Extracto
Objetivo
La genisteína es una isoflavona de soja que tiene actividad antitumoral in vitro e in vivo. Se ha demostrado que la genisteína inhibe muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata (CaP) mediante la regulación de varias vías de señalización celulares y microRNAs (miRNAs). Estudios recientes sugieren que los largos ARN no codificante (lncRNAs) también participan en muchos procesos celulares. En la actualidad no existen informes sobre la relación entre gensitein, miRNAs y lncRNAs. En este estudio, nos centramos en los miRNAs, lncRNA que están regulados por la genisteína y se investigó su papel funcional en el CaP.
Método
microarrays (GE SurePrint G3 humano 8 × 60K) se utilizó para la expresión perfiles de genisteína tratado y el control de células de CaP (PC3 y DU145). ensayo funcional (proliferación celular, la migración, la invasión, la apoptosis y el ciclo celular ensayos) se realizaron con el CaP líneas celulares, PC3 y DU145. Tanto in vitro y en modelos in vivo (ratón desnudo) se utilizaron para los ensayos de crecimiento. los ensayos de reportero de luciferasa se utilizan para la unión de miR-34a a HOTAIR.
Resultados
lncRNA perfiles mostró que HOTAIR estaba altamente regulado por la genisteína y su expresión fue mayor en las líneas celulares de CaP resistentes a la castración que en las células normales de la próstata. Knockdown (siRNA) de HOTAIR disminución de la proliferación celular del CP, la migración y la invasión y la apoptosis inducida y la detención del ciclo celular. miR-34a también fue hasta reguladas por la genisteína y puede dirigirse directamente a HOTAIR tanto en las células PC3 y DU145 CaP.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que la genisteína inhibe el crecimiento celular a través de CaP baja regulación de HOTAIR oncogénico que también es el blanco de supresor de tumores miR-34a. Estos hallazgos aumentan la comprensión de cómo se regula la genisteína lncRNA HOTAIR y miR-34a en el CaP
Visto:. Chiyomaru T, S Yamamura, Fukuhara S, Yoshino H, Kinoshita T, Majid S, et al. (2013) genisteína inhibe el cáncer de próstata el crecimiento celular por la orientación de miR-34a y Oncogénicos HOTAIR. PLoS ONE 8 (8): e70372. doi: 10.1371 /journal.pone.0070372
Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2013; Aceptado: 17 Junio 2013; Publicado: 1 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Chiyomaru et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la investigación de los Institutos nacionales de Salud a través de la subvención Número R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 y VA Mérito de la opinión y el Proyecto de Programa VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la genisteína es una isoflavona de soja en la dieta. Su estructura es similar a la de humano 17-β-estradiol causando estrogénica y /o efectos antiestrogénicos [1]. La genisteína es también un inhibidor de la proteína tirosina quinasa [2] y tiene efectos antitumorales in vitro e in vivo. Se ha demostrado que la genisteína inhibe muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata (CaP) [3], [4] a través de la regulación de varias vías de señalización celular, tales como el Wnt, Akt y las vías de JAK /STAT [5] - [8].
La evidencia reciente sugiere que los ARN no codificante (ncRNAs) están implicados en muchos procesos celulares. microARN (miARN), clase de pequeños ncRNAs aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, de función como reguladores negativos de ARNm diana transcriptionally y post-transcriptionally [9]. Se sabe que miRNAs regulan hasta dos tercios del genoma humano [10] y juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, proliferación, angiogénesis, el metabolismo y la pluripotencia [11], [12]. Se ha informado de que la genisteína incrementó la expresión de supresor de tumores miR-146a, causando la inhibición del EGFR y NF-kB vía [13], [14]. miR-27a se ha informado de que un miARN oncogénicos reguladas por la genisteína y regula la señalización de VEGF por la orientación ZBTB10 [15], [16]. Nuestros estudios anteriores mostraron que el tratamiento con genisteína significativamente reducido regulado la expresión de miR-151 oncogénico que se dirige directamente SOX17 y ARHGDIA [17]. SOX17 se informó a ser un gen supresor de tumor que inhibe la señalización /β-catenina vía por la orientación tanto de β-catenina y el factor de células T (TCF) /factor de potenciador (LEF), las proteínas linfoides [18] - [20]. ARHGDIA regula negativamente la familia Rho GTPasas (Rho, Rac y Cdc42) [21] que están involucrados en la vía de señalización de Wnt [22]. También se encontró que la genisteína regula a la baja la RAC1 y EP300 genes que son importantes reguladores de la angiogénesis mediada por VEGF [23], [24] y el gen EGFR por hasta la regulación de miR-574-3p [25].
ncRNAs se dividen en dos clases principales basándose en el tamaño transcripción; pequeña ncRNAs y largo ncRNAs (lncRNAs). lncRNAs son en general definen como los genes del ARN más grande de 200 nucleótidos que no tienen potencial de codificación de proteínas. secuenciación a gran escala de las bibliotecas de cDNA y secuenciación de próxima generación indican que lncRNAs en los mamíferos se cuentan por decenas de miles. Hasta el momento, sólo 126 lncRNAs humanos se han anotado funcionalmente en lncRNA base de datos [26]. Por lo tanto no hay informes acerca de la relación entre gensitein y lncRNAs.
El HOX ARN antisentido transcripción (HOTAIR) gen se encuentra dentro del grupo de genes homeobox C (HoxC) en el cromosoma 12 y codifica s de 2,2 kb lncRNA molécula. Este gen se transportó del cromosoma 12 en el cromosoma 2 de un componente de la Polycomb represiva Complex 2 (PRC2) y reprime la transcripción de genes homeobox D (Hoxd) [27]. HOTAIR interactúa tanto con PRC2 y desmetilasa lisina específica 1 complejos y parejas (LSD1) histona H3 lisina 27 de metilación y desmetilación lisina 4 para el silenciamiento epigenético de genes no sólo HOXD, sino también a muchos otros genes [28]. Este gen está altamente expresado en varios tipos de cáncer como el de mama, colorrectal, el hígado, el páncreas y cáncer de laringe [29] - [33]. La expresión alta de HOTAIR en cáncer de mama es un predictor de metástasis y mal pronóstico [29]. HOTAIR También se piensa que es un biomarcador potencial para la existencia de metástasis en los ganglios linfáticos en el carcinoma hepatocelular [34]. HOTAIR es un factor pronóstico negativo y actúa como un oncogén en el cáncer pancreático tanto in vitro como in vivo [32]. Por lo tanto, en este estudio, nos centramos en la lncRNA HOTAIR que está regulado por la genisteína y se investigó su papel funcional en el CaP.
Resultados
Efecto del tratamiento con genisteína sobre la proliferación, la apoptosis y el ciclo celular en el CaP las células
Para verificar las funciones supresoras de tumores de genisteína, se realizó un análisis de función. El ensayo MTS mostró que la proliferación de las células se redujo por el tratamiento genisteína tanto en las células PC3 y DU145 (Fig. 1A). ensayo de apoptosis demostró que la genisteína induce significativamente la apoptosis de las células DU145 (Fig. 1B). Sin embargo, no se observó efecto significativo de la apoptosis en células PC3. ensayo de ciclo celular demostró que el tratamiento con genisteína causó G2 detención del ciclo celular /M fase en ambos PC3 y DU145 células (Fig. 1C).
(A) La genisteína inhibe significativamente la viabilidad celular. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de proliferación celular MTS después de 4 días de tratamiento (25 M). **, P & lt; 0,0001. *, P & lt; 0,01. Los datos se presentan como la media ± SE. ensayo (B) La apoptosis mediante citometría de flujo. figuras cuadrante representativos de control y genisteína (25 mM) en las células tratadas PC3 (izquierda) y DU145 células (derecha). P & lt; 0,05. (C) Las cifras típicas de análisis del ciclo celular de control, o la genisteína (25 mM) se muestran las células tratadas. El gráfico de barras muestra a la derecha de cada uno de las figuras representa el porcentaje de las células en G0 G1, S, G2 o fase //M como se indica. * P & lt; 0,05
Identificación de genes diana y los patrones moleculares regulados por la genisteína en el CaP
Para identificar los genes y las vías blanco de la genisteína en células de CaP, se realizó un perfil de expresión génica utilizando. genisteína y células PC3 y DU145 tratado con vehículo (control). La expresión de 918 genes fueron significativamente las reguladas en ambas líneas celulares de CaP (relación y lt; log2 media -0.5, Tabla S1). Estos genes fueron asignados de Kyoto Enciclopedia de genes y anotaciones Genomas (KEGG) usando análisis de enriquecimiento singular del GENECODIS. vías significativamente enriquecidos en KEGG se identificaron como 'Caminos en el cáncer "," ciclo celular "," Regulación de la citoesqueleto de actina' y 'vía de señalización Jak-STAT' (P & lt; 0,05, Tabla S2). Nos centramos en la KEGG 'Camino en el cáncer' y los genes en esta vía han sido resaltados en el mapa KEGG (Fig. S1).
Para determinar la expresión de genes en muestras clínicas con CaP, hemos realizado análisis de expresión para todos los candidatos orientar los genes implicados en las 'Rutas en el cáncer' a partir de datos de microarrays de expresión, que fueron aprobadas por la expresión génica Omnibus (GEO). Los niveles de expresión de estos genes se examinaron en 47 CaP y 47 muestras normales, como se muestra en el diagrama de mapa de calor en la Fig. S2. Los genes regulados en el CaP se muestran en rojo, los genes regulados hacia abajo aparecen en azul, mientras que las barras blancas indican genes que se expresan en niveles similares en ambos. A partir de este análisis, se identificaron varios objetivos de genes cruciales, incluyendo la histona deacetilasa 1 (HDAC1), inhibidor de la proteína de STAT activado, 3 (PIAS3), tropomiosina 3 (TPM3), factor de transcripción 7-como 2 (de células T específica, HMG caja) (TCF7L2), receptor de aril-hidrocarburo translocador nuclear 2 (ARNT2), de unión a CREB proteína (CREBBP), unión plakoglobina (JUP), y v-akt timoma murino viral homólogo de oncogén 2 (AKT2).
identificación de lncRNAs regulados por genisteína en el CaP
El SurePrint G3 GE humano 8 × 60K plataforma de microarrays también incluye sondas para lincRNAs. Para identificar los lncRNAs reguladas por la genisteína en células de CaP, se realizó un perfil de expresión génica. Cinco lncRNAs se redujeron regulado en ambas líneas celulares de CaP (relación y lt log2 media; -1,0; Tabla 1) con lncRNA HOTAIR que muestra el efecto más grande. Para determinar los niveles de expresión de HOTAIR en células de la próstata, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR usando líneas celulares de CaP no tratados y los comparó con las células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1). Hemos observado que la expresión HOTAIR fue significativamente hasta reguladas en líneas celulares de CaP resistentes a la castración (PC3 y DU145) en comparación con RWPE-1 en las células PC3 (3,35 veces, DU145 6,47 veces) (Fig. 2A). Para confirmar los datos de microarrays, se realizó un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan y observó que la expresión HOTAIR fue significativamente las reguladas con el tratamiento con genisteína (Fig. 2B). Por lo tanto, nos centramos en HOTAIR debido a que muchos investigadores han informado de que HOTAIR tiene una función oncogénica en otros tipos de cáncer (mama, hígado, páncreas, el cáncer colorrectal y el carcinoma de células escamosas de laringe) [29] - [33].
( a) Expresión de HOTAIR en líneas celulares (CaP LNCaP, PC3 y DU145) y células epiteliales de próstata normales (RWPE-1). PCR en tiempo real mostró que los niveles de expresión de HOTAIR fueron reguladas en líneas celulares de CaP resistentes a la castración (PC3 y DU145). Los datos se presentan como media ± SE. *, P & lt; 0,05. niveles (B) Expresión de HOTAIR después del tratamiento con genisteína (25 m). expresión HOTAIR disminuyó en un 30 a 40% en las células tratadas genisteína en comparación con los controles. HOTAIR expresión se normalizó a GAPDH. *, P & lt; 0,05. (C) Expresión de miR-34a en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145) y células epiteliales de próstata normales (RWPE-1). PCR en tiempo real mostró que los niveles de expresión de miR-34a se redujeron regulado en líneas celulares de CaP resistentes a la castración (PC3 y DU145). la expresión de miR-34a se normalizó a RNU48. (D) Los niveles de expresión de miR-34a después del tratamiento con genisteína (25 mM) en células DU145. P & lt;. 0,05
Reglamento de HOTAIR Expresión en líneas celulares de CaP por miR-34a
Recientemente, se informó de que algunos miRNAs regulan la expresión de lncRNAs [35] - [37]. Para buscar posibles miRNAs que regulan HOTAIR, se utilizó el algoritmo miRcode. En varios miRNAs candidatos dirigidos HOTAIR, nos centramos en el miR-34a ya que nuestro laboratorio ha estado funciona como un supresor de tumores se informó anteriormente y es el regulado en los tejidos de CaP [38]. Para determinar los niveles relativos de expresión de miR-34a en células de la próstata, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR usando líneas celulares de CaP (PC3 y DU145) y los comparó con las células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1). Hemos observado que la expresión de miR-34a fue significativamente las reguladas en líneas celulares de CaP resistentes a la castración (PC3 y DU145) en comparación con RWPE-1 en las células PC3 (0,22 veces, DU145 0,14 veces) (Fig. 2C). Para buscar el efecto de la genisteína a la expresión de miR-34a, se realizó un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan y observó que la expresión de miR-34a fue significativamente hasta reguladas con el tratamiento genisteína en las células DU145 (1,36 veces) (Fig. 2D) .
con el fin de confirmar la unión de miR-34a de aire caliente, se realizaron ensayos de reportero de luciferasa. HOTAIR tiene uno predijo sitio de unión para miR-34a (Fig. 3A), que hemos clonado en un vector de ensayo de indicador de luciferasa. ensayos de reportero de luciferasa demostraron que miR-34a disminuyó las actividades de luciferasa relativas del vector de tipo salvaje (Fig. 3B). La mutación de los sitios de unión de miR-34a putativos también disminuyó la respuesta a miR-34a que indica que el miR-34a se une directamente a HOTAIR. Análisis en tiempo real PCR cuantitativa mostró que los niveles de expresión de HOTAIR en PC3 y DU145 fueron reprimidos en los transfectantes de miR-34a en comparación con los controles (Fig. 3C).
(A) putativos de unión de miR-34a y sitios mutados en HOTAIR. ensayos (B) indicador de luciferasa usando vectores que codifican supuestos sitios de unión. células PC3 y DU145 fueron transfectadas transitoriamente con precursor Pre-MIR miARN o un control negativo, seguido de la transfección transitoria con el vector de base o de plásmidos informadores de tipo salvaje o plásmidos mutados durante 24 horas. reportero de la actividad se midió por ensayo de luciferasa y se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla. Los datos se presentan como la media ± SE. *, P & lt; 0,05. (C) El nivel de expresión de HOTAIR se determinó por cuantitativa en tiempo real los análisis de PCR después de la transfección con imita el miR-34a y control negativo en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145). HOTAIR expresión se normalizó a GAPDH. *, P & lt;. 0,05
in vitro e in vivo Efecto de HOTAIR en CaP proliferación celular, la migración, y la invasión
Para examinar el papel funcional de aire caliente, se realizó deficitarias -función de los estudios que utilizan si-ARN caída con células PC3 y DU145. Inicialmente confinados que la expresión de HOTAIR fue reprimida notablemente en transfectantes si-ARN en comparación con los controles (Fig. 4A). La proliferación celular (Fig. 4B) y el ensayo de curación de la herida (Fig. 4C) mostraron inhibición significativa en transfectantes si-aire caliente tanto en las células PC3 y DU145 en comparación con los transfectantes de control. ensayo de invasión (Matrigel) también mostró que el número de células invasoras disminuyó significativamente en transfectantes SI-HOTAIR en comparación con sus homólogos de control (Fig. 4D). Para confirmar el efecto de HOTAIR en la tumorigenicidad in vivo, de aire caliente siRNA y las células DU145 transfectadas-si-control se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Hemos observado que knock-down de expresión HOTAIR inhibe la formación de tumores de células DU145 in vivo (Fig. 4E). Estos resultados sugieren que HOTAIR juega un papel importante en la progresión de células CaP
.
(A) los niveles de aire caliente de expresión en líneas de células de CaP (PC3 y DU145) se determinaron por PCR en tiempo real a las 96 horas después de la transfección transitoria de siARN . La expresión génica se normalizó a GAPDH. Los datos se presentan como la media ± SE. **, P & lt; 0,0001. *, P & lt; 0,0005. (B) Derribo de HOTAIR inhibe significativamente la viabilidad celular. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de proliferación celular MTS 96 horas después de la transfección transitoria. (C) Derribo de HOTAIR inhibe significativamente la migración celular. Después de la transfección (48 horas), una herida se formó por raspado y se midió después de 24 horas. Imágenes representativas de ensayo de la cicatrización de heridas se muestran en 200 × magnificación. **, P & lt; 0,0001. (D) Derribo de HOTAIR disminuyó significativamente la invasión celular. Imágenes representativas de ensayo de invasión se muestran en 200 × magnificación. **, P & lt; 0,0001. (E) Imágenes representativas de tumores en ratones desnudos 5 semanas después de la inyección subcutánea de líneas transfectadas siRNA HOTAIR DU145 células o líneas celulares de control y evolución en el tiempo del crecimiento del tumor.
HOTAIR influye celular Apoptosis y Ciclo Celular en Las células de CaP
ensayo
La apoptosis demostró que knock-down de HOTAIR apoptosis inducida significativamente tanto en las células PC3 y DU145 (Fig. 5A). ensayo del ciclo celular demostró que knock-down de HOTAIR causada G2 /M fase de la detención del ciclo celular en células PC3 (Fig. 5B), mientras que las células DU145 transfectadas tuvo un aumento significativo en la fase S del ciclo celular.
( A) ensayo de apoptosis mediante citometría de flujo. figuras cuadrante representativos de control y si-HOTAIR trataron células PC3 en (superior) y DU145 células (inferiores). **, P & lt; 0,005. *, P & lt; 0,05. (B) se dan cifras típicas de análisis del ciclo celular de control, o si-células tratadas HOTAIR. El gráfico de barras muestra a la derecha de cada figura representa el porcentaje de las células en G0 G1, S, G2 o fase //M como se indica. **, P & lt; 0,001. *, P & lt;. 0.005
Discusión
genes codificadores de proteínas comprenden sólo una pequeña parte del genoma, y el resto se compone de ncRNAs, intrones y /u otras secuencias a las que ninguna función todavía no se ha asignado [39]. NcRNAs (miRNAs y lncRNAs) han sido demostrado que desempeñan un papel crítico en la regulación de procesos celulares, tales como el crecimiento celular y la apoptosis en células normales y malignas. Las funciones de miRNAs en los cánceres han sido ampliamente investigados y, recientemente, muchas lncRNAs se han asociado con el desarrollo y progresión del cáncer. La expresión de lncRNAs cambia con frecuencia durante la transformación maligna y ncRNAs se perfilan como moléculas clave en el cáncer humano, con el potencial de servir como nuevos marcadores y dianas terapéuticas. Sin embargo, hasta la fecha el papel de sólo unos pocos lncRNAs se han caracterizado en el CaP. la secuenciación de alto rendimiento mostró que el cáncer de próstata asociada ncRNA transcripción 1 (PCAT-1) es un regulador específico de la próstata de la proliferación celular en el CaP y un objetivo de PRC2 [40]. Próstata gen del cáncer de la expresión del marcador 1 (PCGEM1) polimorfismos pueden contribuir al riesgo de CaP [41]. Expresión de PlncRNA-1 es significativamente mayor en el CaP y esto lncRNA regula la proliferación celular y la apoptosis a través de la orientación del receptor de andrógenos [42]. En este estudio, nos centramos en lncRNAs reguladas por la genisteína en células de CaP y se identificaron HOTAIR en el perfil de expresión de estos lincRNAs.
En este estudio, encontramos una alta expresión de HOTAIR en líneas celulares de CaP resistentes a la castración. Nuestros ensayos funcionales demostraron que desmontables de HOTAIR disminución de la proliferación celular PCa in vitro e in vivo y la apoptosis inducida. Por lo tanto HOTAIR puede jugar un papel funcional en crecimiento de células tumorales en el CaP. La evidencia creciente sugiere que HOTAIR regula las vías clave en la invasión del cáncer y la metástasis. HOTAIR aumenta la invasividad del cáncer de mama y metástasis mediante la inducción de reguladores positivos de la metástasis del cáncer (ABL2 caracol, LAMB3 y Lamc2-) de una manera dependiente de PRC2 [29]. La expresión de alto HOTAIR es un riesgo de recurrencia después de la hepatectomía en el carcinoma hepatocelular y puede regular los genes MMP9 y VEGF [34]. Nuestros ensayos funcionales mostraron que desmontables de HOTAIR disminuyó la migración celular y la invasión CaP. Nuestra gama de datos y el análisis bioinformático ARNm también mostraron que la genisteína se dirige a MMP9 y VEGF genes que son componentes de la KEGG 'Camino en el cáncer'. Estos resultados indican que HOTAIR puede desempeñar un papel importante en la progresión del CaP.
Como reguladores de genes, miRNAs se unen a la 3'UTR de ARNm y pueden dirigirse individualmente un número de genes codificadores de proteínas. Sin embargo, queda por determinar si los miRNAs pueden también dirigirse contra lncRNAs. Recientemente, algunos estudios han descrito las interacciones entre los miRNAs y lncRNAs. miR-29 regula indirectamente la expresión de supresor de tumores lncRNA, expresado maternalmente 3 (MEG3) actuando sobre su metilación en cáncer hepatocelular [35]. miR-671 dirige la escisión de un transcrito antisentido de la cerebelosa degeneración relacionada con la proteína 1, 34 kDa (CDR1), lo que lleva a una disminución concomitante en la CDR1 [37]. En el presente estudio, analizamos para ver si los impactos de miR-34a lncRNA expresión. Nuestro ensayo indicador de luciferasa y en tiempo real PCR resultados mostraron que el miR-34a se une a la secuencia de ARNm HOTAIR y abajo-regula la expresión HOTAIR en líneas celulares de CaP. Por lo tanto, este estudio es el primero en demostrar que el miR-34a se dirige directamente a HOTAIR tanto en células DU145 PC3 y CaP.
En conclusión, nuestros resultados mostraron que la genisteína inhibe el crecimiento celular a través de CaP baja regulación de HOTAIR oncogénico que es blanco de supresor de tumores miR-34a. Estos resultados mejoran nuestra comprensión de cómo interactúa con genisteína lncRNA en el CaP e indica posibles objetivos adicionales para el tratamiento del CaP.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
líneas celulares de PCa humana, LNCaP, PC3 y DU145 y una línea celular epitelial de próstata no maligno, RWPE-1, fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las líneas de células de CaP se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37 ° C. RWPE-1 línea celular fue cultivada en medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con 5 ng /factor de crecimiento epidérmico recombinante humano ml y 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células subconfluentes (60% -70% de confluencia) fueron tratadas con genisteína (25 mmol /L; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y células tratadas con vehículo (dimetilsulfóxido) sirvió como control. medios celulares y genisteína se cambiaron todos los días y las células se cultivaron durante 4 días.
La extracción de RNA
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares de CaP y una línea celular epitelial de próstata no maligno utilizando un miRNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
microarray
para microarrays, ARN total fue extraído a partir de células PC3 y DU145 tratadas con genisteína utilizando un miRNeasy Mini kit . SurePrint G3 humano GE 8 × 60K microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) se utilizó para el perfil de expresión de células de genisteína tratados y de control. Los microarrays de datos actuales fueron aprobados por el GEO y se les asignó el número de acceso GEO GSE47657.
Cuantitativo PCR en tiempo real
ARN total extraído se sometió a transcripción inversa en ADNc de cadena sencilla usando una síntesis de cDNA iScript kit (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y un microARN transcripción reversa kit TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó con un Applied Biosystems Prism7500 secuencia rápida sistema de detección usando TaqMan PCR Universal mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando el sistema 7500 Fast SDS software versión 1.3.1 (Applied Biosystems). parámetros de PCR para los ciclos eran las siguientes: 95 ° C durante 20 segundos, 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 3 segundos, y 60 ° C durante 30 segundos. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de reacción de 10 l por triplicado. Los datos se analizaron con el método de Ct delta-delta para calcular el factor de cambio. sondas TaqMan y cebadores para (ID ensayo: Hs03296680_s1) HOTAIR, GAPDH (ID ensayo: Hs02758991_g1), miR-34a (ensayo ID: 000426), y RNU48 (Ensayo ID: 001006) se obtuvieron de Applied Biosystems. GAPDH y RNU48 se utilizaron como controles internos
La transfección
HOTAIR siRNA (SASI_Hs02_00380445 y SASI_Hs02_00380446, Sigma) y control negativo siRNA (D-001810-10;. Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) se utilizaron en experimentos de pérdida de función. Pre-miARN precursor de miR y el control negativo (Applied Biosystems) se utilizaron en experimentos con ganancia de función. PC3 y DU145 células fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 transfección reactivo (Invitrogen), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
proliferación celular, la migración y la invasión ensayos
Se midió la proliferación de las células utilizando un CellTiter 96 acuosa Una célula de soluciones kit Ensayo de proliferación (MTS) (Promega, Madison, WI, EE.UU.) realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proliferación celular se determinó por medidas de absorbancia a 490 nm usando SpectraMax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EE.UU.). actividad de migración celular se evaluó mediante el ensayo de curación de heridas. Las células se sembraron en placas de seis pocillos, y las monocapas de células se rasparon con una punta de micropipeta P-20. La anchura de la separación inicial (0 h) y la brecha residual 24 horas después de la herida se calcularon a partir fotomicrografías. ensayo de invasión de las células se llevó a cabo utilizando modificado Boyden Salas compuestas de Matrigel insertos de filtro de membrana Transwell-pre-revestido con ocho poros micras en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.). medio esencial mínimo que contenía 10% de FBS en la cámara inferior servía de cebo químico, tal como se describe anteriormente [43]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
En vivo Crecimiento Tumoral
Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las directrices del Centro Médico de Veteranos de San Francisco y el estudio fue aprobado por el San Francisco VA (número de protocolo: 11-008-01) IACUC. usuarios en animales han completado programas de capacitación para manejar y trabajar con los ratones a través de AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) antes de los experimentos con animales. Para el modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo, DU145 células (5 × 10
6) que fueron transfectadas transitoriamente con si-AIRE CALIENTE, al control de la IS se suspendieron en 100 l de RPMI 1640 y se inyectan por vía subcutánea en la izquierda y la parte trasera derecha flancos de la hembra ratones desnudos, respectivamente. (Cepa BALB /c nu /nu; Laboratorios Charles River, Inc., Wilmington, MA, EE.UU., 5 semanas de edad). Un total de 4 ratones desnudos se utilizaron y el crecimiento del tumor fue examinado en el transcurso de 35 días. El volumen del tumor se calculó sobre la base de la anchura (x) y la longitud (y):. x
2y /2, donde x & lt; y
apoptosis y el ciclo celular Los ensayos
por fluorescencia (FACS) el análisis de clasificación de células activadas por apoptosis se realizó 96 horas después de la transfección, usando un equipo de Anexina V-FITC /7-AAD (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis del ciclo celular se realizó 96 horas después de la transfección. Las células se recogieron, se lavaron con PBS frío y se resuspendieron en la mancha nuclear 49,6-diamidino-2-fenilindol (Beckman Coulter). Las células teñidas se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).
Identificación de genisteína genes regulados objetivo y el análisis bioinformático
Para la búsqueda de los genes que son regulados por la genisteína, se realizó de microarrays. Para identificar los procesos biológicos o vías potencialmente regulados por la genisteína, se realizó un análisis GENECODIS [44], [45] el uso de todos los genes candidatos. Entonces, para identificar las redes entre genisteína y sus genes diana, se analizaron y caracterizaron esos genes en procesos biológicos GO y KEGG vía de categorías. Estos datos se utilizaron para examinar las redes moleculares genisteína reguladas en las células humanas. Se realizaron análisis de la expresión génica de todos los genes candidatos involucrados en cada una de las vías que utilizan los datos de microarrays de expresión, que fueron aprobadas por el GEO y se asignaron los números de adhesión (GEO) GSE29079. En el Affymetrix Human exón 1,0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) de datos, se examinaron 47 tejidos con CaP y 47 tejidos normales de la próstata, todos los cuales se obtuvieron de pacientes que no habían estado expuestos al neo-adyuvante radio-, terapia cytotoxic- o endocrino antes de la operación. Los datos se normalizó y se analizaron con el GeneSpring (Agilent Technologies). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el test U de Mann-Whitney con corte P. & lt; 0,05, y los resultados se muestran como un diagrama de mapa de calor
Construcción de plásmidos y ensayos Dual-Luciferase Reporter
para buscar los genes miARN objetivos de aire caliente, se utilizó el algoritmo de miRcode (versión 6.2, http://www.mircode.org/). MiRcode proporciona predicciones humanos miARN objetivo basándose en la anotación de genes GENCODE integral [46], incluyendo & gt; 10.000 largos no codificantes genes de ARN. Para el ensayo de informador de luciferasa, se utilizó PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega). Las secuencias de oligonucleótidos (de tipo salvaje) utilizados se muestran en la Tabla S3. También se construyeron oligonucleótidos mutados para cada uno de los oligonucleótidos de tipo salvaje (Tabla S3). En un volumen total de 25 l, 1 l cada uno de 100 mM de avance y oligonucleótido inverso, 2.5 l de 10 x tampón de hibridación (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl y 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético) y 20,5 l de agua eran se incubaron a 95 ° C durante 3 min y luego se coloca a 37 ° C durante 15 min. Los oligonucleótidos se ligaron en el sitio PmeI-XbaI de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión. Para el ensayo de luciferasa, células de CaP fueron co-transfectadas con pre-MIR precursor de miARN y pmirGLO Dual-Luciferase miARN objetivo Vectores de expresión utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y tremeGENE X-HP reactivo de transfección de ADN (Roche Diagnóstico, Basilea, Suiza, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. reportero de ensayo de luciferasa se realizó utilizando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega) 24 horas después de la transfección.
Análisis estadístico
La relación entre dos variables y los valores numéricos obtenidos por tiempo real RT -PCR se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney no paramétrico. Todos los análisis se realizaron utilizando expertos Statview (versión 4, SAS Institute Inc.). Los datos se muestran como valores medios ± error estándar. En la comparación entre las tres variables, a nivel estadístico no ajustado de significación de P & lt; 0,05 corresponde a un nivel ajustado por Bonferroni de P & lt;.
0,0167
Apoyo a la Información
Figura S1. genisteína putativo genes regulados en 'Camino en el cáncer'. La genisteína putativo genes regulados (resaltado en rojo) como se define en Kyoto Enciclopedia de genes y genomas vía (KEGG) y se determinó mediante el análisis GENECODIS
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s001 gratis (TIF)
Figura S2. El diagrama de mapa de calor de los "Caminos en el cáncer". Análisis muestran tejidos de cáncer de próstata (n = 47) y muestras normales de la próstata (n = 47). Cada cuadrado representa el nivel de expresión de un gen dado en una muestra individual. El rojo representa el aumento de expresión y el azul representa una disminución de expresión en relación con la expresión normalizada del gen en todas las muestras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s002 gratis (TIF)
Tabla S1. Los genes regulados a la baja por la genisteína
doi:. 10.1371 /journal.pone.0070372.s003 gratis (XLS)
Tabla S2.