Expresión abstracta
de la caveolina-1 (Cav1), un componente clave de las caveolas superficie de la célula, es elevada en la próstata cáncer (CP) y se asocia con CaP metástasis y un mal pronóstico para los pacientes con CaP. Polimerasa I y transcripción Factor de liberación (PTRF) /Cavin-1 es una proteína citoplasmática necesario para la formación Cav1 dependiente de caveolas. Expresión de PTRF reduce la motilidad de las células PC3, una línea de cáncer de próstata metastásico celular que expresa de forma endógena abundante Cav1 pero no PTRF y no caveolae, lo que sugiere un papel para los dominios Cav1 no caveolar, o andamios CAV1, en la migración de células de CaP. funciones de tirosina fosforilados Cav1 (pCav1) en concierto con galectina-3 (Gal3) y el enrejado de la galectina para estabilizar quinasa de adhesión focal (FAK) dentro de las adhesiones focales (AF) y promueven la motilidad de las células cancerosas. Sin embargo, si la regulación de la función PTRF Cav1 en la migración celular CaP se relaciona con la expresión y la funcionalidad Gal3 aún no se ha determinado. Aquí mostramos que la expresión en células PC3 PTRF reduce la estabilización de FAK en las adhesiones focales y reduce la motilidad celular sin afectar los niveles pCav1. Exógenos Gal3 estabilizado FAK en las adhesiones focales de células PTRF que expresan y restauró la motilidad celular de PTRF-expresión de células PC3 a los niveles de las células PC3 de manera dependiente de la dosis, con una concentración óptima de 2 mg /ml. Exógena Gal3 estabilizado FAK en las adhesiones focales de células PC3 caída Gal3 pero no en células PC3 caída Cav1. Cav1 caída también impidió Gal3 rescate de estabilización asociado FAK-FA en las células PC3 que expresan PTRF. Nuestros datos apoyan el papel de PTRF /Cavin-1, a través de la formación de caveolas, como un atenuador de la funcionalidad no caveolar de Cav1 en Gal3-Cav1 de señalización y regulación de la dinámica de adhesión focal y la migración de las células cancerosas.
Visto : Meng F, B Joshi, Nabi IR (2015) La galectina-3 anulaciones PTRF /Cavin-1 Reducción de la migración de células PC3 cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (5): e0126056. doi: 10.1371 /journal.pone.0126056
Editor Académico: Christophe Lamaze, Institut Curie, Francia |
Recibido: 28 Noviembre 2014; Aceptado: March 28, 2015; Publicado: 5 Mayo 2015
Derechos de Autor © 2015 Meng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el cáncer de próstata Canadá, Institutos canadienses de Investigación en Salud (RP-126029), Consejo de becas de china UBC-beca de doctorado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes intereses en competencia: Co-autor Ivan Nabi es un miembro de PLOS ONE Consejo Editorial. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
caveolina-1 (Cav1), un miembro de la familia de la proteína caveolina, es un componente clave de las caveolas , las invaginaciones forma de matraz en la superficie celular que participan en muchos procesos celulares tales como el transporte vesicular, la señalización intracelular y la transducción mecánica [1]. Cav1 participa en la regulación de las balsas de lípidos y de múltiples procesos asociados con el cáncer, incluyendo la muerte celular y la supervivencia, la migración celular y la invasión, y el crecimiento tumoral y la metástasis [1-4]. Cav1 expresión es elevada en las células del cáncer de próstata metastásico (PCA) y Cav1 ha sido evaluado como marcador pronóstico de CaP agresivo [5-7]. Cav1 también se ha encontrado asociada con CaP metástasis en el ratón y líneas celulares de CaP humanos [5, 8]. PC3 es una línea celular de cáncer de próstata metastásico que expresa abundantes niveles de tirosina fosforilada Cav1 (pCav1), pero carece de caveolae superficie celular debido a la ausencia de polimerasa 1 y factor de liberación transcripción (PTRF) /cavin-1, es necesario junto con Cav1 para la formación de caveolas [7, 9 a 11]. La sobreexpresión de PTRF en células PC3 disminuye la motilidad celular a través de la producción de metaloproteasa de matriz 9 (MMP9) reducción [12]. Otros estudios han demostrado que PTRF /cavin-1 altera la expresión de células PC3 secretoma al afectar la dinámica de colesterol y el citoesqueleto de actina, y atenúa la promoción de la progresión de CaP por no caveolar Cav1 microdominio [13, 14].
Cell la migración, un elemento crítico de la enfermedad metastásica, es un proceso dinámico y de varios pasos regulados a través de retroalimentación espacio-temporal entre la contracción actomiosina, la polimerización de actina y desmontaje continua y la formación de adherencias [15-17]. adhesiones focales (FAS) son compuestos macromoleculares que enlazan la matriz extracelular y el citoesqueleto y transmiten la fuerza mecánica y señales reguladoras [18, 19]. quinasa de adhesión focal (FAK) es la principal quinasa que participan en la señalización de FA y regula la dinámica de adhesión focal a través de su dominio de quinasa (FRNK) y la tirosina 397 autofosforilación (Y397). Reducción de la fosforilación de FAK Y397 se asocia con un mayor intercambio entre los conjuntos combustibles FAK y el citosol, más lenta desmontaje FA y la reducción de la migración celular [20, 21]. pCav1 aumenta fin de lípidos de membrana en AF y favorece la estabilización FAK dentro de Fas en múltiples líneas celulares de cáncer, incluyendo la línea PC3 CaP celular, una línea celular que no expresa PTRF endógena y por lo tanto no caveolae, sugerente de un papel para andamios Cav1 no caveolar [4 , 11, 22]. Cav1 es un sustrato importante de la quinasa Src y es fosforilada en la tirosina 14 (Y14) [23-26]. En mama humano, líneas celulares de cáncer de colon y próstata, la fosforilación dependiente de Src de Cav1 promueve la estabilización de FAK en las adhesiones focales, la rotación de adhesión focal, señalización de RhoA y la migración celular y la invasión [11]. La galectina-3 (Gal3), una familia de lectina-galactosa específico que se une preferentemente superficie celular GlcNAc transferasa-V (Mgat5) modificada con N-glucanos, estimula la activación de FAK y PI3K, mejora la activación de la integrina y la captación de adhesiones fibrilares, y aumenta F- rotación de actina [27-30]. Hemos demostrado que pCav1 y Gal3 actuar juntos para estabilizar FAK dentro de AF y promover la dinámica de la FA y la migración celular y que la expresión coordinada de Cav1 y Gal3 distinguir el cáncer de tiroides diferenciado de benigna [4, 31].
Sin embargo, aún no se ha determinado si y cómo la expresión de PTRF y, por lo tanto, las caveolas, afecta a la regulación Cav1-Gal3 concertada de la dinámica de la FA y la migración celular. Por ello, utilizó células PC3 con CaP que carecen de PTRF y caveolas pero expresan Cav1 y pCav1, para determinar específicamente el papel de PTRF en la regulación Cav1-Gal3 de la dinámica de la FA y la migración de las células cancerosas.
Resultados
la expresión de PTRF /Cavin-1 disminuye la migración de células PC3 y perturba la estabilización de FAK en las adhesiones focales
células cancerosas de próstata PC3 que expresan de forma estable PTRF-GFP (PC3-GFP-PTRF) muestran una disminución de la motilidad celular en comparación con las células PC3 estable que expresa GFP (PC3-GFP) o las células no transfectadas PC3 (Fig 1A), como se informó anteriormente [12]. La migración reducida de las células PC3-PTRF-GFP no se asoció con un número alterado de adhesiones focales etiquetados para FAK (Fig 1B). Para determinar la estabilidad de FAK en el FAS, las células PC3 se transfectaron con FAK-GFP sola, FAK-GFP más mCherry o FAK-GFP-plus PTRF mCherry y se someten a la recuperación después de fluorescencia photobleaching ensayo (FRAP). Como se muestra en la figura 1C, la expresión de PTRF-mCherry aumentó la fracción móvil de FAK-GFP en las AF relación con las células PC3 transfectadas con FAK-GFP solo o FAK-GFP con mCherry. Una fracción móvil aumento, aumento de la recuperación de la fluorescencia de la FAK-GFP con relación a la intensidad de la fluorescencia pre-blanqueo, refleja una mayor intercambio de FAK-GFP entre la adhesión focal y el citosol por lo tanto menos la estabilización de la FAK-GFP dentro de la FA. Por lo tanto, la expresión de FAK PTRF disminuye la estabilización en el FAS, indicativo de un mayor intercambio con citoplasmática FAK y redujo FA desmontaje [20, 21].
(A) ensayo de migración Transwell muestra que las células PC3-GFP-PTRF migran más lento de lo salvaje PC3 y PC3 de tipo-GFP células. (B) Imágenes confocales representativos de PC3, PC3-GFP y PC3-GFP-PTRF células y cuantificación de conjuntos combustibles por célula en cada una de las líneas celulares muestran que el número de conjuntos combustibles por célula no se ve afectada significativamente por la expresión PTRF en la célula. (C) La recuperación de fluorescencia después de photobleaching ensayo (FRAP) muestra que el nivel de recuperación de la intensidad de la FAK-GFP se incrementó con PTRF-mCherry co-transfección en comparación con FAK-GFP solo o FAK-GFP y mCherry co-transfección. se muestra la recuperación de la intensidad gráfico de la curva de FAK-GFP de un experimento representativo y un gráfico de barras de la fracción móvil FAK-GFP (calculado sobre la base de la meseta de recuperación de fluorescencia) resumido de todos los experimentos. (N≥3; ***: p & lt; 0,001; **: p & lt; 0,01; *: p & lt; 0,05).
PTRF expresión no afecta los niveles PCAV1 pero restrores tratamiento Gal3 adicionales de estabilización FAK en la motilidad FA y la célula de PTRF-expresión de las células PC3
fosforilados-tirosina
Cav1 (pCav1) regula la migración de múltiples líneas celulares de cáncer incluyendo PC3 [4, 11]. expresión PTRF estable en células PC3, sin embargo, no alteró los niveles de expresión Cav1 o fosforilación (Fig 2). Como Gal3 se ha demostrado que funcionan junto con pCav1 para regular la estabilidad de FAK en AF [4, 31], hemos probado si exógeno Gal3 podría restaurar la estabilización de FAK en Fas en células PC3-PTRF-GFP. Además de Gal3 marcada con His (Gal3-Su) a concentraciones de 1-4 mg /ml no afectó a la estabilización de la FAK dentro de Fas en células PC3. Sin embargo, en PTRF-expresión de las células PC3, adición de 1,5 o 2 g /mlGal3-His restauró significativamente la estabilización de FAK en las AF, con 2 g /ml de Gal3-His estabilización de FAK en las AF más significativamente (p & lt; 0,001); adición de más alta (3 o 4 mg /ml) o inferior (1 mg /ml) concentraciones de Gal3-His fallado para restaurar la estabilización FAK asociado FA (Fig 3A). La dependencia de la dosis de la Gal-His estabilización de FAK en FAS es consistente con el concepto de la red galectina, en el que una relación crítica de Gal3 a glicano sustratos permite la reticulación glicoproteína óptimo que conduce a la dinámica de los receptores y la señalización [32, 33] . Un ensayo de migración de células Transwell mostró que el óptimo 2 mg /ml Gal3-His mejorado la migración de las tres líneas celulares (PC3, PC3-GFP y PC3-GFP-PTRF) en la mayor medida y al mismo nivel (Fig 3B) . 1, 1,5 y 3 g /ml de Gal3-His no tuvo ningún efecto sobre la migración celular de las células PC3 de control y PC3-GFP, pero la migración elevada de células PC3-GFP-PTRF al nivel de las células PC3 y PC3-GFP no tratados (Fig 3B). 4 mg /ml Gal3 no afectó de manera significativa la migración de células de cualquiera de las líneas celulares (Figura 3B). La adición de proteína exógena Gal3 por lo tanto restaura la estabilización FAK deficiente en AF y la reducción de la migración de PTRF-expresión de las células PC3 de manera dependiente de la dosis.
transferencia Western muestra niveles de expresión de GFP, GFP-PTRF, Cav1 y pCav1 en las células de tipo salvaje PC3 (PC3), las células PC3 transfectadas establemente con GFP (GFP-PC3) y células PC3 transfectadas establemente con GFP-PTRF (PC3-GFP-PTRF). intensidad de la banda de transferencia Western de Cav1 y pCav1 se cuantifica y se normalizó a la de la β-actina y no muestra ninguna diferencia significativa de la expresión Cav1 o fosforilación entre PC3, PC3-GFP y las células PC3-GFP-PTRF. (N≥3; ***:. P & lt; 0,001)
(A) ensayo FRAP de FAK-GFP muestra la estabilidad FAK FA asociado en células PC3 transfectadas con FAK-GFP solo o FAK GFP más PTRF-mCherry y se sometió a Gal3-His tratamiento a las concentraciones indicadas (1, 1,5, 2, 3, o 4 mg /ml). Reducción de estabilización FAK en el FAS de células PC3 que expresan PTRF se restaura por Gal3-His de una manera dependiente de la dosis. Se muestra una gráfica de barras de la fracción móvil FAK-GFP resumida de todos los experimentos y un gráfico de la curva de recuperación FAK-GFP representante de un experimento (mostrando NT y 2 mg /ml Gal3-Su único tratamiento). (B) Cuantificación de PC3, PC3-GFP y la migración de células PC3-GFP-PTRF usando el ensayo transwell con ningún tratamiento o tratado con Gal3-His (1, 1,5, 2, 3 o 4 mg /ml) muestra que 2 g /ml Gal3-His tratamiento aumenta la migración de las células de todas las líneas celulares en un grado similar. Otras concentraciones de Gal3 aumento de la migración de las células PC3-GFP-PTRF en menor medida, pero no afectan a la migración de las células PC3 o PC3-GFP. (NT: no tratado; n≥3; *: p & lt; 0,05; **: p & lt; 0,01; ***: p & lt; 0,001; ns: no significativo.)
rescate de Gal3 estabilización de FAK asociados-FA es
CAV1 dependiente
Para determinar si endógena Gal3 estabiliza FAK en el FAS de células PC3, que agotados Gal3 con siRNA obtener una reducción consistente del 90% en los niveles Gal3 después de 48 horas (figura 4A). Después de 24 horas que transfectadas las células con FAK-GFP solo o FAK-GFP junto con PTRF-mCherry, y ellos o no tratados con 2 mg /Gal3-His antes de la FRAP análisis ml de estabilidad FAK-GFP en las AF. Como se muestra en la figura 4B, desmontables de Gal3 (Gal3 KD) redujo estabilización FAK en el FAS, en una medida similar a la observada para células PC3 PTRF expresan, mientras que siCTL no tuvo ningún efecto sobre la estabilización de FAK en comparación con las células no transfectadas. Es importante destacar que el tratamiento con Gal3-Su estabilización FAK rescatado de Fas en tanto que expresan PTRF y desmontables células Gal3 (figura 4B).
(A) Western blot muestra la eficiencia de Gal3 siRNA desmontables. (B) ensayo FRAP muestra estabilidad FAK-GFP asociado-FA en células PC3 transfectadas con siRNA no, siRNA control de mezcla aleatoria (siCTL) o el ARNsi contra Gal3 humana (siGal3), y se sometió a 2 mg /ml Gal3-His tratamiento. Se muestran las gráficas de la curva de recuperación intensidad FAK-GFP de un experimento representativo y un gráfico de barras de la fracción móvil FAK-GFP resumida de todos los experimentos. (N = 3; ***:. P & lt; 0,001) guía empresas
A continuación, derribado Cav1 en células PC3 de siRNA (siCav1) (figura 5A) antes de la transfección, ya sea con FAK-GFP solo o FAK GFP más PTRF-mCherry y tratamiento con exógenos Gal3-His (2 mg /ml). siCav1 aumentó la fracción móvil de FAK-GFP en Fas en PC3 pero no en células PC3 PTRF expresan, demostrando que Cav1 regula selectivamente la dinámica de AF en células PC3 que carecen de PTRF (Fig 5B). Gal3-His fue incapaz de promover la estabilización de FAK en el FAS de células PC3 o PC3-PTRF en el que Cav1 fue derribado (figura 5B). Cav1 tanto, es necesario para la estabilización de FAK Gal3 dependiente en el FAS de células PC3. Por lo tanto, la regulación concertada de FA por la dinámica Cav1 y Gal3 se ve afectada por la expresión de PTRF y Cav1 contratación de caveolas. Esto sugiere que el reclutamiento de Cav1 a caveolas puede alterar la relación entre la falta de caveolar Cav1 y Gal3 que es fundamental para su regulación coordinada de la dinámica de la FA y la migración de las células cancerosas.
(A) Western blot muestra la eficiencia de Cav1 siRNA desmontables. (B) ensayo FRAP de FAK-GFP muestra estabilidad FAK asociado-FA de células PC3 transfectadas con no siRNA, control scramble siRNA (siCTL) o el ARNsi contra Cav1 humana (siCav1), y se sometió a 2 mg /ml Gal3-His tratamiento . Se muestran las gráficas de la curva de recuperación intensidad FAK-GFP de un experimento representativo y un gráfico de barras de la fracción móvil FAK-GFP resumida de todos los experimentos. (N = 3; ***: p & lt; 0,001) guía empresas
Discusión
La familia incluye cavin PTRF /Cavin-1, SDPR /Cavin-2, PRKCDBP /cavin-. 3 y MURC /cavin-4, que comparten un dominio N-terminal conservada compuesto de repeticiones heptad de aminoácidos hidrófobos, posiblemente formando bobinas en espiral, y una región siguiente de varios aminoácidos básicos [34]. La expresión de los Cavins se asocia con la expresión y la estabilización de Cav1 y la formación y función de caveolae [34]. De los Cavins, PTRF /Cavin-1 es esencial para la formación de caveolas y la pérdida de los resultados PTRF en la pérdida de caveolas y la regulación a la baja de los niveles de proteína Cav1 [9, 35]. Cav1 se ha atribuido funciones no caveolar [36-38] y estequiometría entre caveolinas y Cavins debe influir necesariamente la expresión no sólo caveolas sino también dominios Cav1 no caveolar o andamios Cav1. células PC3 son un modelo celular excelente para estudiar las funciones no caveolar de Cav1 ya que carecen de PTRF y caveolae pero muestran niveles elevados de Cav1 [7]. De hecho, la expresión de PTRF en células PC3 neutraliza los microdominios Cav1 no caveolar y altera la motilidad celular, las vías de secreción y las capacidades de la angiogénesis y la linfangiogénesis en células PC3 [12-14, 39, 40]. En consonancia, se muestra aquí que la expresión en células PC3 PTRF límites de regulación Cav1-Gal3 de estabilización de FAK en AF y la motilidad celular.
Función
Gal3 y pCav1 en concierto para promover la dinámica de la FA y la motilidad celular. pCav1 promueve la polarización y la migración celular y regula el orden de los lípidos de membrana a las AF [4, 22, 26]. la unión a la superficie celular Mgat5 modificado con N-glicanos Gal3 forma una celosía galectina que estimula la activación de FAK y PI3K, y promueve la activación de la integrina y la rotación de F-actina [27-30]. Gal3 induce la activación de la integrina α5β1 y FAK fosforilación (p397FAK), asociada con la estabilización de FAK en conjuntos combustibles, el aumento de FA de señalización y desmontaje, y por lo tanto la migración celular [20, 21, 28]. Además, en las células que carecen de la celosía de la galectina debido a la ausencia de Mgat5, pCav1 no es suficiente para promover la estabilización FAK asociado-FA; expresión de Mgat5 y la galectina celosía aumenta la propagación de células e induce AF pero requiere pCav1 para estabilizar FAK dentro de conjuntos combustibles [4]. En consonancia, la expresión coordinada de Cav1 y Gal3 se observa en las líneas diferenciadas de tiroides cáncer derivado de células y ensayos de siRNA desmontables en las mismas líneas celulares muestran que tanto Cav1 y Gal3 están obligados a promover la estabilización de FAK en AF y la migración celular en comparación con lesion- tiroidea benigna células derivadas [31]. Datos más recientes muestran que Gal3 es necesaria para la señalización de factor de crecimiento epidérmico (EGF) que induce la fosforilación Cav1 y promueve la circular de la colmena dorsal (CDR) la formación, la migración celular y la fibrilogénesis fibronectina; Estos estudios condujeron a la sugerencia de un módulo de señalización Gal3-integrina pCav1 que media EGF señalización de Rho A [41]. Esto sugiere que de afuera hacia adentro integrina señalización media la regulación Gal3-pCav1 concertada de la dinámica de la FA, donde extracelular Gal3 interactúa con las integrinas y activa, que se movilizan las pCav1 conduce a aguas abajo de señalización RhoA y la migración celular.
Nuestros datos muestran que PTRF expresión en células PC3 no altera Cav1 o niveles pCav1, lo que sugiere que PTRF regula la función pCav1 en la dinámica de AF a través del reclutamiento Cav1 a caveolae, reduciendo la disponibilidad de pCav1 funcional en dominios de andamio no caveolar. Formación de caveolas puede regular la expresión y función de los andamios Cav1 no caveolar mediante la contratación de pCav1 a caveolas. Cav1 Y14 fosforilación es dispensable para la formación de caveolas pero pCav1 se ha localizado en caveolae [42, 43]. De hecho, se ha demostrado que la expresión preferencial de Cav1 en dominios Cav1 no caveolar debido a una ausencia de PTRF está asociado con CaP avanzado y que la expresión de PTRF /caveolae neutraliza los dominios Cav1 no caveolar para ralentizar la progresión de CaP [14] . El hecho de que el exceso de Gal3 puede restaurar la señalización FA pCav1 dependiente indica que la interacción concertada entre Gal3 y pCav1 es crítico para su capacidad de regular la FA de señalización y la dinámica. De un rango de concentraciones de 1 a 4 g /ml, 2 mg /ml fue óptima para rescatar células que expresan PTRF, destacando la dependencia de la concentración de la función de celosía Gal3. De manera similar, la estimulación de la fibrilogénesis Gal3 fibronectina dependiente de integrina es dependiente de la concentración [28]. Las integrinas son modificados por Mgat5 y Gal3 activa α5β1 integrina y recluta a fibrilar adherencias [28, 44]. pCav1 se ha demostrado que interactúan con las integrinas y modular la orden de lípidos en AF [22, 45-47]. Nuestros datos sugieren que la concentración relativa de Gal3 a pCav1 no caveolar es un regulador crítico de la señalización de Gal3-pCav1 y que PTRF es una novela regulador de este módulo de señalización. PTRF se ha demostrado que altera la secreción de exosomal de células PC3 [13] y si PTRF interrumpe el módulo Gal3-pCav1 mediante la limitación de la secreción Gal3, o secuestrando pCav1 en caveolae y lejos de andamios Cav1 no caveolar, o incluso mediante la interacción directa con la no andamios Cav1 -caveolar, queda por determinar (figura 6).
extracelular Gal3 y pCav1 no caveolar cada estabiliza dentro de FAK AF dependientes entre sí. Expresión de PTRF interrumpe esta función a través de tres posibles maneras: 1) por el reclutamiento de pCav1 lejos de andamios Cav1 no caveolar y en caveolae; 2) por la interacción directa con pCav1 no caveolar; 3) al afectar la secreción de Gal3 y concentración Gal3 así extracelular. A través del cual la vía PTRF afecta a la función Gal3-pCav1 sobre la dinámica de la FA aún no se ha estudiado.
Tanto Cav1 y Gal3 juegan un papel importante en la progresión del CaP. Gal3 ha sido reconocido como un importante regulador del CP metástasis [48-50] y varios intentos se han realizado para apuntar Gal3 en el CaP, utilizando el Gal3 vinculante asociada al cáncer de Thomsen-Friedenreich glycoantigen (TF-Ag) MIMIC lactosa L-leucina o una alta afinidad glicopéptido Gal3-bingding purificada a partir de bacalao [51, 52]. Cav1 ha sido evaluado como marcador pronóstico de CaP agresivo desde la década de 1990. [5, 6].
Los datos más recientes sugieren que neutraliza la acción PTRF Cav1 implicando un papel crítico para dominios no caveolar en el CaP [14]. Nuestra demostración de que Gal3 puede revertir la estabilización FAK reducido en AF y la motilidad celular inducida por PTRF identifica Gal3 y pCav1 como reguladores críticos de la función de dominios no caveolar en la migración de células de CaP. Coordinar la actividad de Cav1 y por lo tanto Gal3 puede desempeñar un papel importante en la metástasis del CP y representan una posible diana terapéutica para el CaP.
Materiales y Métodos
Anticuerpos, plásmidos, un siRNA humana recombinante Gal3-His albúmina de suero bovino (BSA), y de ratón anticuerpos anti-beta-actina
se adquirieron de Sigma-Aldrich. Rabbit anti-FAK se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, Inc., conejo anti-pY14Cav1 de la señalización celular, Inc., y el ratón anti-PTRF y anticuerpos anti-conejo de Cav BD Transduction Laboratories. de ratón conjugado con HRP de conejo y anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Jackson ImmunoResearch Laboratories. Faloidina y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488, 568, o 647 se adquirieron de Life Technologies, Thermo Fisher Scientific. PTRF-mCherry y mCherry plásmidos fueron donaciones generosas de la doctora Michelle Hill (La Universidad de Queensland Institute Diamantina, la Universidad de Queensland, Instituto de Investigación Traslacional, Brisbane, Queensland, Australia). FAK-GFP plásmido se como se describe anteriormente [11]. Validados en el blanco más SmartPool pequeños RNAs de interferencia (siRNA) para Cav1 humana, el control de siRNA (siCONTROL no director siRNA no. 1) y personalizados dúplex de siRNA para Gal3 [53] fueron adquiridos de Dharmacon.
recombinante humana Gal3 etiquetado con 6XHis en C-terminal se ha generado utilizando el plásmido, pHIS-Parallel2, descrito anteriormente [54]. Este plásmido y protocolos fueron una especie de regalo de Ludger Johannes (Institut Curie, París, Francia). Con el fin de generar Gal3-Su, hemos utilizado bacterias BL21-DE3 (New England Biolabs). Brevemente, se volvieron a inocular cultivo durante la noche (1: 5) en LB fresco suplementado con ampicilina y se cultivaron a 37 grados centígrados en 225 agitador rpm hasta que la densidad óptica a 600 alcanzó 1 y luego indujo utilizando IPTG 0,4 mM durante 3 horas a 30 grados centígrados en un agitador de 225 rpm. Recombinante Gal3-His se purificó en matriz de afinidad Talon (Clontech) usando el protocolo suministrado, se transfirió a 1 x PBS antes de la congelación rápida en N2 líquido.
Cultivo de células y transfección
La línea de células humanas PC3 era de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvo en RPMI 1640 completo suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Las líneas de células PC3 que expresan establemente GFP o PTRF-GFP (GFP-PC3 y PC3-GFP-PTRF) fueron donaciones generosas de la doctora Michelle Hill (La Universidad de Queensland Institute Diamantina, Brisbane, Australia) [13]. Todas las líneas celulares se pasaron al menos dos veces después de la recuperación de las existencias congeladas antes de iniciar los experimentos y se mantuvieron en cultivo durante un máximo de 8 a 10 pasajes para minimizar la deriva fenotípica.
plásmido transfección se realizó 24 h después de la siembra de las células o siRNA transfección, usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Los experimentos se llevaron a cabo 24 h después de la transfección de plásmidos. Con el fin de desmontables Cav1, las células se cultivaron en medio completo durante 24 h antes de la transfección con el ratón específico Cav1 siRNA o controlar SmartPools siRNA (ratón siCav1: L-0058415-00, siCONTROLS: D-001210-01; Dharmacon) usando Lipofectamine 2000 transfección reactivo (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Para Gal3 caída, hemos utilizado anteriormente se ha descrito personalizados secuencias de oligonucleótidos siRNA y protocolo [53]. Brevemente, las células fueron transfectadas con el grupo específico de cuatro ratones sintetizado encargo Gal3 siRNA oligonucleótidos dúplex o control de la piscina inteligente siRNA (siCONTROLS) utilizando Lipofectamine 2000. Las células fueron cultivadas durante 48 h antes de la experimentación.
Western Blot
Los sedimentos celulares de 80% de cultivos confluentes se lavaron con PBS frío y se resuspendieron en tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, NaCl 250 mM, EDTA 3 mM, EGTA 3 mM que contiene recién añadido mM DTT 2, PMSF 0,5 mM, vanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 2,5 mM, y 1 mM de leupeptina) durante 30 min a 4 ° C, se sedimentaron a 13.000 rpm a 4 ° C, y el sobrenadante se recogió y se almacenó a -80 DO. Igual cantidad de proteínas se separaron en un 12% SDS-PAGE, electrotransferencia sobre nitrocelulosa (GE Healthcare Life Science), probaron con anticuerpos indicados y anticuerpos secundarios conjugados con HRP, y revelaron por ECL (Merck Millipore).
inmunofluorescencia etiquetado
Las células se fijaron con 3% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente, se enjuagaron con PBS, permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS /CM, se bloquearon con PBS /CM que contiene 0,2% de bovino albúmina de suero (BSA), y después se incubó con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes en PBS /cm que contenía 0,2% de BSA. Después de etiquetado, los cubreobjetos se montaron en CELVOL (Celanese, Ltd.), y las imágenes adquiridas con los 100 × objetivos planapochromat (NA 1,35) de un microscopio confocal Olympus FV1000.
FRAP mediciones
FRAP se realizó en un microscopio confocal (FV1000, Olympus) equipado con un objetivo 60x planapochromat (NA 1,35; aceite) y el escáner SIM. Las células se cultivaron en placas a baja densidad sobre FN (10 mg /ml) durante 24 h en una de 8 pocillos cámara μ-deslizamiento (ibidi), transfectadas con FAK-GFP o FAK-GFP más mCherry o FAK-GFP más PTRF-mCherry, y los experimentos realizados 24 h más tarde a 37 ° C. siRNA se transfectaron 48 h antes de los experimentos FRAP. Las células fueron tratadas con la concentración-Su Gal3 cambiando el medio a medio libre de suero que contiene indicado de Gal3-His durante 10 minutos antes de cambiar de nuevo a medio RPMI libre de bicarbonato. Para cada análisis FRAP, un marco prebleach fue adquirida seguido por un solo evento de blanqueo utilizando la estimulación simultánea e independiente de la línea del escáner SIM 405. recuperación de fluorescencia fue seguido en intervalos de 4 s de tiempo hasta que la intensidad alcanzó una meseta. La fluorescencia durante la recuperación se normalizó a la intensidad prebleach. Las relaciones de intensidad en la zona blanqueada se compararon antes y después de la recuperación de blanqueo para el cálculo de fracciones móviles utilizando Prisma 4 (GraphPad). Los gráficos son representativos de un mínimo de tres experimentos independientes en los que se blanquearon entre 10 y 25 adhesiones focales.
Migración de ensayo
Para el ensayo de la migración, las células se trataron con tripsina y se contaron, y 200.000 células /pocillo fueron transferidos a no recubiertos 8-micras insertos de cultivo celular (BD Falcon) en medio que contenía 2% de suero y el conjunto se coloca en placas de 24 pocillos que contenían medio completo. Después de 16 h, las células no migradas fueron retirados de la parte superior del filtro con un hisopo de algodón, y las células migran sobre la parte inferior del filtro se fijaron con 3% PFA, se tiñeron con 5% de cristal violeta y las células marcadas se contaron. Los recuentos celulares se normalizaron al grupo PC3. Alternativamente, 200.000 células /pocillo se transfirieron a insertos en medio libre de suero con o sin 2 mg /ml Gal3-His y el conjunto se coloca en placas de 24 pocillos que contenían medio completo durante 14 h antes de la fijación y tinción. Los recuentos de células se normalizaron con el grupo no tratado PC3.