Extracto
La galectina-4 (Gal-4) es un miembro de la familia de galectina glicano proteínas de unión que muestra una expresión significativamente mayor en los tumores quísticos de páncreas humanos y en los adenocarcinomas de páncreas en comparación con el páncreas normal. Sin embargo, la función putativa de Gal-4 en la progresión tumoral de cáncer de páncreas es todavía incompleta entendido. En este estudio se investigó el papel de Gal-4 en la progresión del cáncer, utilizando un conjunto de líneas celulares de cáncer de páncreas definidos, Pa-Tu-8988S (PATU-S) y Pa-Tu-8988T (PATU-T), como un modelo . Estas dos líneas celulares se derivan de la misma metástasis hepática de un adenocarcinoma de páncreas humano primario, pero difieren en sus características de crecimiento y la capacidad metastásica. Hemos demostrado que la expresión de Gal-4 es alta en Patu-S, que muestra propiedades migratorias pobres, mientras que mucho más bajos Gal-4 niveles se observan en la línea celular altamente metastásica Patu-T. En Pätu-S, Gal-4 se encuentra en el citoplasma, pero también se secreta y se acumula en la membrana en los sitios de contacto con las células vecinas. Por otra parte, nos muestran que Gal-4 inhibe la formación de metástasis al retrasar la migración de las células del cáncer pancreático
in vitro utilizando un ensayo
cero, y
in vivo
utilizando el pez cebra (
Danio rerio
) como modelo experimental. Nuestros datos sugieren que Gal-4 puede actuar en la superficie celular de Pätu-S como una molécula de adhesión para evitar la liberación de las células tumorales, pero tiene además una función citosólica mediante la inhibición de la migración a través de un mecanismo aún desconocido.
Visto: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen B, van Die I (2013) La galectina-4 reduce la migración y la metástasis formación de las células del cáncer pancreático. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10.1371 /journal.pone.0065957
Editor: Roger Chammas, Facultad de Medicina, Universidad de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: 14 Febrero, 2013; Aceptado: April 29, 2013; Publicado: 18 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Belo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la Fundación para a Ciência e Tecnologia (FCT), Lisboa, Portugal, a través de becas de investigación SFRH /BD /44820/2008 otorgado a AIB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una de las principales causas de muerte por cáncer en el mundo occidental. Clínicamente estrategias eficientes para la detección temprana de la enfermedad aún no están disponibles. La incidencia de cáncer de páncreas y la mortalidad en pacientes con este tipo de cáncer apenas ha disminuido en los últimos 50 años [1], [2], [3], [4]. Por lo tanto una mayor comprensión en los mecanismos de inicio, la progresión y la metástasis de cáncer de páncreas se justifica.
Las galectinas son proteínas que se pueden expresar de manera aberrante en el cáncer y han sido implicados en la progresión del cáncer [5], [6]. Se componen de una familia de lectinas solubles de unión a galactósido-que han sido clasificados en tres subgrupos en función de su estructura y el número de dominios de reconocimiento de hidratos de carbono: prototipo (galectinas-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13, y -14), tipo quimera (tipo galectina-3), y repetición en tándem (galectinas-4, -6, -8, -9, y -12) [revisado en [7]]. Funcionan en una amplia variedad de procesos biológicos tanto intra como extracelularmente. celosías galectina-glicoproteína juegan un papel importante en la regulación de la función celular, como la adhesión célula-célula, célula-matriz extracelular (ECM) interacciones, el crecimiento celular [8], la organización de los dominios de membrana en la formación de balsas de lípidos [9], [10] , [11], la migración de leucocitos [revisado por [12]] y la regulación de la señalización intracelular [13], [14], [15].
la expresión de las galectinas se modula durante el desarrollo de las células individuales y se pueden alterar en diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. Galectinas a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas y las células del estroma asociadas con el cáncer, especialmente en aquellos tipos de células que normalmente no expresan la galectina específica [16]. En la progresión del cáncer, galectinas están implicados en la diferenciación, adhesión, migración, la angiogénesis, la transformación maligna, la apoptosis y la resistencia a fármacos contra el cáncer [revisado en [5], [17], [18], [19], [20], [21] , [22]]. Además, hay varios informes que han relacionado estas proteínas a la invasión y la metástasis en varios tipos de cáncer [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].
en este estudio nos hemos centrado en el papel de la galectina-4 (Gal-4) en la metástasis de las células de cáncer de páncreas. la formación de metástasis es un proceso multi-etapas en el que las células tumorales primarias invaden los tejidos vecinos, migrar a través de la vasculatura a extravasación finalmente en el tejido perivascular y proliferar en tumores secundarios. Gal-4 es un ácido 323-amino (36 kDa) proteína que se expresa predominantemente en el epitelio luminal del tracto gastrointestinal, de la lengua en el intestino grueso. Gal-4 expresión no se detecta en páncreas sano, pero es significativamente mayor en los tumores quísticos del páncreas humanos y adenocarcinomas de páncreas en comparación con muestras de tejido normal, mientras que su expresión es baja en los tumores neuroendocrinos pancreáticos [26], [27], [29 ], [30], [31]. La función de Gal-4 en la progresión tumoral y la metástasis en el cáncer pancreático, sin embargo, sigue siendo poco clara. En este estudio se investigó el papel putativo de Gal-4 en la progresión del cáncer, utilizando un conjunto de líneas de células pancreáticas definidos. Los resultados demuestran que Gal-4 es mayor expresa en las células tumorales pancreáticas más diferenciados en comparación con las células pancreáticas que demuestran capacidades metastásicas. Por otra parte, Gal-4 afecta a la formación de metástasis al retrasar la migración y la metástasis de las células del cáncer pancreático
in vitro
en un ensayo de rayado y
in vivo Hoteles en embriones de pez cebra como modelo experimental.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Roy
- /-; nácar
- /- Casper
Danio rerio gratis (pez cebra) se manejaron en el cumplimiento con las regulaciones locales de bienestar animal y mantenido de acuerdo con protocolos estándar (zfin.org). La cría de peces adultos fue aprobado por el comité de protección de animales local (Comité de licencias Experimental Animal, DEC) de la VU University Medical Center. Todos los protocolos adheridos a las directrices internacionales especificados por la Directiva de Protección Animal de la UE 86/609 /CEE, que permite embriones de pez cebra a ser utilizados hasta el momento de la vida libre (aproximadamente 5-7 días después de la fecundación). Debido a que los embriones utilizados en este estudio cumplen estos criterios, no se requiere licencia DEC durante este estudio.
Los anticuerpos, reactivos y búferes
cabra anti-humano galectina-4 (BD Biosciences, Bélgica) se utilizado para la detección de Gal-4 y el ratón anti-tubulina (Cedarlane, Canada) se utilizó como control endógeno. Los anticuerpos secundarios (ABS) utilizados fueron Odyssey IRDye 680 burro anti-cabra (0,5 mg); IRDye 800CW de cabra anti-IgG de conejo (LI-COR Biosciences, EE.UU.); conejo anti-cabra Alexa Fluor 488; conejo anti-cabra Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, EE.UU.). A-PRO ® 3-yoduro con fluorescencia roja lejana de Tecnologías en directo (Invitrogen, EE.UU.) se utilizó como indicador de células muertas
recombinante hgal-4 proteínas se adquirió de BD Biosciences.; tampón de bloqueo LiCor fue adquirido de LI-COR Biosciences, EE.UU.; lactosa se obtuvo de Sigma (EE.UU.) y rojo fluorescente tinción de células CM-Dil de Vybrant, Invitrogen (EE.UU.). Control de siRNA (scramble A) y para GAL4 siRNA (10 mM) se adquirió de Santa Cruz Biotecknology (EE.UU.). Silenciador pre-diseñado siRNA contra Gal-4 (20 mM) y Ambion®
Silencer®
Control Negativo#1 siRNA (20 M) fue adquirido de Ambion (EE.UU.). Lipofectamina RNAiMax y Opti-MEM reactivos de transfección se obtuvieron de Invitrogen (EE.UU.).
Células y condiciones de cultivo
líneas celulares de cáncer de páncreas Pa-Tu-8988S (PATU-S) y Pa-Tu -8988T (PATU-T) se adquirieron de DSMZ (Alemania). Otras líneas de células pancreáticas fueron una especie de regalo del Prof. Dr. Richardson (Universidad de Leiden, Países Bajos) [32]. Las líneas celulares AsPC1, BxPC3, MiaPaca y Panc01 se cultivaron en RPMI (Gibco, Invitrogen), con 10% de FCS (Lanza, Bélgica) y 1:100 Pen /Strep (Gibco, Invitrogen) a 37 ° C + 5% de CO
2. Las líneas de células Capan-I y Capan-II se cultivaron con 15% de FCS. Patu-S, Patu-T y PaTu8902 se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco, Invitrogen), con 10% de FCS y 1:100 penicilina /estreptomicina a 37 ° C + 5% de CO
2.
Síntesis de ADNc y cuantitativa en tiempo real PCR
el ARN total fue aislado de todas las líneas de células usando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARNm se transcribe a continuación en ADNc utilizando el kit del sistema de transcripción inversa (Promega, EE.UU.), como se describe anteriormente [33]. cDNA a partir de la línea de conductos pancreático humano normal epitelial de células hTERT-HPNE [34] fue una especie de regalo del Dr. E. Giovannetti (Departamento de Oncología Médica, VUmc Cancer Center de Ámsterdam, Países Bajos). tiempo real las reacciones (RT) PCR se realizaron con el método SYBR Green en un sistema de detección de secuencias ABI 7900HT (Applied Biosystems, EE.UU.) como se describe anteriormente [35]. Todos los oligonucleótidos fueron diseñados utilizando Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, EE.UU.) el software informático, y sintetizados por Invitrogen Life Technology (EE.UU.). Las reacciones se llevaron a cabo como sigue: 2 min a 50 ° C, seguido de 10 min a 95 ° C y 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C. Los datos se expresan como la abundancia relativa del mRNA obtenido a partir de los valores de CT de la diana en comparación con el gen endógeno de referencia
GAPDH
.
Construcción de Patu-T las células que expresan Gal-4
para construir células Patu-T que expresan (4-hgal) gen Gal-4, la galectina-4 humana recombinante fue clonado mediante la inserción de ADNc del gen hgal-4 en el vector PRRL-cPPT-CMV-X2-PRE-SIN- IRES-eGFP (una especie de regalo del Dr. A. Horrevoets, VU Medical Center, Amsterdam, Países Bajos). Todo el marco de lectura abierto hgal-4 (ORF) se obtuvo mediante amplificación por RT-PCR, la introducción de sitios NsiI /EcoRI de restricción para la inserción y una secuencia Cosac antes de la ORF (Fwd: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC; REV: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). El inserto hgal-4 se clonó usando el sitio EcoRI del vector, colocando de este modo el gen hgal-4 bajo un promotor CMV activa constitutiva. El constructo lenti-viral resultante se propagó en
Escherichia coli
BL21 (DE3) y se purificó mediante el kit spin-columna de aislamiento de plásmidos (Qiagen, Alemania). la producción Lenti-viral y la infección de las células-T Patu con el constructo viral, lo que resulta en la línea celular Patu-T /Gal-4, se llevó a cabo como se describe anteriormente [36]. Una línea celular de control (PATU-T /maqueta) se construyó mediante la introducción del vector vacío.
Gal-4 Knock Down (KD) en Patu-S células
ARN de interferencia mediada era utilizado para reducir Gal-4 expresión en células Patu-S. Para la eficacia de transfección óptima en células Pätu-S, tanto Gal-4 objetivo siRNA (40 nM concentración final) de Santa Cruz Biotechnology y el silenciador diseñado Pre siRNA (10 nM concentración final) fueron utilizados simultáneamente para inhibir Gal-4 expresión (PaTu- S /Gal-4-KD). Un control negativo (scramble A junto con el control negativo siRNA#1) se incluyó en los experimentos (PATU-S /maqueta KD). Las transfecciones se realizaron según las directrices de Invitrogen para la transfección inversa en una placa de 24 pocillos usando 1 l Lipofectamine RNAiMax y 100 medio Opti-MEM l. Para reducir la expresión de Gal-4 en las células Pätu-S, siRNA se introdujo dos veces con 4 días de intervalo y las células se trasplanta en el embrión de pez cebra 24 h después de la segunda transfección. los niveles de Gal-4 mRNA se midieron en varios puntos temporales durante estos experimentos utilizando RT-PCR cuantitativa.
-Western Blot Las
Las células se lisaron a 0 ° C en tampón TEA lisis (Triton X- 100, NaCl, MgCl, CaCl
2, TEA pH 8,2) que contiene inhibidores de la proteasa. La concentración de proteína se determinó mediante mediciones A280 y la determinación de BCA utilizando el kit de ensayo de proteínas de Pierce (EE.UU.). Las proteínas de los lisados celulares (75 g) y medio de cultivo (25 l) se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 12,5% en un sistema de tampón discontinuo y las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman Protran, Sigma). Después de una noche de bloqueo en tampón de bloqueo 1:01 LiCor en PBST /1% de BSA (PBS con 0,05% de Tween 20, 1% BSA), las manchas se incubaron durante 60 min a TA con anticuerpo de cabra anti-hgal-4 (0,1 g /ml ). Mouse anti-tubulina (1:2000 dilución) se utilizó como control de carga (lisados celulares) y la detección de residuos de células (medio de cultivo). Secondary ABs IRDye 680 anti-cabra y IRDye 800CW anti-IgG de conejo se usaron a diluciones 1:15000 (0,07 g /ml), en PBST /1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad. análisis por transferencia Western se realizó utilizando LI-COR escáner sistemas de Odyssey y software.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en una placa de 96 pozos a aproximadamente 1 × 10
4 y 1 × 10
5 células por pocillo y se incubaron durante la noche para la adhesión celular a la placa. [
3H] timidina (1 Ci /pocillo; Amersham Biosciences, EE.UU.) fue añadido y las células se incubaron durante otras 24 horas a 37 ° C + 5% de CO
2. Las células fueron cosechadas y [
3H] timidina se evaluó mediante un centelleo líquido MicroBeta
2 contraplaca 2450 (Perkin Elmer, EE.UU.).
Microscopía de inmunofluorescencia
Patu-S , Pätu-T /mock y Pätu-T /Gal-4 células cultivadas en cubreobjetos de vidrio durante 24 h se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron durante 30 minutos en 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron en 0,1% Triton X-100 /PBS durante 5 minutos. La unión no específica fue bloqueada por enfriamiento rápido 10 min con PBS /glicina (0,15 M) seguido de 30 min con PBS /gelatina al 0,2% /BSA al 0,5% (PBSG). Las células se incubaron con anticuerpo policlonal de cabra anti-hgal-4 en PBSG (dilución 0,2 g /ml) durante 1 h y posteriormente se lavaron con PBS. La detección se realizó después de 1 h de incubación a RT con 5 mg /ml de la Abs secundario (anti-cabra Alexa Fluor 488 o anti-cabra Alexa Fluor 647). Los núcleos se tiñeron con Hoechst (1 g /ml en PBS) durante la etapa de incubación con Ab secundario. La actina se detectó por tinción con faloidina (1:5000 en PBS, 15 min). Después de una etapa de lavado final en PBS y la incrustación utilizando Mowiol (Kuraray Poval, Alemania) varias células de cada condición se visualizaron utilizando un microscopio Leica M6000 B con la lente del objetivo HCX PL APO 40,0 × 0,85 SECO. Imágenes fueron tomadas con una cámara DFC350FXR2-095903305 y analizados mediante el software LASAF (Leica Microsystems, Alemania).
Citometría de Flujo
Para la detección de Gal-4 endógena, las células fueron fijados en el 4% de paraformaldehído durante 30 min a TA, seguido de permeabilización celular en PBA /0,5% de saponina durante 15 min a 4 ° C. Para detectar la unión de Gal-4 humana recombinante (rec hgal-4) a la superficie celular, se realizaron los procedimientos de acuerdo con Patnaik,
et al
[37]. En resumen, se recogieron las células, se centrifugaron y se resuspendieron en solución de Hank fría salina equilibrada (HBSS, Sigma, EE.UU.) con lactosa 500 mM. Las células se recogieron posteriormente y se incubaron en HBSS fría con 2% de BSA durante 1 hora a 4 ° C con agitación suave. Después de esto, las células se lavaron una vez con HBSS /BSA con 2 mM β-mercaptoetanol (Gibco, Invitrogen), y posteriormente se incubaron durante una hora a 4 ° C en HBSS /BSA /mM β-mercaptoetanol 1 en ausencia o presencia de rec hgal-4 (5 ug /ml) para detectar endógeno unido a la superficie-Gal-4 o rec en superficie límite hgal-4, respectivamente. Para evaluar si la unión Gal-4 es dependiente de hidratos de carbono, los ensayos de unión se realizaron en presencia de 500 mM a la lactosa. Por tanto en la superficie y el análisis citosólica, las células se tiñeron con anti-Gal-4 Ab (2 mg /ml) en PBS con 0,5% de BSA y 0,02% de azida (PBA) que contiene 10% de FCS (Sigma, EE.UU.), durante 30 min a 4 ° C. Para la tinción secundaria, Alexa488 o Alexa647 etiquetados Abs se utilizaron (5 mg /ml e incubación durante 30 min a 4 ° C). Indicador de células muertas para-PRO ® 3-yoduro (1 nM) se añadió justo antes de fluir mediciones cytrometry. La citometría de flujo se realizó usando un FACScan o un citómetro de flujo FACScan y software de Summit. Se excluyeron las células muertas catalogados como de alto A-PRO ® 3-tinción de análisis.
in vitro
Migración de ensayo ( "cero" -assay)
El ensayo de los arañazos se realizó como se ha descrito previamente por Liang et al. [38]. Las células se cultivaron hasta la confluencia en una placa de 24 pozos. La monocapa de células se raspó en una línea recta con una punta de pipeta de 200 l (Sarstedt, Alemania). Las fotografías del cero se tomaron bajo un microscopio invertido Leica DMI a las 0 h, 12 h, 24 hy 48 h para las células simuladas Patu-T /Gal-4 y Patu-T /. Las fotografías en cada punto de tiempo se tomaron con la cámara Leica DFC420. anchura Gap en 0 h se establece en 100%. El análisis anchura de la separación se realizó con PhotoshopCS4 utilizando la herramienta Regla analítica. Las mediciones se realizaron en múltiples sitios definido (& gt; 5) a lo largo de la cero. Cada cero se le dio un promedio de todas las mediciones. Los datos se expresan como la media ± SEM de tres experimentos independientes
En vivo
Metástasis Ensayo
Roy
- /-;. Nácar
- /- Casper Danio rerio gratis (pez cebra) se manejaron en el cumplimiento de las regulaciones de cuidado de animales locales y protocolos estándar de los Países Bajos. Los peces se mantiene a 28 ° C en acuarios con ciclos de luz de día /noche (10 h oscuridad frente a 14 h períodos de luz). Los embriones en desarrollo se mantuvieron en agua de huevo (60 mg /ml océano instantánea ver sales) a 28 ° C antes del trasplante y a 35 ° C después del trasplante.
El trasplante de células del cáncer se llevó a cabo de acuerdo con Marques
et al
[39]. Básicamente, las células se hicieron crecer hasta la confluencia, se trataron con tripsina (Gibco, Invitrogen) y se centrifugaron 5 min, a 1500 rpm. Las células fueron teñidas en PBS que contenía CM-Dil a una concentración final de 4 ng /l, durante 4 min a 37 ° C y 15 min a 4 ° C. Posteriormente, las células se recogieron y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100% de FCS para la recuperación de 5 min y se lavaron dos veces con PBS. Finalmente, las células se resuspendieron en PBS para el trasplante en embriones de pez cebra 2 días después de la fertilización (dpf). Los embriones fueron dechorionated y anestesiados con tricaína (MS-222, Sigma-Aldrich, EE.UU.). El uso de un inyector manual (Eppendorf, Alemania; InjectMan NI2), la suspensión celular se cargó en un capilar de inyección (15 micras, interna y externa 18 micras de diámetro). A continuación, se inyectaron aproximadamente 100 células teñidas de rojo fluorescente en el saco vitelino de los embriones dechorionated. Después de la inyección, los embriones se les permitió recuperarse de trasplante para 1 h a TA. Después de este período (2 h post trasplante (hpt)), los embriones fueron examinados para la presencia de células fluorescentes. Los embriones que contienen células fluorescentes fuera del área del trasplante en 2 hpt se consideraron con fugas y excluidos de los nuevos análisis. El número de embriones vivos en esta etapa se estableció como 100% para cada condición independiente. Todos los otros embriones se incubaron a 35 ° C durante los siguientes 3 días.
Imaging, selección y colocación de Trasplantados embriones de pez cebra
A 1, 2 y 3 días después del trasplante (DPT), la embriones fueron anestesiados con tricaína y posicionados lateralmente sobre 3% de metilcelulosa. Los embriones fueron examinados bajo un fluorescencia Leica DSR MZ16FA microscopio estéreo. células de cáncer fluorescentes fuera de la zona de implantación fueron contados en cada embrión. Los embriones que presentan más de 5 células cancerosas fuera de la yema fueron considerados como positivos para la metástasis y se dejaron de lado separados del resto de los embriones trasplantados. Porcentaje de metástasis se establece como el número de embriones que contienen más de 5 células fuera de la yema de huevo por día con respecto al día cero. El porcentaje total de metástasis se establece como el número total de embriones con metástasis después de 3 días en relación con el día cero.
Estadísticas
Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico aplicado a los datos cuantitativos de RT-PCR se utilizó un modelo lineal utilizando pruebas t de Dunnett. Para el resto de los datos, el análisis estadístico utilizado fue el de una vía de Tukey pruebas t de ANOVA.
In vivo
ensayos de metástasis fueron analizados estadísticamente mediante pruebas t de muestras pareadas. Los datos se consideraron significativos si
p
≤0.05.
Resultados
Expresión de ARNm de Gal-4 en el páncreas líneas celulares de adenocarcinoma
Para investigar la expresión diferencial de Gal-4, los niveles de ARNm se determinaron en nueve líneas pancreáticos humanos diferentes de células de cáncer utilizando en tiempo real (RT) PCR (Figura 1). Como control para la expresión en el tejido normal de conducto pancreático, Gal-4 niveles de ARNm se determinaron en una línea celular inmortalizada derivada de conducto humana normal epitelial pancreático (hTERT-HPNE). Los resultados demostraron que Gal-4 niveles de mRNA en la línea de células del conducto pancreático normal no eran detectables. los niveles de mRNA Gal-4 mostraron una baja abundancia relativa en ocho de las nueve líneas celulares de cáncer, utilizando
GAPDH
como un gen de referencia del hogar. Una línea celular, Pa-Tu-8988S (Pätu-S), sin embargo, mostró un más de 10 veces la expresión elevada en comparación con las otras líneas celulares.
Gal-4 la expresión de ARNm de epithelial- conducto pancreático humano normal como línea celular (hTERT-HPNE) y 9 líneas celulares de cáncer de páncreas humanos diferentes se analizó por cuantitativos PCR en tiempo real, e indican que la cantidad relativa de Gal-4 transcripciones (± SEM) en comparación con la expresión del gen endógeno de referencia
GAPDH
. (*** P≤0.001 frente a todas las demás líneas celulares, utilizando ANOVA de una vía con el post Dunnett dos pruebas t lados).
Curiosamente, Patu-S originó a partir de la misma metástasis en el hígado de un ser humano primaria adenocarcinoma pancreático como una de las Gal-4 líneas celulares que expresan bajos, Pa-Tu-8988T (PATU-T) [40]. se describen estas dos líneas celulares para contener capacidades migratorias y metastásicos opuestas. Patu-S y T-Patu muestran una muy baja y una alta capacidad metastásica, respectivamente, ambos
in vitro
y
in vivo
utilizando el pez cebra como modelo de sistema [39]. Además, se ha demostrado previamente que la mayoría de las líneas celulares muestran en la figura 1 poseen un mayor
vitro
capacidad de migración en, en comparación con Pätu-S [32], [41]. Estos datos nos llevan a considerar la posibilidad de que la expresión de Gal-4 puede restringir la capacidad migratoria y /o metastásico de estas células de cáncer de páncreas. Debido a su origen común, la línea celular de bajo migratoria Patu-S y la línea celular Patu-T metastásico representan un sistema modelo muy atractivo para estudiar el posible papel de Gal-4 en la metástasis.
La localización de Gal- 4 en Patu-S y Patu-células T
La expresión y localización de la proteína Gal-4 en Patu Patu-S y T-células se determinó mediante citometría de flujo, inmunocitoquímica (CPI) y el Western Blot (WB) (figuras 2-4). Para determinar endógeno Gal-4 de las células Pätu-T Pätu-S y, las células se fijaron y se permeabilizaron, seguido por citometría de flujo utilizando-Gal-4 anticuerpos anti (ABS), y Abs secundario fluorescente. Los resultados muestran una clara diferencia en Gal-4 Ab vinculante entre Patu-S y T-Patu. células Patu-S muestran una fuerte tinción por los anti-Gal-4 Abs, mientras que Gal-4 tinción en las células Patu-T es difícilmente detectable (Figura 2A). Para evaluar la presencia de ligandos de glicanos en la superficie celular exterior que podrían ser reconocidos por Gal-4, las células se lavaron primero rigurosamente con 500 mM para eliminar la lactosa galectinas unido a la superficie endógeno. Posteriormente, rec exógeno. Se añadió proteína hgal-4 (5 ug /ml) a las células y Gal-4 de unión se determinó por citometría de flujo usando anti-Gal-4 Abs. Los resultados muestran que se observó aún un nivel significativo de Gal-4 tinción en la superficie de las células Pätu-S, pero no las células Pätu-T, después de lavar con lactosa (Figura 2B), lo que indica la presencia de Gal-4 endógeno fuertemente unido en la superficie de las células Patu-S. Después de la adición de hgal-4 rec a las células, la tinción de la superficie celular Gal-4 aumentó fuertemente, lo que indica que las células Pätu-S se pueden unir altos niveles de Gal-4 a su superficie. Por el contrario, los niveles mucho más bajos de hgal-4 rec unidos a la superficie celular de las células Pätu-T. Para investigar si la rec hgal-4 se une a las células de una manera dependiente de hidratos de carbono, las células T y Patu-Patu-S se incubaron con hgal-4 rec en presencia de lactosa. En presencia de 500 mM lactosa la unión de hgal-4 a las dos líneas celulares se inhibió, lo que indica que el Gal-4 de unión a la superficie celular es dependiente de glicano. En conjunto, estos resultados demuestran que los niveles altos Gal-4 están presentes en las células Pätu-S, mientras que Gal-4 es apenas detectable en las células Pätu-T. Además, las células Patu-S se pueden unir niveles mucho más altos de Gal-4 a su superficie externa de las células Patu-T, lo que indica que expresen más ligandos de carbohidratos Gal-4-unión.
La detección de endógena Gal- 4, y Gal-4, ligandos en las células-T Patu Patu-S y por citometría de flujo. Un histograma de un experimento representativo se representa para cada condición de menos dos experimentos independientes. A) Las gráficas de puntos de Gal-4 tinción de las células Patu Patu-S y T-permeabilizadas. Se detectó Gal-4 a 4 ° C con anti-hgal-4 Abs en las células permeabilizadas fijas. tinción Abs secundaria sin anti-hgal-4 Abs se utilizó como control de fondo de autofluorescencia. B) La presencia de Gal-4 unido endógeno a la superficie de Pätu-S y Pätu-T después de lavar las células con 500 mM de lactosa antes de Gal-4 tinción. La presencia de Gal-4 fue establecido por análisis FACS usando anti-hgal-4 Abs a 4 ° C. Endógeno Gal-4 unido a la superficie se muestra por una línea de negro. C) La presencia de sitios de unión de GAL-4 en las células Pätu-T Pätu-S y se determinó después de lavar las células con 500 mM de lactosa antes de Gal-4 tinción. La unión de recombinante añadido externamente (rec) hgal-4 (5 mg /ml, línea negro) se investigó. La unión de hgal-4 rec a la superficie puede ser inhibida por la adición de lactosa (campo oscuro). La tinción de fondo con el ABS secundaria se representa como campos de color gris claro en B y C.
Las fotografías de análisis CPI representante de la localización celular de Gal-4 en células Patu-S. Se detectó Gal-4 utilizando Alexa marcado con anti-gal-4 Abs (verde), la actina se tiñó usando faloidina (rojo) y la tinción del núcleo obtenido usando HOESCHS (azul); el tercer panel muestra la fusión de las diferentes coloraciones. Bar = 25 micras.
A) Las proteínas de los extractos de células enteras (proteína total de 75 ug) y el medio de cultivo (cultivo de 4 días, 25 ul) de Patu-S (PS), Patu-T (PT), Patu-T /Gal-4 (PT /Gal-4) y Patu-T /maqueta (PT /M) fueron separadas por SDS-PAGE. Después de la transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa, las transferencias se tiñeron utilizando cabra anti-hgal-4 para la detección de Gal-4, y el ratón anti-tubulina como control para la presencia de proteína intracelular. B) Las fotografías de análisis CPI representante de la localización celular de Gal-4 en Patu-T /Gal-4 y Patu-T /células simuladas. Se detectó Gal-4 utilizando Alexa marcado con anti-gal-4 Abs (verde), la actina se tiñó usando faloidina (rojo) y la tinción del núcleo obtenido usando HOESCHS (azul); el tercer panel muestra la fusión de las diferentes coloraciones. Bar = 25 micras.
La localización celular de Gal-4 se estudió adicionalmente usando CPI. Los resultados muestran una alta intensidad de fluorescencia por todo el citoplasma de las células Pätu-S (Figura 3), lo que indica que la mayor parte Gal-4 se localiza en el citosol. Alta fluorescencia se observó en la membrana citoplasmática en las células individuales y entre las células, en particular en los sitios de contacto entre las células vecinas (contactos célula-célula), mientras que se detectó casi ninguna fluorescencia en el núcleo. Gal-4 no se distribuye homogéneamente en el citoplasma, que muestra algunas áreas con niveles de fluorescencia más altas que otras, aunque no hay indicios claros de orgánulos específicos implicados en la acumulación de Gal-4. En las células-T Patu, sin Gal-4 podría no detectarse utilizando este método, se crea la citometría de flujo de datos que indica que Gal-4 niveles en células Patu-T son muy bajos.
La sobreexpresión de Gal-4 en Patu las células -T
Para evaluar una supuesta implicación de Gal-4 en la migración, Gal-4 se sobreexpresa en las células Patu-T mediante la introducción de un vector viral que contiene el gen hgal-4 conducido por un promotor CMV (PATU -T /Gal-4). Como control, el vector viral sin inserto fue transducida a Patu-T (PATU-T /maqueta). Expresión de proteínas y localización de Gal-4 en las células no tratadas Patu-T y Patu-S, Patu-T /Gal-4 y Patu-T /simulacro se analizaron por Western Blot (WB), CPI y citometría de flujo.
Para determinar el nivel de Gal-4 expresión en las células de líneas, células y el medio se cosecharon después de 4 días de cultivo. Las proteínas presentes en los extractos de células y medianas fueron separadas por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de la tinción de las transferencias con anticuerpo de cabra anti-gal-4 Abs, bandas a 36 kDa correspondiente a la masa aparente de Gal-4 se observaron en Pätu-T /Gal-4 extracto de células y medio, en cantidades similares como se observa en Pätu-S extracto de células y medio, respectivamente (Figura 4A). Como era de esperar, Patu-T /maqueta no mostró bandas detectables a los 36 KDa. Estos resultados indican que Gal-4 se expresa en Pätu-T /Gal-4 en niveles similares en comparación con las células Pätu-S. Por otra parte, cantidades similares de Gal-4 son secretadas por Patu-S y T-Patu /Gal-4 células.
Uso de la CPI, hemos demostrado que la distribución intracelular de Gal-4 dentro de la PaTuT /Gal-4 células es similar a la distribución en las células Pätu-S, mientras que no se detectó Gal-4 en PaTuT /células simuladas (Figura 4B). La distribución de Gal-4 en estas células en el citosol es similar a la distribución en las células Pätu-S. Gal-4 está presente en toda la célula, excepto el núcleo, similar a la observada para Pätu-S. Sin embargo, mientras que Gal-4 está presente en la membrana plasmática de las células Pätu-S, casi ningún Gal-4 se detecta en la membrana de Pätu-T /Gal-4 células permeabilizadas. En conclusión, estos resultados indican que Patu-T /gal-4 expresa y secreta Gal-4 en cantidades similares a las células Patu-S.
Además, determinamos si endógena, y /o añadido Gal recombinante 4 fue obligado a la superficie celular de Patu-T /Gal-4 mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-Gal-4 Abs. La unión de los anti-Gal-4 Abs a la superficie celular no fue diferente entre Patu-T /Gal-4 y Patu-T /Mock (datos no mostrados). Por lo tanto, la capacidad de las células /Patu-T Gal-4 para unirse Gal-4 extracelularmente no ha cambiado en comparación con la línea celular Patu-T sin tratar.
La sobreexpresión de Gal-4 disminuye la capacidad de migración de Patu-T las células
Para examinar si Gal-4 influye en el comportamiento migratorio de las células-T Patu, un ensayo de rayado se realizó a través de Patu-T y Patu-T /Gal-4 células (Figura 5A-B).
Un cero (cicatrización de heridas) ensayo se realizó con Patu-T, Patu-T /Gal-4 y Patu-T /células simuladas. Patu-T /maqueta y Patu-T /Gal-4 células fueron sembradas en una placa de 24 pocillos y se rascó en la superficie con una punta de pipeta de 200 l. Los valores relativos se fijaron en 100% de la anchura de la separación en el momento de la cero.