pancreático (PARP-1)
Extracto
El poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) y autofagia juegan un papel cada vez más importante en la reparación de daños en el ADN y la muerte celular. Gemcitabina (GEM) sigue siendo el fármaco quimioterapéutico de primera línea para el cáncer de páncreas (PC). Sin embargo, poco se sabe sobre la relación entre PARP-1 de expresión y la autofagia en respuesta a GEM. Aquí demostramos que GEM induce respuesta daño de ADN y degradación de mono-ADP ribosiladas PARP-1 a través de la vía de la autofagia en las células PC, que es rescatado por la inhibición de la autofagia. La hipoxia y la privación de suero inhiben la actividad de autofagia debido a abrogada ribosiladas-mono-ADP degradación de PARP-1 inducida por GEM. La activación de quinasas reguladas extracelulares (ERK) de proteínas inducidas por la privación de suero muestra diferencias en la localización intracelular, así como la modulación de la autofagia y PARP-1 en la degradación GEM-sensibles y las células KLM1 KLM1-R resistentes. Nuestro estudio ha revelado un nuevo papel de la autofagia en PARP-1 en respuesta a la degradación del GEM, y los diferentes impactos de la vía de señalización de MEK /ERK en la autofagia entre las células GEM-sensibles y PC -resistant
Visto:. Wang Y, Kuramitsu Y, Tokuda K, Baron B, Kitagawa T, Akada J, et al. (2014) La gemcitabina induce la poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) Degradación través de la autofagia en el cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (10): e109076. doi: 10.1371 /journal.pone.0109076
Editor: A. Shaida Andrabi, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Octubre, 2013; Aceptado: September 8, 2014; Publicado: 1 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo contó con el apoyo de ninguna subvención. 24501352, www.jsps.go.jp/g-grantsinaid. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la gemcitabina (GEM) es actualmente el tratamiento estándar para el cáncer de páncreas avanzado y metastásico (PC) tanto en adyuvantes y paliativos, pero la resistencia a GEM ha sido un gran problema ya que su tasa de respuesta se ha reducido a & lt; 20% [1] - [4]. GEM puede inhibir la síntesis de ADN por la orientación de la ribonucleótido reductasa, lo que lleva a su inclusión en el ADN celular, causando errores de replicación de ADN [5], [6]. Un estudio previo ha informado de que el estrés replicación del ADN inducido por GEM, horquillas de replicación atascadas y provocó la señalización de punto de control vías [7]. La inhibición de la quinasa de punto de control 1 (Chk1) con inhibidores químicos sensibilización de las células PC inducidos en respuesta a GEM [8], [9]. Por otra parte las células HCT116 reparación deficiente desajuste son más sensibles
in vitro
de radiosensibilización GEM mediada [8]. A pesar de la evidencia ha demostrado la relación entre la reparación del ADN y la sensibilización de las células a GEM, los mecanismos responsables de la reparación del daño en el ADN inducido por GEM no se entienden claramente.
La autofagia es una vía celular implicado en la cifra de negocios de rutina de las proteínas o los organelos intracelulares con conexiones cercanas a la enfermedad y la fisiología humana [10]. disfunción autofagia se asocia con el cáncer, la neurodegeneración, la infección microbiana y así como la resistencia de las células cancerosas a la terapia contra el cáncer [11], [12]. autofagia GEM inducida en Panc-1 y MiaPaCa-2 células, y la inhibición de la autofagia por 3-metiladenina (3-ME) o membrana de la vacuola proteína 1 knockdown disminución de la apoptosis en las células tratadas con gemcitabina [13]. Por lo tanto, esta evidencia indica que la autofagia puede desempeñar un papel esencial en la apoptosis de las células PC en respuesta a GEM.
El poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1) juega un papel crítico en muchos procesos moleculares y celulares , incluyendo la reparación de daño en el DNA, la estabilidad del genoma, la transcripción y la apoptosis [14]. PARP1 está implicado en la reparación de los dos ADN de cadena sencilla (ssDNA) y el ADN de doble cadena (dsDNA) se rompe por la unión con los extremos de ADN y /o interacción con las proteínas de reparación del ADN, el Ejemplo subunidades (Ataxia Telangiectasia mutado) ATM y Ku [15 ] - [18]. La inhibición de PARP-1 aumenta la citotoxicidad de los agentes que dañan el ADN y la radiación
in vitro
[19]. inhibidores de PARP-1 se han reportado como posibles fármacos quimioterapéuticos para /cáncer de mama BRCA2 deficientes en BRCA1 y cáncer de pulmón [20] - [21]. Por lo tanto, es necesario evaluar los cambios de PARP-1 responsable de daño en el ADN inducido por GEM en PC
.
En el presente estudio, hemos demostrado que la proteína asociada a los microtúbulos 1A /1B-3 de cadena ligera (LC3) , un factor clave de la formación de autofagosoma, es el regulado en KLM1-R en comparación con las células KLM1. GEM indujo una respuesta al daño del ADN y la autofagia en las células KLM1 y KLM1-R y las reguladas PARP-1 de expresión. La inhibición de la autofagia bloquea la degradación inducida por el GEM de mono-ADP ribosylated PARP-1. La vía de señalización MEK /ERK mostró un efecto diferente en la autofagia y GEM inducida por la degradación de PARP-1 entre células KLM1 y KLM1-R. Así podemos destacar una nueva visión con respecto a la vía de la autofagia en la regulación de la degradación de PARP-1 en las células PC.
Material y Métodos
Materiales
U0126 (9903S) y wortmanina (9951S) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología. Los anticuerpos específicos para p-ERK (sc-7383), ERK (SC-94200), p21 (SC-65595), Hsp27 (SC-13132), PARP-1 (SC-8007 para la transferencia de western y el SC-1562 para la confirmación e inmunofluorescencia), CtIP (sc-3970) y la actina (sc-1616) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos específicos para LC3A /B (4108S), SIRT6 (12486), caspasa-3 (9665) y PI3KCIII (4263S) se adquirieron de Cell Signaling Technology. Los anticuerpos específicos para Bcl2 (B3170), Ulk1 (SAB4200106) y Beclin1 (B6061) se adquirieron de Sigma. Los anticuerpos específicos para AMPKα1 (07-350) se adquirieron de Millipore.
Cultivo de células
Todas las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron publicados anteriormente líneas celulares que fueron proporcionados a nosotros como un regalo . línea celular pancreática humana KLM1 (ID: TKG0490) se clonó y se estableció por el Dr. M Kobari del Instituto de Departamento, Envejecimiento y Cáncer de la Universidad de Tohoku (Sendai, Japón) en 1996 [39]. KLM1 GEM-sensible y líneas de células cancerosas resistentes KLM1-R humanos pancreáticas fueron proporcionados generosamente como regalo por el Departamento de Cirugía y Ciencia en la Universidad de Kyushu Facultad de Ciencias Médicas. KLM1-R se ha establecido la exposición de las células a KLM1 GEM en estudios previos [40] - [41]. Estas células se cultivaron en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; GIBCO, 05918), suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS; GIBCO, 26140-079), y 2 mM L-glutamina y se incubaron a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2.
la transfección transitoria
KLM1 células Se sembraron y se incuba a 37 ° C en un CO
2 incubadora hasta que las células son 70% de confluencia. Las células fueron transfectadas con siRNA validado LC3B humana (sc-43390, Santa Cruz Biotechnology) o Control de siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology) siguiendo un protocolo de transfección siRNA (Santa Cruz Biotechnology).
Western Blot
Las células se lisaron con tampón de lisis ((1% NP-40, 1 vanadato de sodio mM, PMSF 1 mM, Tris 50 mM, NaF 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 165 mM, 10 mg /ml leupeptina, y 10 g /ml de aprotinina) en hielo durante 1 h. lisados celulares se centrifugaron a 15.000 xg durante 20 min a 4 ° C. se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se determinó por el ensayo de Lowry. cantidades iguales de proteína (20 g) se resolvieron por 5-20% de gel de SDS-poliacrilamida y luego se transfiere a una membrana de PVDF (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA).. la membrana se incubó con el anticuerpo primario adecuado a 4 ° C durante la noche entonces, la membrana se lavó y se incubó con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. las inmunotransferencias se visualizaron con un reactivo de quimioluminiscencia (Immunostar, Wako). Todos los experimentos se repitieron tres veces.
inmunofluorescencia
Las células fueron cultivadas en 15 mm cubreobjetos redondos en placas de 12 pocillos a una densidad de 1 x 10
5 células por pocillo. Las células sobre los cubreobjetos se fijaron usando fresco 3,7% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 min cuando alcanzaron el 70-80% de confluencia. a continuación, las muestras se lavaron con PBS, seguido por permeabilización con 0,1% Triton X-100 durante 15 min. Después de lavar con PBS, se incubaron en solución de bloqueo (suero de cabra al 1% o suero de burro 1% en PBS con 0,1% de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se trataron con un anticuerpo primario en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación con el anticuerpo primario, las células fueron lavadas con PBS con 0,1% de Tween 20 (PBS-T) y se incubaron con un anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS-T, sus núcleos eran contra-teñidas con 1,43 M DAPI (4,6 '-diamidino-2-fenilindol) durante 5 minutos. Los cubreobjetos se lavaron con PBS-T, después se monta boca abajo en portaobjetos con Fluoromount (Applied diagnóstico, Pleasanton, CA, EE.UU.). Confocal de imágenes se obtuvieron utilizando Nikon plan Apo 60X /1.40 objetiva, la serie BZ-9000 (BIOREVO) y software de visualización BZ-II (Keyence, Osaka, Japón) por un operador que no estaba al tanto de la condición experimental. Todos los parámetros se mantuvieron constantes dentro de cada experimento. Las imágenes digitales fueron analizados y la intensidad media se midió utilizando el software Image J..
Apoptosis ensayo
se sembró y se trató durante 24 h un número apropiado de células. Las células se tiñeron mediante el uso de Apo-BrdU
In Situ
kit de ensayo de fragmentación del ADN (80101, Biovision, Inc.) (datos no mostrados) o caspasas 3/7 kit de ensayo (12D51, inmunoquímica Technologies, LLC.). Estos experimentos se llevaron a cabo siguiendo estrictamente las instrucciones de los protocolos relativos.
Resultados
gemcitabina (GEM) induce la autofagia en las células PC
Dos líneas celulares de cáncer de PC GEM-sensitiive KLM1 y resistentes a KLM1-R, se utilizaron en este estudio. Estas líneas celulares se definen por su expresión de la proteína de choque térmico 27 (Hsp27) (Fig 1 A y B.), Que ha sido reportado como un marcador potencial para la PC-resistentes a GEM [22] - [24]. Además se demostró la expresión de p21 a reducirse en KLM1-R en comparación con células KLM1 (Fig. 1 B), indicando los diferentes fenotipos de ciclo celular entre ellos. A continuación, investigaron la actividad de autofagia en las células KLM1 y KLM1-R, el cual fue determinado por la expresión de LC3 [25]. Hemos demostrado que tanto LC3-I y II se redujeron regulado en KLM1-R en comparación con las células KLM1 (Fig. 1 B). Por otra parte, se mostraron baja regulación de la proteína quinasa activada por AMP A1 (AMPKα1) y la quinasa 1 (Ulk1) unc-51-al igual que, a diferencia de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K CIII) o miosina-como la proteína BCL2 interactuar espiral de la bobina ( beclin-1), en KLM1-R en comparación con las células KLM1 (Fig. S1 a y B), lo que indica que la reducción de la actividad de autofagia en las células KLM1-R GEM-resistente puede estar relacionado con la baja regulación de AMPKα1 y /o Ulk1 expresión. Para determinar el efecto de la autofagia inducida por GEM, las células se trataron con GEM durante 5 horas (h) y luego observadas por microscopía de inmunofluorescencia utilizando tinción de anticuerpos anti-LC3. En esta configuración experimental, hemos demostrado que los puntos LC3 II se incrementaron después de las células fueron expuestas a GEM (Fig. 1 C). Estos datos sugirieron que GEM induce la autofagia en las células PC.
(A) La expresión de Hsp27 se puso a prueba de Western Blot y la intensidad relativa se midió por estudiante-
t
ensayo (n = 3 ) (células B) y KLM1 KLM1-R se lisaron y se resolvieron por SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. La actina se utilizó para normalizar los niveles de carga de proteína. (C) Las células indicadas fueron tratados con 100 mg /ml de GEM para 5 h y la expresión de LC3A /B y la formación de autofagosomas LC3-positivo fueron examinadas por microscopía confocal. LC3A /B: verde y DAPI: azul. Las flechas indican la autofagosoma. Barra de escala, 20 micras.
GEM específicamente regula a la baja mono-ADP ribosylated PARP-1 de una manera independiente de caspasas
Además, la prueba el efecto de GEM en PARP-1 expresión en células PC mediante un análisis de transferencia Western. KLM1 y KLM1-R mostraron una notable reducción de la PARP-1 cuando las células fueron expuestas a 10 o 100 mg /ml de GEM durante 24 h (Fig. 2 A). Curiosamente, se observó que las reducciones de bandas de PARP-1 en los paneles inducidas por GEM mostraron un ligero aumento en el peso molecular que en los paneles no tratados. Así, este sugirió que GEM induce específicamente la baja regulación de la PARP-1, que era mono-ADP ribosylated (Fig. 2 A). Zhiyong Mao
et al.
Había definido la banda superior de la PARP-1 como el mono-ADP ribosylated forma en el residuo lisina 521 que fue inducida por Sirtuina 6 (SIRT6) [26]. SIRT6 es un homólogo de mamífero de la levadura Sir2 deacetilasa y participar en la producción de citoquinas y la migración de PC [27]. Por otra parte, KLM1-R mostró una mayor sensibilidad a la GEM-inducida baja regulación de PARP-1 que las células KLM1. Ten g /ml de GEM fue suficiente para reducir significativamente gran parte de la expresión de PARP-1 en KLM1-R en comparación con células KLM1 (Fig. 2 A). Para encontrar la explicación, a continuación, comparó la expresión de SIRT6 entre las células y KLM1 KLM1-R. Como era de esperar SIRT6 mostró expresión más fuerte (aproximadamente 1,5 veces) en KLM1-R que las células KLM1 (Fig. 2 A). Esto indicó que la eficiencia de GEM en la baja regulación de mono-ADP ribosiladas PARP-1 puede depender de la expresión de SIRT6. También observamos que GEM indujo la sobreexpresión de CtBP interacción proteína-(CtIP) tanto en células KLM1-R (Figura 2 A) y KLM1. Debido a que los familiares proteasa escinde el sustrato de la caspasa muerte de PARP-1 a una forma específica de 85 kDa observada durante la apoptosis [28], el próximo investigó si la caspasa-3/7 se relaciona con la PARP-1 baja regulación en el presente documento. Hemos puesto de manifiesto que el nivel de actividad de la caspasa-3/7, así como apoptosis no mostraron diferencias entre las células KLM1 y KLM1-R incluso cuando las células se sometieron a tratamiento GEM durante 24 h como se muestra mediante transferencia Western (Fig. 2 A) y la caspasa-3 /7 ensayo de actividad (Fig. 2 B). Estos datos sugirieron que GEM específicamente las reguladas mono-ADP ribosiladas PARP-1 de una manera independiente de caspasas.
células (A) y KLM1 KLM1-R fueron tratados por GEM con las concentraciones indicadas durante 24 h. Los lisados celulares se resolvieron en SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. La expresión de PARP-1 se confirmó en varias ocasiones por un PARP-1 anticuerpo distinta se describe en Materiales. Una punta de flecha indica la forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. Las flechas indican la posición del área de la caspasa-3 escindida. (B) Las células indicadas se trataron como en (A) y después se tiñeron utilizando un kit de ensayo de caspasas 3/7 (A). Caspasa 3/7 actividad se puso a prueba y se mide mediante microscopía confocal e Imagen J. N. S., no significativa. Las barras de error, Dakota del Sur.
GEM suprime la expresión de mono-ADP ribosiladas PARP-1 a través de la vía de degradación de la autofagia
Como GEM induce la autofagia y el mono-ADP ribosylated PARP-1 regulación a la baja de manera independiente de caspasas, se investigó si mono-ADP ribosylated PARP-1 podría ser degradado directamente por autofagia. células KLM1 y KLM1-R se tiñeron con tanto anti-LC y anti-PARP-1 de anticuerpos después de células fueron expuestas a GEM para 5 h y luego examinadas por microscopía de inmunofluorescencia. se encontró formación autophagosome inducida por GEM para co-localizate con PARP-1 en ambos KLM1 y KLM1-R células (Fig. 3 A), lo que indica la relación entre la autofagia y PARP-1. Para probar GEM inducida por la baja regulación de mono-ADP ribosylated PARP-1 a través de la autofagia, LC3B siRNA, wortmanina (un inhibidor de PI3K) y PMSF (un inhibidor de la proteasa vacuolar) fueron utilizados para inhibir la autofagia de las células en respuesta a GEM. GEM inducida PARP-1 de mono-ADP ribosilación y baja regulación en KLM1, y la baja regulación de la PARP-1 fue revertido por LC3B desmontables (Figura 3 B). Esta reducción de la PARP-1 expresión de GEM, tanto en células KLM1-R KLM1 y también fueron rescatados por el tratamiento con wortmanina o PMSF (Fig. 3 C). En conjunto, estos datos demuestran que GEM-inducida baja regulación de mono-ADP ribosylated PARP-1 fue mediado por la vía de degradación de la autofagia.
células (A) y KLM1 KLM1-R fueron tratados con 100 mg /ml de GEM durante 5 h. Las células tratadas se tiñeron con anticuerpos específicos contra LC3A /B y PARP-1 y luego detectados por microscopía confocal. LC3A /B: verde, PARP-1: rojo y DAPI: azul. Barra de escala, 20 micras. Las flechas indican la tinción amarilla de los co-localizaciones entre autofagosoma y PARP-1. células (B) KLM1 fueron expuestos a GEM durante 24 h después de la caída LC3B. células (C) y KLM1 KLM1-R fueron expuestos a GEM durante 24 h en el presente o ausente de cualquiera de PMSF o wortmanina a las concentraciones indicadas. Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos frente a PARP-1. La punta de la flecha indica la forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. La expresión de PARP-1 se confirmó en varias ocasiones por un PARP-1 de anticuerpos diferentes que se describen en Materiales.
Suero hambre induce la activación y diferente localización de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) en KLM1 y KLM1- células R
para determinar el efecto de la privación de suero sobre la actividad de ERK y la autofagia, las células se cultivaron en medio fresco con o sin FBS durante 24 horas y se examinaron mediante transferencia de western y microscopía de inmunofluorescencia. Hemos demostrado que ERK fue activado por la privación de suero en las células KLM1 y KLM1-R y que GEM no tiene ningún efecto sobre la actividad de ERK (Fig. 4 A). Ahora vamos a examinar la localización intracelular de fosfo-ERK por inmunofluorescencia en células KLM1 y KLM1-R. Curiosamente, se demostró una notable diferencia en la localización intracelular de p-ERK entre ellos. En virtud de la privación de suero, p-ERK se transloca parcialmente en el núcleo de las células KLM1; por el contrario, ERK activada estaba presente únicamente en el citoplasma de las células KLM1-R (Fig. 4 B). Estos resultados sugieren que la privación de suero inducida por la activación de ERK en las dos KLM1 y KLM1-R, pero dieron como resultado una diferencia en la localización intracelular entre ellos.
células (A) y KLM1 KLM1-R se cultivaron en medio con o sin FBS o expuestos a 10 mg /ml de GEM para 24 h. Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos frente a p-ERK y ERK. (B) y (C) Las células indicadas se tiñeron con anticuerpos específicos contra p-ERK, Hsp27 y LC3A /B después de las células se cultivaron en medio con o sin FBS durante 24 h. DAPI: azul y p-ERK: rojo (B) y LC3A /B: verde y Hsp27: rojo (C). Barra de escala, 20 micras.
Suero hambre suprime GEM-inducida por la degradación de PARP-1 mediante la inhibición de la autofagia a través de la vía de señalización de ERK
A continuación examinó la actividad de autofagia después de la privación de suero en KLM1 y las células KLM1-R en combinación con un inhibidor extracelular (ERK) quinasa regulada por señales (MEK), U0126, para evaluar los efectos de la vía MEK /ERK en la autofagia. Hemos demostrado que la expresión de LC3 se redujo por la privación de suero durante un transcurso de tiempo de 24 h en células KLM1 y KLM1-R (Fig. 5 A y B) y rescatado por U0126 en KLM1 (Fig. 5 A) pero mucho menos en KLM1-R (Fig. 5 B). La actividad de ERK todavía mostraba una tendencia creciente en KLM1-R cuando son tratados con U0126 (Fig. 5 B), lo que indica una tolerancia a U0126 KLM1-R en comparación con las células KLM1. Estos datos indicaron que la inhibición de la autofagia inanición inducida por el suero estaba mediada por la vía de señalización MEK /ERK. Bajo la privación de suero, U0126 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de células B de leucemia /linfoma 2 (Bcl2) en células KLM1 y KLM1-R y la reducción de p21 se retrasó por tratamiento con U0126 en KLM1 pero no en células KLM1-R ( Fig. S2 a y B), lo que sugiere que el inhibidor de MEK tuvo una eficacia diferente en la progresión del ciclo celular entre las células KLM1 y KLM1-R. Debido a que el inhibidor de MEK mostró diferente eficacia en la modulación de la autofagia entre las células KLM1 y KLM1-R bajo la privación de suero, se investigó su eficacia en la degradación de PARP-1 en respuesta a GEM. De hecho, GEM-inducida por la degradación de PARP-1 fue inhibida por la privación de suero en las células KLM1 y KLM1-R de una manera independiente de caspasas y se invirtió sólo en las células KLM1 por U0126 (Fig. 5 C y D). Por otra parte, el tratamiento por U0126 solo no tuvo influencia en PARP-1 de expresión. Estos datos sugirieron que la privación de suero suprime la autofagia y GEM-inducida por la degradación de PARP-1 a través de la activación de la vía de señalización de ERK, con células KLM1 y KLM1-R mostrando diferentes sensibilidades al inhibidor de MEK U0126.
(A) KLM1 y células KLM1-R fueron expuestos a 10 mg /ml de GEM en presencia o ausencia de 20 mM de U0126 para los cursos de tiempo indicados. Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos frente a p-ERK y LC3A /B. (B) y las células KLM1 y KLM1-R (C) se cultivaron en el medio con o sin FBS y mientras tanto expuestos a una o ambas GEM y U0126 a la concentración indicada. Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. La punta de la flecha indica la forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. Las flechas indican la posición de la zona de exfoliados caspasa-3. La expresión de PARP-1 se confirmó en varias ocasiones por un PARP-1 de anticuerpos diferentes que se describen en Materiales.
Hipoxia inhibe la autofagia y el IPG inducida por la degradación de PARP-1
La hipoxia conduce a la celda la detención del ciclo a través de la síntesis de p21 disminuyó [29]. Se confirmó que la expresión de p21 se redujo reguladas y Hsp27 es regulada hasta en un 1% de O
2 hipoxia durante 24 horas en células KLM1 y KLM1-R; Sin embargo, la hipoxia no tuvo influencia sobre la expresión de fosfo-ERK y Bcl2 (Fig. 6 A). En condiciones de hipoxia, tanto la expresión AMPKα1 y Ulk1 se redujeron regulado en las células KLM1 y KLM1-R y la expresión de LC3 en KLM1 fue hasta el mismo nivel que en las células KLM1-R no tratados (Fig. 6 A), lo que indica que la hipoxia cambio fenotípico inducido en KLM1 lleva a una condición KLM1-R-like y la inhibición de la autofagia. Por lo tanto hemos probado si la hipoxia inhibe GEM-inducida por la degradación de PARP-1. El análisis de transferencia Western demostró que la inducida por la degradación GEM PARP-1 fue notablemente suprimida por la hipoxia de una manera independiente de caspasas en tanto KLM1 y células KLM1-R (Fig. 6 B). Estos resultados indican que la hipoxia suprime GEM inducida por la degradación de PARP-1 mediante la reducción de la actividad de autofagia.
células (A) y KLM1 KLM1-R fueron cultivadas en condiciones normales o 1% O
2 hipoxia durante 24 horas y, a continuación lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. (B) Las células indicadas se cultivaron en condiciones normales o 1% O
2 hipoxia junto con 10 g /ml de GEM durante 24 horas. Los lisados celulares se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. Una punta de flecha indica la forma ribosylated mono-ADP de PARP-1. Las flechas indican la posición de la zona de exfoliados caspasa-3. La expresión de PARP-1 se confirmó en varias ocasiones por un PARP-1 de anticuerpos diferentes que se describen en Materiales.
Discusión
La autofagia puede ser elevado por el GEM en el tratamiento de las células PC [13 ]. células PC mostraron ser más sensibles al efecto citotóxico de GEM cuando este se combinó con los cannabinoides a través de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediada por la muerte celular autofágica [30]. En este estudio, hemos demostrado que la actividad de autofagia se redujo en GEM resistente KLM1-R en comparación con las células -sensible KLM1. Por lo tanto, la reactivación de la autofagia podría ser una estrategia útil para resensitising PC a GEM. Sin embargo poco se sabe sobre el papel de la autofagia en respuesta al daño del ADN inducido por GEM. Hay evidencia importante que la autofagia está asociada con el procesamiento de doble filamento se rompe (DSBs) y la muerte celular en respuesta al daño del ADN en la levadura a través de la degradación de la proteína acetilado recombinación SAE2 (CtIP humana) [31]. La inhibición /ablación de histona desacetilasas (HDACs) induce la autofagia y la acetilación de un número de proteínas de respuesta al daño del ADN (DDR), incluyendo Sea2 y Exo1 [31], [32]. Aquí mostramos que GEM induce una respuesta de daño del ADN (observado a través de la sobreexpresión CtIP por Western blot) y mono-ADP ribosiladas PARP-1 degradación que conduce a un aumento de la autofagia. Por lo tanto implicado autofagia en la reparación de daño del ADN puede ser a través del control de PARP-1 en lugar de la degradación CtIP (levadura SAE2) en PC humano. Sin embargo, si la ribosilación mono-ADP de PARP-1 es necesaria para la degradación de la autofagia y cómo esta degradación específico se ejecuta en respuesta a GEM se deberían aclarar en mayor estudio.
Ablación de PARP-1 no interfiere con DSB reparación, pero los retrasos reactivación del estancado horquillas de replicación [33]. Por lo tanto, la degradación inducida por GEM de PARP-1 puede contribuir a las horquillas de replicación GEM-estancado. respuesta OSD factores se requieren ATM, Mre11, Rad50 y para la supervivencia celular después de tenedor de replicación estancamiento en respuesta a GEM inducida por daño en el DNA [34]. Reinicio de las horquillas de replicación en punto muerto y la reparación de las horquillas de replicación se derrumbó requieren actividad RAD51 y RAD51 mediada por vía de recombinación homóloga (HR), respectivamente [35]. Por otra parte, se demuestra que CtIP se sobreexpresa en respuesta a GEM en KLM1 y células KLM1-R (Fig. 2 A). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que se requiere la reparación de DSBs para la supervivencia de las células, así como células PC después de daño en el ADN inducido por GEM. CtIP ha demostrado ser hasta reguladas en tanto KLM1 y KLM1-R inducida por GEM, pero su estabilidad parece más fuerte en KLM1-R, en particular durante un ataque de concentración de 10-100 mg /ml GEM, que expresa un mayor nivel de SIRT6 en comparación con las células KLM1 (Fig. 2 a). SIRT6 promueve la estabilidad del ADN y la activación y estabilización de CtIP por desacetilación [31], [35], lo que indica un posible mecanismo para la menor sensibilidad de KLM1-R a GEM comparación con las células KLM1. Por otra parte, estudios recientes sugieren que los inhibidores de PARP son particularmente letal para las células deficientes en la recombinación homóloga (HR) las proteínas a través de la desregulación de extremos no homólogos propenso a errores de unión [36]. Del mismo modo, por lo tanto, la combinación de un tipo de inhibidor de HR con GEM (como un supresor de PARP-1) puede ser una estrategia terapéutica potencial para el PC. Sin embargo, hay una limitación importante porque la privación de suero y la hipoxia (imitando microambientes tumorales
in vivo
) inhiben GEM inducida por la degradación de PARP-1 mediante la reducción de la actividad de autofagia (Fig. 5 y 6). Por lo tanto, el candidato preferido para la terapia de combinación con GEM no sólo debería inhibir los componentes de DSBs sino también promover la autofagia, por ejemplo una histona deacetilasas inhibidor, a saber, el ácido valproico [37]. Se necesitan más estudios para probar si este inhibidor podría potenciar la muerte celular de la PC en respuesta a GEM.
El inhibidor de MEK U0126 muestra diferentes efectos sobre el nivel de la autofagia y PARP-1 en respuesta a la degradación GEM entre KLM1 y KLM1 -R células, lo que indica que posiblemente existen limitaciones en la estrategia terapéutica para la orientación del EGFR vía /Ras /ERK en la PC. Se presume que las diferencias observadas dependen de una de las tres posibilidades: 1.) Las diferencias en la localización intracelular de ERK activado entre KLM1 y células KLM1-R (Fig 4 B); 2) un desconocido vía para la reactivación ERK señalización en respuesta al inhibidor de MEK (Fig 5 B) evaluación [37], [38].; 3) inducida por el suero baja regulación de ULK1 en las células KLM1-R que conducen a la autofagia no controlado por ERK (Fig. S1 B).
En este estudio, se revelan nuevos aspectos más destacados que funciona como un supresor de GEM de PARP-1 mediante la promoción de la ruta de degradación de la autofagia y presentar las sugerencias relacionadas acerca de las características deseadas de posibles candidatos para la terapia de combinación con GEM para PC.
Apoyo a la Información
Figura S1. células
(A) y KLM1 KLM1-R se lisaron y se resolvieron en SDS-PAGE y se sondaron con anticuerpos específicos. La actina se utilizó para normalizar los niveles de carga de proteína. las células (B) KLM1 y KLM1-R se cultivaron en medio con o sin FBS o expuestos a 10 mg /ml de GEM para 24 h. Los lisados celulares se resolvieron en SDS-PAGE y se probaron con anticuerpos específicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0109076.s001 gratis (TIF)
figura S2. células
KLM1 (A) y KLM1-R (B) fueron expuestos a 10 mg /ml de GEM en el presente o ausente, de 20 M de U0126 para los cursos de tiempo indicados. Los lisados celulares se resolvieron en SDS-PAGE y se probaron con anticuerpos específicos frente a p21 y Bcl2. Las intensidades relativas de western blot se midieron y se muestran en esta figura
doi:. 10.1371 /journal.pone.0109076.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos Ikeda E. y D. Cui que nos dejaron usar una incubadora de hipoxia.