Extracto
La genisteína es una isoflavona encuentra en la soya, y sus efectos quimio-preventivas y -therapeutic han sido bien establecidos de
in vitro
estudios. Recientemente, sin embargo, sus acciones terapéuticas
in vivo
han sido cuestionados debido a los informes contradictorios de estudios en animales, que se basan en modelos de roedores o la implantación de líneas celulares en animales. Para aclarar
in vivo
efectos de la genisteína en pacientes con cáncer avanzado de próstata, hemos desarrollado un modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata derivado del paciente, en el que una pieza de prostatectomía clínica se injertó en ratones inmunodeficientes. Nuestros resultados mostraron un aumento de nodo linfático (LN) y las metástasis de órganos secundarios en ratones genisteína tratados en comparación con los controles no tratados. Curiosamente, las células malignas invasivas agregados para formar islas /micrometástasis sólo en los órganos secundarios de los grupos de genisteína tratados, no en el grupo control no tratado. Para comprender el mecanismo subyacente para la progresión metastásica, se analizó la proliferación celular y la apoptosis en secciones de parafina. datos inmunohistológicos mostrar que los tumores de los grupos tratados con genisteína tienen células cancerosas apoptóticas más proliferantes y menos que los del grupo no tratado. Nuestros datos de inmunotransferencia sugieren que el aumento de la proliferación y la metástasis están vinculados a las actividades mejoradas de tirosina quinasas EGFR, y su corriente abajo Src, en grupos de genisteína tratados. A pesar de los efectos quimiopreventivos propuestas por
in vitro
en estudios anteriores, el efecto promotor del cáncer de genisteína observado aquí sugiere la necesidad de una cuidadosa selección de los pacientes y la planificación de los ensayos clínicos más seguro
Visto:. Nakamura H , Wang y, Kurita T, H Adomat, Cunha GR, Wang y (2011) La genisteína Aumenta factor de crecimiento epidérmico receptor de señalización y promueve la progresión tumoral en el cáncer avanzado de próstata humano. PLoS ONE 6 (5): e20034. doi: 10.1371 /journal.pone.0020034
Editor: Robert Z. Qi, de la Universidad de Hong Kong de Ciencia y Tecnología, Hong Kong
Recibido: 7 Febrero, 2011; Aceptado: April 10, 2011; Publicado: 16 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Nakamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Instituto canadiense de Investigación en Salud (RP-86730: YZW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el tumor maligno no cutáneo más comúnmente diagnosticado entre los hombres de América del Norte [1]. En 2009, alrededor de 192, se diagnosticaron 280 nuevos casos de cáncer de próstata, y 27, se reportaron 360 muertes en los Estados Unidos, lo que la sitúa segunda más alta de mortalidad tras el cáncer de pulmón [2]. En comparación con los EE.UU., las tasas de incidencia y mortalidad de cáncer de próstata son considerablemente más bajos en Asia [3], [4], [5]. estudio de la inmigración han demostrado que los asiáticos, que han adoptado la dieta occidental después de la inmigración a los EE.UU., tuvieron una incidencia significativamente mayor de cáncer de próstata que los nativos de los países asiáticos [6], [7]. Entre las muchas diferencias dietéticas entre América del Norte y Asia, la diferencia en el consumo de soja es excepcional. Se estima que los asiáticos consumen 20-50 veces más alimentos a base de soja per cápita en comparación con los norteamericanos [8]. informes epidemiológicos previos han indicado una correlación inversa entre el consumo de soja y el riesgo de CaP, lo que sugiere efectos quimiopreventivos de soja [9]. El componente activo primario de la soja es una isoflavona llamada genisteína (4,5,7-trihydroxyisoflavone) [10], [11], [12], [13]. Debido a la estructura molecular similar al estradiol, la genisteína se sabe que presentan actividad estrogénica débil por la unión al receptor de estrógeno (ER) y modulando así regulados por estrógenos la transcripción de genes en los órganos diana [14], [15].
los efectos anticancerígenos de la genisteína se han estudiado bien
in vitro Opiniones y reportado en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo leucemia, pulmón, próstata y de mama [16], [17], [18], [19]. Los datos de los estudios anteriores demuestran que la genisteína tiene un amplio espectro de efectos biológicos, que incluyen: inducción de la diferenciación celular y la apoptosis [17], [18], [19], [20], la inhibición del crecimiento celular [19], [21 ], [22], [23], [24], y la derogación de las vías de transducción de señales [25], [26], [27]. La genisteína, por lo tanto, ha atraído una considerable cantidad de atención en la investigación del cáncer, especialmente por su acción inhibidora sobre la proteína tirosina quinasa (PTK) actividades que son importantes para la supervivencia y la proliferación [25] celular, [26], [27].
a pesar de estos prometedores
in vitro
de datos contra el cáncer en, reciente
in vivo
estudios han reportado resultados contradictorios acerca de los efectos de la genisteína sobre la metástasis. Los estudios en modelos TRAMP y PC-3 en animales han demostrado que la genisteína inesperado aumento de la metástasis [28], [29], mientras que otro estudio que utiliza un PC-3M
in vivo
modelo mostró el efecto contrario [30]. Estos informes, en combinación con los resultados preliminares no concluyentes de la fase II de ensayos clínicos [31], [32] sugieren la necesidad de un examen más detallado de los efectos de la genisteína
in vivo
utilizando modelos que son clínicamente más relevante que otra convencional
in vivo y modelos que se basan en el uso de líneas celulares.
en nuestro estudio, hemos utilizado una técnica de xenoinjertos sub-renal empleando la mínima paso del espécimen CaP derivados del paciente en diabéticos no obesos, severa combinado inmunodeficientes (NOD-SCID). Los xenoinjertos de cáncer humano preservan fielmente las características histopatológicas y genotípicas de la muestra clínica original [33], [34]. Utilizando nuestro sistema de xenoinjerto PCa derivado del paciente, se ha encontrado que la genisteína en dosis farmacológica aumenta la proliferación celular, disminuye la apoptosis y promueve la metástasis en un PCa humana avanzada. Tales efectos promotores de tumores de la genisteína se asocian con un aumento de la fosforilación de EGFR y Src tirosina quinasas.
Métodos
1. Materiales y animales
La línea de tumor LTL163a (www.livingtumorlab.com) se deriva de una muestra de cáncer de próstata de alto grado obtenido de un paciente, y la línea de trasplante de tumor de xenoinjerto se desarrolló a partir de esta muestra de tejido clínico como anteriormente se describe [33], [34]. Se obtuvo consentimiento escrito del paciente, así como la aprobación ética de la Universidad de la Junta Ética de la Investigación-British Columbia Cancer Agency British Columbia (UBC BCCA REB), Vancouver, Canadá. cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC), y el uso de animales para nuestros experimentos fue examinado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica (Permiso #: A10 -0100).
en pocas palabras, el tejido tumoral se redujo de manera uniforme en varios trozos más pequeños, 1 x 3 x 3 mm, y se injerta bajo la cápsula renal de ratones machos NOD-SCID que fueron 6-8 semanas de edad [33 ], [34]. Dos piezas de tumor por el riñón se colocaron bajo la cápsula renal. los ratones de acogida se complementaron con pellets de testosterona (10 mg /ratón), que fueron preparados con una prensa de pellets PARR (Parr Instrument Co., Moline, Illinois) y implantado subcutáneamente para promover el crecimiento celular. Los injertos fueron cultivadas en el sitio renal para 60~90 día, cosechadas, y las porciones de los injertos se fijaron para el análisis histopatológico. Para desarrollar una línea de trasplante del tumor, los injertos tumorales recogidas exhiben un crecimiento rápido se cortaron en trozos pequeños y re-injertados en el riñón de los nuevos huéspedes. Después de tres generaciones de trasplante, se observaron nódulos linfáticos inflamados, que fueron dividido en dos partes y se examinaron histológicamente para la metástasis. Una vez que se confirmó la metástasis, tejidos de ganglios linfáticos frescos que contienen depósitos metastásicos se volvieron a trasplantar en el riñón para desarrollar una línea de tumor metastásico y designados LTL163a.
2. La genisteína tratamiento
Con el fin de estudiar los efectos farmacológicos de la genisteína en la metástasis del cáncer de próstata humano, se optó por utilizar la línea de tumor metastásico LTL163a, que se deriva de la 10
ª generación de trasplante. Los tumores se cortaron en trozos de 1 x 3 x 3 mm y dieciocho injertados en ratones machos NOD-SCID con cada riñón tiene un injerto de tumor (2 injertos /ratón). pellets de testosterona (10 mg) se implantaron subcutáneamente como se describe anteriormente en todos los animales en el momento de injerto para mantener un nivel adecuado de testosterona en suero porque la genisteína-tratamiento se ha demostrado disminuir los niveles de testosterona en suero a través del eje hipotálamo /pituitaria /gonadal [35] . Siete días después del injerto, los animales se dividieron aleatoriamente en tres grupos; el control (sin tratar), de baja dosis y dosis altas de genisteína (pureza & gt; 99%, LC Laboratories, Woburn, MA). Los ratones en el grupo de dosis baja se les dio la genisteína disuelto en aceite de cacahuete por sonda a 2 mg /día (80 mg /kg de peso corporal /día). Los ratones en el grupo de dosis alta se les dio 10 mg /día (400 mg /kg /día) de genisteína. Los ratones de control recibieron 0,1 ml de solamente aceite-vehículo. Todos los grupos fueron alimentados con la misma dieta de roedores (PicoLab Dieta de roedores 20) y teniendo en cuenta autoclave de agua potable. tratamiento genisteína se inició una semana después de injerto y se continuó durante tres semanas. Los injertos fueron cultivadas en el riñón para un total de 4 semanas. Al final de la 4
ª semana, las muestras de sangre y órganos (riñón con injertos de tumores, hígado, pulmones, el bazo y los ganglios linfáticos) se recogieron para su análisis.
3. Medición de los niveles séricos de genisteína
LC-MS (espectrometría de líquido cromatografía de masa) se utilizó para medir el nivel en suero de genisteína. En primer lugar, las muestras de suero congeladas se descongelaron en hielo, y se añadieron 5 l de 1 mg de luteolina /ml en etanol a 25 l de suero como estándar interno (IS). La extracción se lleva a cabo por agitación con 80 l de acetonitrilo y 5 l de HCl 0,2 M. El extracto se clarificó por centrifugación durante 5 minutos a 20.000 x g, y el sobrenadante se recogió, se diluyó 1:01 con agua destilada, y se centrifugó durante otros 5 minutos. Se analizaron los sobrenadantes resultantes. Un ACQUITY UPLC con una columna C18 1,7 M 2,1 × 100 mm BEH acoplado a un detector PDA en línea con un Quattro Premier XE (Waters, Milford, MA) se utilizó con agua y acetonitrilo que contiene ácido fórmico al 0,1% como fases móviles. Se utilizó un gradiente de acetonitrilo 25-100% a partir de 0,2-2,0 minutos, seguido de re-equilibrado a las condiciones de partida para un tiempo total de funcionamiento de 4,5 min. La MS se hizo funcionar a una resolución capilar unidad con 3 kV, 120 ° C y 350 ° de origen y temperaturas de desolvatación C, 50 y 1000 L /hr cono y desolvatación N 2 flujos de gas
y gas de colisión Ar establecidos para 5.0e
-3 mbar. M /z 287 & gt; 89 y 287 & gt; 153 se utilizaron para detectar la luteolina ES, y m /z 271 & gt; 91 y 271 & gt; 153 se utilizaron para la genisteína con energías voltaje del cono y de la colisión optimizados para cada uno. datos de DO de 210 a 600 nm se recogieron con el detector de PDA y OD260 también fue utilizado como un punto final. Una curva de calibración lineal de 5 puntos de 1-800 ng /ml con 218 ng /ml es se utilizó para la cuantificación (R2 & gt; 0,99; sesgo & lt; 10%). La genisteína-glucurónido se presume que es la forma más común de conjugado, y los niveles se estimaron a partir de datos OD260 con la suposición de que el coeficiente de extinción es similar a la de la genisteína.
4. Histopatología e inmunohistoquímica
injertos tumorales recogidas se redujeron a la mitad en el punto del tumor más gruesa. Una mitad se fijó en formalina al 10% tamponada neutra para histológico /inmunohistoquímico (IHC) analiza. La otra mitad fue congelaron rápidamente para el análisis de proteínas. El tejido fijado se procesó a parafina y encaja con la superficie de corte de la línea media hacia abajo en el bloque de parafina, de manera que las secciones se iniciaron en la superficie de corte de la línea media inicial. Preparación de tejidos embebidos en parafina y análisis IHC se llevaron a cabo como se describe anteriormente [34]. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio son Ki67 (Dako, Carpinteria, CA), caspasa-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ER (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y ERβ (Biogenex Laboratories, San Ramón , CA). Todas las secciones de tejido fueron contra el teñidas con 5% (w /v) hematoxilina de Harris y coverslipped con Permount (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA).
5. La invasión local y metástasis análisis
Para examinar los nodos de incidencia, pulmonares, hepáticas, renales, pancreáticos, lumbar y torácica ganglios metastásicos fueron recogidos de cada ratón. Cada uno de estos órganos se fijaron y procesaron como anteriormente para el análisis IHC. Las secciones se tiñeron con un anticuerpo específico anti-mitocondria humana (Millipore, Billerica, MA) y se cribaron para la presencia de células metastásicas. Imágenes de las secciones teñidas con IHC de cada órgano se capturaron utilizando un CCD AxioCam montada en un microscopio Axioplan 2 y software Axiovision 3.1 (Carl Zeiss, Toronto, ON), con aumentos finales de × 400. Se calcularon los porcentajes de animales que contienen las células metastásicas humanos en cualquiera lumbar o ganglios linfáticos torácicos. (En los ganglios linfáticos renales y pancreáticas, todos los animales en tres grupos mostraron evidencia de células de cáncer humano, independientemente del tratamiento por lo tanto se omite en el cálculo.) Para pulmón y el hígado, el número de células teñidas positivamente se contó dentro de campos microscópicos seleccionados al azar por espécimen .
6. La proliferación celular y la apoptosis
análisis
índice de proliferación (PI) se evaluó por IHC usando un marcador de proliferación específica humana, Ki67. Las imágenes de secciones teñidas con IHC de cada injerto fueron capturados como anteriormente. La sección media del injerto con las células cancerosas humanas más densamente pobladas fue seleccionado para formación de imágenes para todos los tumores. El número de células Ki67 positivas y negativas-humanos se contaron dentro de todo el campo microscópico para cada injerto de todos los animales y se promediaron. Basado en el número de células promedio para cada grupo de tratamiento, PI se calculó como sigue:. PI (%) = (recuento de células Ki67 positivas /recuento de células humana total) × 100
Del mismo modo, índice apoptótico (AI) era -calculada a partir de la caspasa-3 escindidas secciones IHC manchadas de injertos tumorales. El número de células apoptóticas por cada 10.000 células humanas se contó para cada injerto de tumor y promedió. AI se calculó como anteriormente.
7. Análisis de transferencia Western
Las mitades restantes de los tejidos tumorales recogidas se snap-congelado para el análisis de proteínas, a partir del cual los tejidos del riñón de ratón se extirpan quirúrgicamente usando un microscopio de disección antes de la congelación. Estos tejidos congelados se homogeneizaron usando un mortero y mano de mortero en NP-40 tampón de lisis (cloruro sódico 150 mM, 1,0% de NP40, y 50 mM Tris-HCl pH 8,0) en hielo, se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 minutos a 4 grados Celsius en se recogió una microcentrífuga, y el sobrenadante. El ácido bicinconínico (BCA) ensayo (Thermo Scientific, Waltham, MA) se realizó de acuerdo a las instrucciones de la compañía para medir la concentración de proteína para cada muestra de tumor, y la absorbancia se midió a 562 nm. Para la electroforesis en gel, las muestras de proteína se hirvieron durante 5 minutos, y 20 g de proteína se separaron en SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) y gel electrotransferred a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con 5% de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o leche sin grasa 5% en solución salina tamponada con Tris (pH 7,4) que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST) y se incubaron con anticuerpos primarios a alfa actina, fosfo (p) tirosina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), total de EGFR, p-EGFR (tyr1068), p-Src (tyr416) y el total de Src (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA). Después de la incubación del anticuerpo primario, las membranas se lavaron con TBST y se sondaron con apropiado conjugado con HRP secundario anti-ratón (Pierce, Rockford, IL) o anti-conejo (Fisher /Thermo Scientific, Waltham, MA) anticuerpos. Para detectar proteínas de interés, se utilizó un kit de transferencia Western aumento de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL).
8. Análisis estadístico
Incidencia metastásico, la comparación de los niveles séricos, PI y AI fueron evaluados utilizando de Student no pareada de dos colas
t-test
. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si
valores de p
eran menores que 0,05.
Resultados
Los niveles séricos de genisteína
Para garantizar que los grupos tratados recibieron genisteína una dosis farmacológica del compuesto, la concentración sérica de la genisteína se midió utilizando líquidos de alto rendimiento espectrometría de masas chromatography- (HPLC-MS). Nuestro análisis HPLC-EM mostró que el grupo de control no tratado tenía una muy baja rastro de genisteína suero (0,002 g /ml), cuya fuente más probable es su Chow (PicoLab Rodent Diet 20, Delta, BC). En comparación, una dosis baja y los animales tratados con la dosis alta tuvieron 1,30 g /ml a 6,63 g /ml de genisteína libre, respectivamente. En nuestros ratones tratados, ingerido genisteína formado conjugados glucurónidos, y sólo una pequeña porción de la genisteína se mantuvo agliconas libres en la sangre. Los niveles de ambos genisteína libres y conjugados fueron significativamente mayores en baja (
p
& lt; 0,04) y los ratones tratados con alta dosis (
p
& lt; 0,0006) que en el grupo control (figura 1).
genisteína
Para el tratamiento, se les dio seis animales en el grupo de dosis baja disuelto en aceite de cacahuete por sonda a 2 mg /día (80 mg /kg de peso corporal /día). Seis ratones en el grupo de dosis alta se les dio 10 mg /día (400 mg /kg /día) de genisteína. Cinco ratones de control (uno murió antes del final del tratamiento) recibieron 0,1 ml de vehículo solamente. La sangre se recogió al final del tratamiento de 3 semanas.
Columnas
:. La concentración sérica de genisteína ± SD significa
El crecimiento del tumor del paciente derivado de xenoinjerto CaP después del tratamiento genisteína
Los efectos de la genisteína en la metástasis de avanzada humana CaP fueron examinados usando nuestra línea derivada del paciente CaP xenoinjertos de tumores trasplante, LTL163a, que fue desarrollado a partir de una muestra de prostatectomía etapa avanzada y ha seleccionado para la actividad metastásica. Los tumores de la 10
ª generación de trasplante de la línea de tumor LTL163a se cortaron en trozos de tamaño uniforme (1 x 3 x 3 mm) y se cultivan en cápsulas renales (una pieza tumor /riñón, dos injertos tumorales /ratón) de dieciocho NOD macho ratones SCID suplementado con un 10 mg de pellets de testosterona subcutánea. Siete días después del injerto, los animales huésped se colocaron al azar en tres grupos de tratamiento; sin tratar y controles, de baja dosis y la genisteína en dosis altas. La administración oral de genisteína o aceite (para el grupo de control) se continuó durante tres semanas. En el momento de la cosecha, agrandamiento de los riñones con tumores bien desarrollados se observaron en los tres grupos. El volumen medio de los tumores para los grupos de control, dosis bajas y altas dosis de son; 650 mm
3, 655 mm
3 y 670 mm
3, respectivamente. A pesar de la tendencia creciente volumen tumoral para el tratamiento de la genisteína, no hubo significación estadística entre los grupos. Además del crecimiento del tumor expansivo hacia arriba desde la superficie del riñón, tumores de los tres grupos invadieron localmente en el riñón (datos no mostrados).
Genistein promueve los ganglios linfáticos y el órgano secundaria metástasis
En para evaluar la propagación a distancia de las células tumorales, se recogieron de páncreas, torácica, lumbar y de los ganglios linfáticos renales, así como los órganos internos. Todos los grupos mostraron evidencia de células humanas de cáncer en los ganglios linfáticos renales y pancreáticas independientemente del tratamiento (datos no ilustrados). Sin embargo, en la zona lumbar y linfáticos torácicos, grupo de control no tenía ninguna o baja incidencia de metástasis (0% en la zona lumbar y torácica en un 17%). En contraste, ambos tratamientos de baja y alta dosis de genisteína mostraron mayor incidencia metastásico en estos dos nodos en comparación con el grupo control no tratado (figura 2a); (17% para una dosis baja y el 50% para la alta dosis en el nodo lumbar. 50% de una dosis baja y el 83% para la alta dosis en el nodo torácica). Del mismo modo, el número de células cancerosas metastásicas en órganos secundarios, tales como el pulmón y el hígado fueron significativamente mayores en los grupos de genisteína tratados de control (Figura 2b). Aunque se observaron células cancerosas dispersas en órganos secundarios de todos los ratones (Figura 2c), los ratones tratados sólo genisteína-mostraron agregación de las células cancerosas (& gt; 75) los agregados de células en esos órganos para formar islas /micrometástasis como se muestra en la Figura 2d. Por lo tanto, por varios criterios, la genisteína tenía una metástasis dependiente de la dosis efecto promotor en LN y órganos secundarios en nuestro modelo.
En el momento de la cosecha, pulmón, hígado y ganglios linfáticos cuatro incluyendo renal, pancreático, lumbar y linfáticos torácicos fueron recogidos de todos los animales. Cada uno de estos órganos ha sido fijado, procesan, se tiñeron con un anticuerpo específico anti-mitocondria humana y proyectado para detectar la presencia de células metastásicas humanas. Las imágenes de secciones teñidas con IHC de cada órgano fueron capturados utilizando un CCD AxioCam montada en un microscopio Axioplan 2 con aumentos finales de 400 ×. a) Se calcularon los porcentajes de animales que contienen las células metastásicas humanos en cualquiera lumbar o ganglios linfáticos torácicos. En los ganglios linfáticos renales y pancreáticas, todos los animales de los tres grupos mostraron evidencia de células de cáncer humano, independientemente del tratamiento (datos no mostrados) así omitió en el cálculo. Sin embargo, los grupos de genisteína tratados mostraron una mayor incidencia de metástasis en lumbar y linfáticos torácicos en comparación con el grupo de control sin tratar. La diseminación metastásica en los ganglios lumbares y torácicas nodos se presentan como porcentaje de la media en ratones portadores de injertos tumorales LTL163A a partir de tres grupos (control no tratado, en dosis bajas y genisteína en dosis altas).
Negro columna: la incidencia de metástasis de los ganglios linfáticos torácicos. Columna de color blanco: la incidencia de metástasis de ganglios linfáticos lumbares
. b) Para los pulmones y el hígado, el número de células teñidas positivamente se contó dentro de campos microscópicos seleccionados al azar.
Columna
: número de la invasión de las células cancerosas por campo microscópico observado en el pulmón y el hígado de los tres grupos ± SD significa. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante la prueba t en el intervalo de confianza del 95%. c) Ki67-IHC tinción de secciones representativas de órganos secundarios (hígado y pulmón) de control sin tratar y ratones tratados con genisteína. anticuerpo Ki67 utilizado en este estudio es específico humano. Todos los aumentos son × 400. d) Ki67-IHC tinción de hígado de un genisteína tratados con animales que presenten agregación de la invasión de las células cancerosas. círculo rojo indica un enfoque pequeña isla /micrometástasis que contiene & gt; 75 células cancerosas humanas, que sólo se observó en los ratones tratados con genisteína. La ampliación es × 400.
La genisteína afecta a la proliferación celular y la apoptosis
Debido a que nuestros datos mostraron que la genisteína propagación de las células cancerosas humanas promueve en los anfitriones del ratón, se investigó sus efectos sobre las células tumorales proliferación y apoptosis. La inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo Ki67 humano específico se realizó para medir la tasa de proliferación de células tumorales. El resultado mostró una fuerte intensidad positiva dentro de injertos tumorales de todos los grupos, así como en la región invadido localmente del riñón del ratón (datos no mostrados). el índice de proliferación (PI) se midió a partir de la sección media de la zona del injerto tumoral. La comparación entre los grupos reveló que ambos grupos de baja y alta dosis tenían PIs más altos (77.3% y 86.1%, respectivamente) que el control sin tratar (70,0%), pero sólo en el grupo de dosis alta fue significativamente diferente del grupo control no tratado (
p = 0,004
) como se muestra en la Figura 3.
índice de proliferación (PI) se evaluó por IHC usando un marcador de proliferación específica humana, Ki67. El número de células Ki67 positivas y negativas-humanos se contaron dentro del campo microscópico seleccionado al azar para cada injerto de tumor de todos los animales y se promediaron. Índice de proliferación (%):. (Ki67 recuento de células positivas /número total de células humanas) × 100
También investigamos si las tasas de genisteína afectados de la muerte celular programada, la apoptosis. El análisis inmunohistoquímico con un anticuerpo anti-caspasa 3 reveló que los tumores en ratones genisteína tratados tuvieron menos caspasa-3 células positivas que aquellos en el grupo control (Figura 4). El grupo de control tenía el más alto índice apoptótico (AI) de 0,18%, mientras que los dos grupos de dosis baja y alta tenían una IA de sólo el 0,07% (
p = 0,05
: Figura 4a), lo que indica una reducción significativa tasa de muerte celular en los tumores tratados con genisteína.
apoptótica Index (AI) se calculó a partir de la caspasa-3 secciones teñidas IHC de injertos tumorales de todos los ratones. El número de células apoptóticas por cada 10.000 células humanas se contó para cada injerto de tumor y promedió. a) índice apoptótico (%) = (caspasa-3 recuento de células positivas /número total de células humanas) × 100. b) La caspasa-3 tinción inmunohistoquímico de los injertos tumorales de animales tratados y no tratados. Las flechas rojas indican las células positivas /apoptóticas. Todos los aumentos son × 400. El recuadro es una imagen aumentada de células positivas.
La genisteína aumenta la fosforilación de la proteína tirosina quinasas
Anterior
in vitro modula
estudios han demostrado que la genisteína señalización de vías por las tirosina que alteran las actividades quinasa [25], [26], [27]. Para determinar si una mayor metástasis observada en los ratones tratados con genisteína estaba vinculada a patrones de fosforilación alterados, análisis de transferencia Western se realizó en lisados de proteínas derivadas de tumores utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina. La inmunotransferencia mostró que los tumores tratados con genisteína tuvieron mayor nivel de fosforilación en una banda de 60 KDa de proteína en relación con el grupo de control sin tratar. Curiosamente, en exposiciones más largas de la película de rayos x, se observaron patrones de bandas más intensas para las proteínas de mayor peso molecular en el grupo tratado con la genisteína en comparación con el control (Figura S1). De particular interés fue una banda a 170 kDa. Una exposición más larga reveló bandas en el grupo tratado con genisteína, mientras que no se observó la fosforilación en el grupo control en esta proteína de tamaño particular.
Para investigar más a fondo, se realizó la inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos tirosina quinasas específicas. Los posibles candidatos para el 60 KDa y 170 kDa (flechas en la Figura 5 y la Figura S1) son Src y su potencial molécula de aguas arriba, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Como se muestra en la figura 6a, la genisteína incrementó la expresión total de proteína EGFR ligeramente en comparación con el control. Aunque casi todos los tumores de control no tratados (excepto para uno) mostraron muy poca o ninguna fosforilación de esta proteína, la mayoría de los tumores tratados con genisteína mostraron banda alta intensidad (Figura 6a). Del mismo modo, Src, un objetivo de EGFR, mostró una ligera regulación al alza de la expresión total de proteína en comparación con el grupo control. Una vez más, no se observó la fosforilación de Src en el grupo de control (excepto un tumor en una exposición más larga), mientras que se observó un nivel significativamente mayor de la fosforilación en las muestras tumorales de genisteína tratados (Figura 6b). Estos patrones de bandas de inmunotransferencia de EGFR específica y Src (Figura 6) confirman los patrones de tinción p-tirosina generales observadas anteriormente (Figura 5).
Después de un tratamiento de tres semanas de genisteína, se cosecharon los tumores, y la proteína fue extraída de seis genisteína tratados y cinco ratones de control sin tratar (uno de los ratones de control murieron durante el tratamiento). El análisis de transferencia Western se realizó en lisados de proteínas derivadas de tumores de fosfotirosina como se describe en Materiales y Métodos. La misma transferencia se tiñó con un anticuerpo anti-actina alfa para evaluar la carga de proteínas. Los carriles representan proteínas de tumores individuales.
a) La genisteína aumenta la fosforilación de la tirosina de EGFR en 1068 residuos. A continuación se muestra la cuantificación de la intensidad de la banda de EGFR fosforilado a partir de lisados de proteínas de 5 control no tratado y 6 tumores genisteína tratados.
Columnas
: media razón de EGFR fosforilado intensidad de la banda /proteína total EGFR ± SD. b) La genisteína afecta a la fosforilación de Src a la tirosina 416 de residuos. expresión Src activado es significativamente mayor en los tumores tratados con genisteína que la de control sin tratar. Los carriles representan proteínas de tumores individuales.
Discusión
El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muertes relacionadas con cáncer en América del Norte. Desde la introducción de la terapia de ablación de andrógenos por Huggins y Hodges en la década de 1940, la manipulación hormonal se ha utilizado como el principal tratamiento para el CaP avanzado [36]. A pesar de la regresión del tumor inicial después de la terapia hormonal, algunas células de CaP restantes pueden sobrevivir a esta terapia, adquirir la independencia de andrógenos y convertirse en refractario a hormonas [37]. Una vez que la enfermedad progresa al estado refractario a hormonas, no existe un tratamiento eficaz disponible actualmente [38]. Por lo tanto, una considerable cantidad de esfuerzo se ha invertido en las estrategias para el tratamiento de CaP avanzado. Anterior
in vitro
estudios han sugerido que la genisteína tiene un potencial quimioterapéutico en líneas celulares de cáncer hormono-dependientes. Sin embargo, la genisteína de
in vivo
acciones han sido recientemente cuestionado por los informes contradictorios [28], [29], [30], [39], [40], [41], [42]. Por ejemplo, un estudio informó que la genisteína inhibe el crecimiento del tumor óseo PC3 en ratones SCID [43], y otro mostró que la genisteína disminuyó las metástasis de pulmón en ratones implantados receptor de andrógenos-negativo PC3-M, que fueron alimentados con genisteína enriquecida Chow [30]. Por el contrario, Raffoul
et al. Hola, ha encontrado que la genisteína ingestión de plomo a un aumento de metástasis en los ganglios linfáticos en su PC3 implantado modelo animal [29]. En 2009, Touny y Banerjee demostraron efectos bifásicos de genisteína utilizando el ratón TRAMP (adenocarcinoma de próstata transgénico ratón) modelo. La genisteína inhibe pobremente diferenciado CaP en estos ratones cuando se incorporan en su dieta antes de la iniciación del tumor (es decir, cuando los ratones fueron alimentados con las dietas de genisteína-4~12 semanas de edad). Sin embargo, si se le dio la genisteína-dieta para los ratones TRAMP de más edad en las edades de 12~20 semanas, cuando neoplasia intraepitelial prostática (PIN) ya presente, que promueve la progresión del CaP e inducido la metástasis de los ganglios linfáticos [28]. De estos datos, se puede entender que de por vida el consumo moderado de (o la exposición temprana a) genisteína es importante en la prevención de la enfermedad, pero que la genisteína no puede exhibir efectos quimioterapéuticos
in vivo
una vez CaP ya tiene ha establecido o ha progresado a una etapa avanzada.
para resolver la controversia de los efectos de la genisteína
in vivo
, hemos desarrollado un modelo de xenoinjerto clínicamente relevante que se ha generado a partir de un espécimen de prostatectomía paciente. La línea de tumor de próstata derivado del paciente resultante utilizado en nuestro estudio, LTL163a, se ha cultivado por sólo 10 generaciones en ratones inmunodeficientes y ha mantenido las características histopatológicas y genotípicas originales de la muestra clínica original [33], [34]. Nuestros datos muestran que ambos tratamientos genisteína bajas y altas dosis promover la metástasis en esta línea trasplante de PCa humana avanzada. Aunque el tamaño del tumor no fue significativamente diferente entre los grupos tratados con genisteína control y después de 3 semanas de tratamiento, la incidencia de metástasis fue mayor en genisteína tratados vs controles no tratados. La progresión metastásica observado en nuestro modelo se caracterizó por el aumento de la proliferación celular y disminución de la apoptosis.