X-100, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 100 mM, pirofosfato de sodio 10 mM). Después de 30 l 2 × SDS-muestra de adición de solución tampón, seguido de ebullición a 95 ° C durante 5 min. Después de sobrenadantes obtenidos después de una breve centrifugación, sus niveles de expresión de proteínas se determinaron mediante el análisis de transferencia Western realizado.
La inmunohistoquímica
En la galectina-3 y PAR-1 inmunohistoquímica, eliminó la parafina cortes de tejido pacientes con cáncer gástrico se dejaron en un microondas durante 15 min en tampón de citrato (Vector Laboratories), y luego incubadas con 3% de H
2O
2 durante 15 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, seguido de incubación con 10% de suero normal de cabra (Vector laboratorios) en 1 × PBS durante 10 min. Los anticuerpos primarios se utilizaron un anti-galectina-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) y anti-PAR-1 (1:200) anticuerpos (Santa Cruz), y el próximo paso fue realizado de acuerdo con las instrucciones de Vectastain®ABC