Extracto
Muscle cáncer de vejiga invasivo (MIBC, ≥T2 etapa) se asocia generalmente con mal pronóstico, que constituye la segunda causa de muerte más común entre los tumores genitourinarios. Debido a las variaciones significativas de heterogeneidad molecular alto en la historia y la enfermedad resultado natural se han observado. Esto también ha retrasado la introducción de terapias personalizadas, por lo que el cáncer de vejiga en estadio avanzado casi una enfermedad huérfana en términos de tratamiento. Altered glicosilación de la proteína traducida por la expresión del antígeno sialil-Tn (STN) y su precursor Tn, así como la activación de la vía /mTOR PI3K /Akt son eventos asociados con el cáncer que pueden tener un potencial para la estratificación del paciente y la terapia guiada. Por lo tanto, un diseño retrospectivo, 96 tumores de vejiga de diferentes etapas (Ta, T1-T4) se proyectó para STn y formas fosforiladas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR), S6 (PS6) y PTEN, relacionado con la activación de la PI3K /Akt /mTOR vía. En nuestra serie la expresión de Tn era residual y no estaba vinculado a la etapa o resultado, mientras que STn fue estadísticamente superior en MIBC en comparación con los tumores invasivos no musculares (p = 0,001) y asociado disminución de la supervivencia específica del cáncer (log rank p = 0,024). Por el contrario, la PI3K /Akt /mTOR vía intermedios mostró una distribución equitativa entre los no músculo cáncer de vejiga invasivo (CVNMI) y MIBC y no se asoció con la supervivencia del cáncer espe-(CSS) en cualquiera de estos grupos. Sin embargo, la sobreexpresión de pAKT, pmTOR y /o ps6 permitió discriminar los tumores de vejiga en estadio avanzado STN-positivas que enfrentan peores CSS (p = 0,027). Además, el análisis de regresión de Cox multivariado reveló que la sobreexpresión de /Akt /mTOR proteínas de la vía PI3K en EST + MIBC se asoció independientemente con el riesgo aproximadamente 6 veces mayor de muerte por cáncer (p = 0,039). Ratones portadores de tumores de vejiga en estadio avanzado inducidos químicamente que imitan la naturaleza histológica y molecular de los tumores humanos fueron entonces administrados con sirolimus inhibidor de mTOR-vía (rapamicina). Esto redujo el número de lesiones invasivas y, concomitantemente, la expresión de STn y también PS6, el efector aguas abajo de la vía PI3K /Akt /mTOR. En conclusión, STn se encontró que era marcador de mal pronóstico en el cáncer de vejiga y, en combinación con la evaluación de la vía PI3K /Akt /mTOR, tiene potencial para mejorar la estratificación de la enfermedad en estadio. Los experimentos en animales sugieren que la inhibición vía mTOR podría ser un enfoque terapéutico potencial para este subtipo específico de MIBC
Visto:. Costa C, Pereira S, Lima L, Peixoto A, Fernandes E, Neves D, et al. (2015) La glicosilación de proteínas anormales y PI3K activada /Akt /mTOR Camino: Papel en el cáncer de vejiga Pronóstico y terapias dirigidas. PLoS ONE 10 (11): e0141253. doi: 10.1371 /journal.pone.0141253
Editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), ESPAÑA
Recibido: 28 Julio, 2015; Aceptado: 6 Octubre 2015; Publicado: 16 de noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Costa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT) Postdoctoral otorga SFRH /TLP /66288/2009 (José Alexandre Ferreira), SFRH /TLP /101827/2014 ( Luis Lima), SFRH /TLP /85462/2012 (Rui Gil da Costa) y becas de doctorado SFRH /BD /103571/2014 (Fernandes) y Elisabete SFRH /BD /111242/2015 (Andreia Peixoto). FCT es co-financiado por el Fondo Social Europeo (FSE) en el marco del Programa Operación Potencial Humano (POPH) del Marco Estratégico Nacional de Referencia (MENR). Los autores también reconocen el apoyo financiero de ICBAS-UP (Céu Costa y Sofía Pereira) y la Asociación Portuguesa de Urología /Pfizer premio 2013. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de la . manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el segundo más mortal de tumor genitourinario y presenta pronóstico significativamente peor en
muscular propia
invasión [1]. Aproximadamente el 20-30% de los casos recién diagnosticados son cánceres invasivos del músculo de la vejiga (MIBC; estadios T2-T4), mientras que el 50% son no-musculares tumores invasivos de la vejiga (CVNMI) con un alto potencial para el progreso de la invasión. MIBC tratamiento incluye la cistectomía y (neo) adyuvante basada en cisplatino regímenes de quimioterapia [2]. Sin embargo, las variaciones importantes en la historia natural de la enfermedad y la respuesta al tratamiento se pueden observar entre los tumores con características histológicas idénticos, lo que refleja su heterogeneidad molecular alto [3]. Además, aproximadamente el 50% de los casos se desarrollan metástasis dentro de los 5 años, instando a la identificación de biomarcadores para ayudar a pronosticar y el desarrollo de terapias dirigidas más eficaces [4].
Para satisfacer esta necesidad, hemos abordado recientemente la expresión del antígeno sialil-Tn asociada al cáncer (STN) en una pequeña serie prospectiva de pacientes con cáncer de vejiga no seleccionados [5]. STn es una modificación post-traduccional anormal que resulta de una parada prematuro en las proteínas de la membrana celular
O
-glycosylation por sialilación del antígeno Tn (Fig 1A). En los tumores de vejiga, STn era principalmente presente en los casos en etapa avanzada, mientras ausente de la mayoría de bajo grado CVNMI [5]. Además, no fue expresada por el urotelio normal denota una naturaleza específica del cáncer [5]. Estudios
in vitro mostraron que la expresión
STn dotado células de cáncer de vejiga con alta capacidad de invasión [5] y un fenotipo immunotolerogenic, potencialmente favorecer la difusión de la enfermedad [6]. Las alteraciones en la superficie celular de la glicosilación de proteínas han de ser implicado en la activación de vías de señalización oncogénicas intracelulares [7], incluida la fosfoinositida-3-quinasa (PI3K) /Akt vía de señalización [8], que se cree que desempeñan un papel crítico en el desarrollo del cáncer de vejiga . Estas observaciones preliminares apoyan la hipótesis de que la expresión STn puede jugar un papel clave en la evolución de la enfermedad, lo que justifica una investigación más profunda. Varios estudios también sugieren que el antígeno Tn, que es un precursor de STn, puede ser también implicado en eventos oncogénicos [7]; Sin embargo no se sabe nada acerca de la expresión de este glicano en los tumores de vejiga.
A) Representación de la proteína de membrana
O
-glycosylation con énfasis en la expresión STn por las células cancerosas. Este es un proceso altamente regulado de importancia crítica para la estabilidad y función de proteínas. Brevemente, las proteínas recién sintetizadas son
O
-glycosylated en el aparato de Golgi mediante la adición ppGalNAcTs mediada por la fracción GalNAc a los residuos de Ser /Thr. Esto origina el antígeno Tn (GalNAc-O-Ser /Thr proteína columna vertebral), que es el más simple O-glicano. En las células normales estas cadenas se extienden a través de la adición secuencial de otros azúcares primero por CGALT-1 y luego otras enzimas. Esto culmina en glucanos altamente complejas, heterogéneas y alargadas menudo terminadas por ABO o grupo sanguíneo Lewis relacionados con antígenos (figura izquierda). En las células cancerosas el antígeno Tn se sialilada inmediatamente por ST6GalNAc.I, originando el antígeno STN (Neu5Ac-GalNAc-O-Ser /Thr-espina dorsal de proteínas), lo cual inhibe el alargamiento adicional de la cadena (imagen de la derecha). La expresión de STn en la superficie celular influye en la adhesión célula-célula y el reconocimiento de células de cáncer, motilidad favoreciendo, invasión y escape inmune. B) Representación esquemática de la PI3K /vía /mTOR Akt, que se activa de forma ubicua en los tumores de vejiga. Esta es una vía muy conservadas regulada principalmente por una amplia variedad de señales extracelulares, incluyendo los factores mitogénicos de crecimiento, hormonas, nutrientes, niveles de energía celular, y las condiciones de estrés. Estas señales activan tirosina quinasas receptoras que reclutan PI3K, que cataliza la conversión de PIP2 unido a la membrana a PIP3. Entonces Akt y PDK-1 se activan mediante la unión a PIP3. PTEN desfosforila preferentemente PIP3, inhibición de la progresión de señalización. la activación de Akt completa requiere doble fosforilación por PDK-1 en sí y PDK-2 (no mostrado). Akt fosforila mTOR directamente o también puede inactivar complejo TSC1 /TSC2, la inhibición de mTOR inactivación. mTORC1 desencadena el crecimiento y la proliferación celular mediante la fosforilación de los reguladores de la traducción eucariótica, entre estos p70S6 quinasa (p70S6K o S6K1) que, a su vez, fosforila la proteína ribosomal S6 (PS6), y la proteína de la traducción eucariótica factor de iniciación 4E vinculante 1 (4E-BP1 ). Para la proteína mTOR para activar su cascada de señalización, que debe formar el complejo ternario mTORC1 rapamicina y minúsculas. PI3K clave /Akt /mTOR-proteínas de la vía pAkt, pmTOR y ps6 explorados en este estudio se destacan por círculos de color naranja.
El fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) /Akt y la meta de la rapamicina en mamíferos (mTOR) vías están interconectados cascadas esenciales para el crecimiento celular y la supervivencia de la vejiga (Fig 1B) de señalización. La vía PI3K /Akt /mTOR o mTOR integra una multiplicidad de señales extracelulares para regular la síntesis de la señalización y proteínas aguas abajo, que en última instancia conduce a una ventaja de crecimiento competitivo, competencia metastásico, la angiogénesis y la resistencia a la terapia [9]. La cascada de señalización comienza con la activación de PI3K en la membrana celular, seguido de la serina /treonina quinasa Akt translocación de la membrana celular y la activación. El sustrato aguas abajo mejor estudiado de Akt es la mTOR quinasa de serina /treonina, cuya efector aguas abajo es S6 quinasa-1 (S6K1). En particular, un subconjunto de las alteraciones de la vía de mTOR se ha demostrado que se producen en el cáncer de vejiga, tales como mutaciones en
PIK3CA
gen, que culmina con células aumentado de señalización mTOR y cáncer de vejiga resistencia a la apoptosis [10]. Por otra parte, la inhibición farmacológica o bioquímica de la vía PI3K reduce drásticamente la capacidad invasiva de las líneas celulares de cáncer de vejiga. Además, más de la mitad de los tumores de vejiga humanos primarios presente alto de fosforilación de Akt y la activación aberrante de esta vía ha sido sugerido para contribuir a la invasión [11]. Otro acontecimiento que influya activación de la vía mTOR en los tumores de vejiga implica la pérdida de supresor de tumores PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma diez) de función [12]. PTEN normalmente suprime la activación de la vía PI3K /Akt /mTOR antagonizar PI3K y la prevención de la activación de Akt y PDK-1. PTEN también funciona para regular la quimiotaxis y la motilidad celular, promoviendo así la invasión del tumor [13]. En resumen, existen evidencias de que una evaluación completa de proteínas asociadas a la vía PI3K /Akt /mTOR puede tener un potencial significativo para el valor para la estratificación del paciente. Por otra parte, muchos estudios preclínicos y clínicos apoyan que los inhibidores de mTOR, como sirolimus (rapamicina) y sus derivados pueden mejorar el tratamiento del cáncer [13,14].
Sobre la base de estas observaciones que postula que Tn y /o puede STn actuar sinérgicamente con la vía de mTOR para conducir la progresión del cáncer de vejiga. Como tal, hemos dedicado a la evaluación de la expresión de STn y proteínas asociadas con la activación de la vía PI3K /Akt /mTOR activación de la vía en tumores de vejiga en diferentes etapas. Anticipamos que la combinación de eventos oncogénicos extracelulares e intracelulares puede mejorar la estratificación del paciente y proporcionar ideas para nuevos productos terapéuticos. Además hemos estimado el impacto de sirolimus en tumores uroteliales inducidos químicamente en ratones, que prevé la creación de una base para la terapéutica más efectivos para el cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este trabajo involucra experiencias en muestras tumorales de pacientes con diagnóstico de cáncer de vejiga en el Insituto Portugués de Oncología de Oporto. Todos los procedimientos se realizaron después de consentimiento informado por escrito del paciente y aprobados por el Comité de Ética del Instituto Portugués de Oncología-Porto. Toda la información clínico-patológico se obtuvo de la historia clínica de los pacientes.
También implica experimentos con animales. Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con la Directiva Europea 2010/63 /UE. Durante el transcurso de este estudio, los animales fueron alimentados con
ad libitum
con comida estandarizada (Tecklad dieta global, Harlan, España). El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité de Ética portuguesa para la Experimentación Animal (Direção Geral de Veterinaria, sin aprobación. 520/000/000/2003). Todos los ratones utilizados en el experimento fueron aclimatadas durante una semana en condiciones de rutina de laboratorio antes de iniciar los experimentos. Se alojaron al azar en grupos de 4-5 en jaulas de plástico, con las virutas de madera dura para la ropa de cama. Los animales se mantuvieron en una habitación con una temperatura controlada de 23 ± 2 ° C, un 12 horas de luz /oscuridad ciclo y 55 ± 5% de humedad. soluciones de beber de los animales se cambian una vez a la semana o antes si es necesario, y se registró el volumen bebido. También se observó la ingesta de alimentos semanalmente. Todos los ratones fueron monitorizados durante todo el experimento para signos de sufrimiento y la pérdida de peso corporal. Los animales fueron sacrificados con pentobarbital de sodio 0,4% (1 ml /kg, intraperitoneal).
Población
Este estudio se realizó en una serie retrospectiva de 96 tumores de vejiga en parafina fijados con formol obtenida a partir de bloques de parafina archivados en el Instituto Portugués de Oncología-Porto (POI), Portugal. Los tumores de vejiga se extrajeron de 82 hombres y 14 mujeres, con edades de 38 a 92 años (media de 69,5 años), ingresados y tratados en el IPOP entre 2005 y 2007. Cuarenta y siete de los tumores examinados histológicamente fueron clasificados como NMBIC (Ta y T1) y 49 como lesiones invasivas (T2-T4). Dieciséis eran de bajo grado y 80 eran tumores de alto grado, de acuerdo con los criterios de clasificación de la OMS de 2004. Por otra parte, el carcinoma
In situ gratis (CIS) se encontró de forma concomitante en el 20,8% de los pacientes. El período medio de seguimiento fue de 45 meses (1-134 meses). La cistectomía se realizó en 64 pacientes (66,7%) mientras que los otros 32 (33,3%) fueron sometidos a resección transuretral. La linfadenectomía se realizó en aproximadamente el 47% de los pacientes y de los que 37% de metástasis presentado. Cincuenta y cuatro (56,3%) eran tumores primarios y 42 (43,7%) fueron los tumores recurrentes. De los tumores recurrentes, el 38% no tenía ningún tratamiento previo, el 27% fueron tratados con Mitomicina C, el 11% con BCG y 19% fueron sometidos a dos tratamientos. Por otra parte el 5% de estos pacientes fueron tratados con quimioterapia neoadyuvante antes de la cistectomía. La Tabla 1 resume la información clínico-patológica.
La supervivencia cáncer-específica (CSS) se define como el período entre la extirpación del tumor mediante cirugía y, o bien la muerte del paciente por el cáncer o la última información de seguimiento. Todos los procedimientos se realizaron después del consentimiento informado del paciente y aprobados por el Comité de Ética de la IPO-Porto. Toda la información clínico-patológico se obtuvo de la historia clínica de los pacientes.
La inmunohistoquímica
Las expresiones de antígeno STn, su precursor Tn, y las formas fosforiladas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR), S6 ( PS6) y PTEN en los tumores de vejiga se accede por inmunohistoquímica utilizando el método de peroxidasa de avidina /estreptavidina, como se describe por Ferreira et al. [5]. La información sobre los anticuerpos primarios y las diluciones utilizadas en este estudio se resumen en la Tabla 2. La inmunorreactividad se reveló utilizando diaminobencidina (DAB, Thermo Scientific LabVision) como cromógeno y las secciones se counterstained con hematoxilina de Harris. Se realizaron controles negativos mediante la sustitución del anticuerpo primario con albúmina de suero bovino 5% (BSA). Los controles positivos se conocen tejidos positivos para los antígenos en estudio.
La inmunohistoquímica de puntuación de los tumores humanos
Las secciones immunostained se evaluaron a doble ciegas por microscopía de luz por dos observadores independientes (CC y SP) y validado por un patólogo experimentado (TA). Disaccording lecturas fueron re-analizados utilizando un microscopio de doble cabeza (Olympus BX46; Olympus Corporation), y se llegó a un consenso. Un enfoque semi-cuantitativa se estableció para anotar el marcaje inmunohistoquímico sobre la base de la extensión e intensidad de la tinción.
Dada la ausencia de Tn y STN en el urotelio sano [5], los tumores fueron clasificados como positivos para estos antígenos cuando la membrana y /o la inmunorreactividad citoplásmica se observaron en más de 5% del tumor, como se describe por Ferreira et al. [5,15]. pAkt, pmTOR, ps6 y PTEN expresiones fue evaluado de acuerdo a la intensidad de la tinción (débil-1 punto; moderadas-2 puntos; fuerte-3 puntos) multiplicado por el porcentaje de células positivas (0-5% -0 puntos; & gt; 5 -25% -1 punto; & gt; 25-50% -2 puntos; & gt; 50-75% -3 puntos; & gt; 75-100% -4 puntos). Sobre la base de la clasificación propuesta por Nishikawa et al. [16], los tumores con una puntuación & lt; 6 se consideraron negativos, mientras que aquellos con una score≥6 fueron clasificados como positivo (sobreexpresión). pAkt se evaluó sobre la base de inmunoreactividad nuclear, pmTOR y ps6 basado en la expresión citoplasmática y PTEN en tanto tinción citoplasmática y nuclear, como se sugiere en otras publicaciones [17,18].
Los experimentos con animales con sirolimus e inmunohistoquímica de puntuación
las secciones histológicas de la impronta Región de control de ratones (ICR) que lleva N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) inducida por lesiones en la vejiga, como resultado de nuestro trabajo anterior sobre el impacto de sirolimus en el cáncer de vejiga [19 ], fueron elegidos para este estudio. En pocas palabras, de cuatro semanas de edad, los ratones ICR macho (25 g; Harlan, Barcelona, España) se distribuyeron al azar en cuatro grupos, como se describe en detalle en una publicación anterior [18]. Grupo 1 (n = 6) incluían ratones expuestos a 0,05% BBN durante 12 semanas, seguido de agua del grifo durante 8 semanas (un total de 20 semanas). Grupo 2 (n = 7) incluidos los ratones tratados con solución BBN 0,05% durante doce semanas, mantenidos con agua del grifo normal para otra semana, administrados por vía intraperitoneal con sirolimus mTOR-inhibidor (1,5 mg /kg; Wyeth) durante cinco días a la semana durante seis semanas consecutivas, es decir, hasta el 19
ª semana, seguida de otra semana de agua del grifo (un total de 20 semanas). Grupo 3 (n = 6) incluían ratones expuestos a 0,05% BBN durante 12 semanas, seguido de agua del grifo durante 11 semanas (un total de 23 semanas). Grupo 4 (n = 7) incluido ratones tratados con 0,05% BBN y sirolimus, como se describe para el Grupo 2, pero con una exposición al agua del grifo después de 3 semanas (un total de 23 semanas). Grupo 3 y 4 fueron creados para estimar la posibilidad de recaída tardía y /o alteraciones moleculares que resultan de una supervivencia prolongada. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63 /UE. Durante el transcurso de este estudio, los animales fueron alimentados con
ad libitum
con comida estandarizada (Tecklad dieta global, Harlan, España). Los cambios histológicos inducidos por estos experimentos incluyen lesiones tanto preneoplásicas y neoplásicas con tumores potenciales e invasoras invasoras, como se describe en detalle por Oliveira et al. [18]. En este documento, las lesiones de los tumores invasivos potenciales y musculares invasivos altos fueron seleccionados para STn y PS6 por inmunohistoquímica, como se describe en detalle en los tumores humanos, ya que los anticuerpos utilizados son reactivos tanto contra humanos y ratones. Tanto la intensidad y la extensión de la inmunotinción se tomaron en consideración para anotar la expresión de los antígenos, como se describe en la sección anterior. Las lesiones de la vejiga y la inmunotinción se evaluaron a doble ciegas por dos observadores independientes (CC) y SP, revisados por un patólogo veterinario con experiencia (RMGC).
El análisis estadístico
Análisis estadístico de datos se realizó con El paquete de IBM estadístico para Ciencias sociales SPSS para Windows (versión 20.0). Se utilizó el análisis de chi-cuadrado para comparar variables categóricas. las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se utilizaron para evaluar correlación entre la expresión STn y supervivencia específica del cáncer (CSS) y se compararon mediante la prueba de log-rank. Además, se realizó un análisis de regresión de Cox multivariado para evaluar el efecto individual de los marcadores evaluados en la supervivencia del paciente y ajustar para posibles factores de confusión (variables que pudieran afectar CSS de pacientes CVNMI y MIBC). La correlación entre las moléculas de la vía PI3K /Akt /mTOR se realizó mediante la prueba de Spearman Rho.
Resultados
Altered glicosilación de proteínas, traducción de la expresión del antígeno STn y su precursor Tn, PI3K /Akt /moléculas mTOR la vía (pAkt, pmTOR, ps6), y la inactivación de PTEN, son características más destacadas de los tumores de vejiga. En esto hemos dedicado a un análisis exhaustivo de estas alteraciones moleculares en una serie de pacientes con cáncer de vejiga en las diferentes etapas de la enfermedad, que prevé biomarcadores de mala supervivencia específica del cáncer.
Nuestro conjunto de datos se compone en un 47 y un 49 CVNMI pacientes MIBC, como se mostró en la Tabla 1. de acuerdo con la figura 2, CVNMI presentaron una mayor supervivencia específica del cáncer (CSS, con una media de CSS: 119 meses) que los pacientes MIBC (media CSS: 43 meses; log rank, p & lt; 0,001). Estos resultados demostraron que nuestra serie refleja el curso natural de la enfermedad y destacó la CSS significativamente menor de MIBC en comparación con los casos CVNMI. Por lo tanto, un interés particular se estableció en la identificación de biomarcadores para la enfermedad en etapa tardía en base a la comparación entre CVNMI y MIBC.
El análisis de Kaplan-Meier que muestra el CSS de CVNMI (Ta y T1) y s de MIBC (T2 , T3 y T4). Comparación realizada por la prueba de log-rank (p & lt; 0,001); + CVNMI pacientes censurados; ⧫ censurado pacientes MIBC.
Tn y STN expresiones antígeno de cáncer de vejiga
Se observó el antígeno Tn en aproximadamente el 10% de NMBC y MIBC (Tabla 2) y su expresión era residual , ¿no superior a 5% de la superficie del tumor y sin ningún patrón definido. Por otra parte, se detectó el antígeno STn en aproximadamente el 60% de los tumores de vejiga estudiadas, que está de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores [5]. El antígeno se expresa predominantemente en la membrana celular, aunque también se observó tinción citoplásmica. El antígeno STn presentó una expresión focal que no superó el 30% del área del tumor para la mayoría de los casos positivos, independientemente de su origen histológico. STn se expresa principalmente por células indiferenciadas en los tumores que muestran
lámina propia (T1; 60%) y
muscular propia
(≥ T2, aproximadamente el 60-90%) la invasión; A la inversa el porcentaje de Ta positivo fue menor que 30% (
p
& lt; 0,001; figura 3A). Aunque sin significación estadística, en las células de los tumores Ta STN positivas estaban presentes principalmente en las capas superficiales del tumor fuera de los vasos. Por el contrario, se observaron de acompañamiento y /o la invasión de la capa basal (Fig 3B) células positivas STN en tumores T1 (Figura 3B), mientras que en MIBC estas células se encuentran principalmente en los frentes de invasión (Fig 3b) y invasor y /o dentro de la vasos, lo que sugiere un papel en la invasión y la enfermedad de difusión. El refuerzo de estas observaciones, la presencia de antígeno STn fue estadísticamente superior en MIBC en comparación con CVNMI (
p = 0,001
, Tabla 3).
(A) Distribución de los tumores negativos y positivos a lo largo de STN las diferentes etapas de cáncer de vejiga; (B) Imágenes representativas de tinción STN CVNMI y MIBC. Izquierda-CVNMI que muestra un predominio de células STN positivos en las capas superficiales, lejos del apoyo fibrovascular; observar los barcos sin células positivas. Haga MIBC que muestra el frente de invasión con STN células teñidas positivamente; observar las células uroteliales STN positivos en los vasos (flecha), lo que sugiere una posible participación en la metástasis.
PI3K /Akt /mTOR en el cáncer de vejiga
La evaluación de la PI3K /Akt /mTOR /S6 se realizó utilizando anticuerpos para las formas fosforiladas activas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR) y S6 (PS6). PTEN, que regula negativamente la señalización Akt, también fue evaluado.
pAkt se detectó tanto en el citoplasma y núcleo. En los casos CVNMI se observaron varias zonas con diferente intensidad de la expresión (Fig 4A), que denota un patrón heterogéneo que no era evidente en MIBC (Fig 4B). Además, las células del estroma de casos positivos MIBC mostraron una mayor intensidad de la tinción principalmente en las zonas cercanas al tumor. pmTOR inmunoreactividad fue citoplasmática y, en casos puntuales, nuclear. En urotelio con la expresión de la histología normal de pmTOR aparente estaba restringido a las capas de células superficiales. En CVNMI expresión pmTOR se distribuye uniformemente a través de las varias capas de células uroteliales, aunque hubo una tinción más intensa en las capas superficiales (Fig 4C). Por otra parte, se observaron varias zonas con intensidad de la tinción variable que denota una expresión heterogénea. En MIBC aspectos positivos de los casos, la expresión pmTOR era focal y heterogénea (Figura 4D). ps6 inmunoreactividad fue predominantemente citoplasmática. En CVNMI se observó expresión ps6 en todas las capas superficiales, tanto en el paraguas y las células diferenciadas (Figura 4E). La inmunorreactividad de PS6 variarse a través de las células tumorales. En MIBC ps6 presentó una expresión difusa por todo el tumor, siendo más presente en las células basales y de la mitosis (Figura 4F). Varios casos positivos presentó un aumento de la intensidad de tinción ps6 en el frente de invasión así como la expresión ps6 de infiltración tumoral de linfocitos y células endoteliales.
A y B) la expresión nuclear y citoplasmática pAKT en CVNMI (A) y MIBC (B) . En los casos CVNMI pAkt presentó un patrón heterogéneo con áreas de diferente intensidad de la expresión. En MIBC, las células del estroma, principalmente en las zonas cercanas al tumor mostraron una mayor expresión. C y D) pmTOR expresión citoplásmica en CVNMI (C) y MIBC (D). En CVNMI pmTOR se expresó a través de varias capas, aunque hubo una tinción más intensa en las superficiales. En MIBC casos positivos pmTOR expresión era focal. E y F) PS6 expresión citoplasmática en CVNMI (E) y MIBC (F). En CVNMI expresión se observó PS6 en todas las capas superficiales tanto en paraguas y células diferenciadas. En MIBC la inmunorreactividad era difusa, sin embargo, más presente en las células basales y de la mitosis. expresión PS6 fue mayor en el frente de invasión y en los linfocitos infiltrantes de tumores y células endoteliales. G y H) PTEN expresiones citoplasmáticas y nucleares en CVNMI (G) y MIBC (H). PTEN expresión fue mayor en comparación con CVNMI MIBC.
Teniendo en cuenta la extensión de la tinción y su intensidad, 62/94 (66%), 33/96 (34%) y 45/95 ( 47%) de los tumores de vejiga se considera positiva para pAkt, pmTOR y PS6, respectivamente. Una prueba rho de Spearman mostró que las expresiones pAkt, pmTOR, PS6 se correlacionaron significativamente (P & lt; 0,05) independientemente de la etapa del tumor, por lo tanto, de acuerdo con una vía totalmente activa. Además, a pesar de las diferencias histológicas, estos marcadores presentan una distribución igual entre los CVNMI y MIBC y no podían estar asociados con invasión del músculo (Tabla 3).
Por otro lado, 37/92 (40%) de la Los tumores fueron considerados positivos para PTEN. PTEN se expresó en el citoplasma y núcleo de las mismas células, sin embargo, con menor extensión de expresión en MIBC (33%, Fig 4G) en comparación con CVNMI (83%; Fig 4H). Por otra parte, el fenotipo PTEN-negativo se asoció significativamente con invasión muscular (Ta y T1; p & lt; 0,001, Tabla 3)., Lo que puede contribuir a mantener una PI3K activa /Akt /mTOR vía /S6 en estos casos
Tn, STn, PI3K /Akt /mTOR y la supervivencia cáncer específica
Un análisis de Kaplan-Meier se utilizó para evaluar las asociaciones entre los marcadores biológicos abordados y la supervivencia específica del cáncer de los pacientes. Hemos observado que los pacientes que tienen tumores que expresan STN tenían una menor CSS, independientemente de su estadio (p = 0,024; figura 5A). Esto también se observó en la evaluación de CVNMI solo (p = 0,020; figura 5B). Más importante aún, entre CVNMI, STN expresando tumores T1 presentaron CSS más bajo que los tumores negativos (p & lt; 0,05). Por otra parte, el análisis de regresión de Cox multivariado ajustado para posibles factores de confusión, a saber, la edad, el género, el estadio, grado, estado de recurrencia, la presencia de CIS concomitante se realizó. Se encontró que STn es un marcador pronóstico independiente de peor CSS (HR = 11,836; IC del 95%: [1,063-131,7]; p = 0,044). En contraste con STn, tumores positivos Tn, pAkt, pmTOR y PS6 no mostraron diferencias en comparación con CSS lesiones negativos, independientemente de su etapa. También hemos observado que los pacientes portadores de tumores PTEN-negativos tenían CSS menor (p = 0,015, figura 6). son necesarios para determinar si la falta de efecto supresor de PTEN más de PI3K /Akt /mTOR puede dar cuenta de estos hallazgos más estudios
El análisis de Kaplan-Meier que muestra la asociación entre STn y CSS en:. (a) Todos los estudiada pacientes con cáncer de vejiga; pacientes (B) CVNMI. Comparación realizada por la prueba de log-rank (A: p = 0,024; B: p = 0,020); + tumores negativos STN censurados; ⧫ censurado STn tumores positivos.
El análisis de Kaplan-Meier que muestra el efecto en el CSS de expresión de PTEN en todos los pacientes con cáncer de vejiga estudiados. Comparación cabo mediante la prueba de log-rank (p = 0,013); + negativo tumores PTEN censurados; ⧫ censurado PTEN tumores positivos.
Sobre la base de estas observaciones y con el objetivo de mejorar el valor pronóstico de STn en el contexto de la enfermedad en etapa tardía (MIBC), hemos integrado exhaustivamente la información desde STN y PI3K /biomarcadores Akt /mTOR. De acuerdo con la figura 7, la introducción de moléculas de la vía PI3K /Akt /mTOR permitió discriminar tumores positivos STN MIBC con peor CSS (p = 0,027). Además, el análisis multivariante de regresión de Cox (ajustado a la edad, estadio, el estado de la recurrencia, la presencia de CIS concomitante y metástasis) reveló que la presencia de moléculas de la vía PI3K /Akt /mTOR en STn + MIBC se asocia independientemente con el riesgo aproximadamente 6 veces mayor de muerte por cáncer (HR = 5,662; IC del 95%: [1,093 a 29,323]; p = 0,039). Estas observaciones sugieren, por primera vez, que la combinación de biomarcadores STN y mTOR vía puede tener un potencial para mejorar la estratificación de los tumores en estadio avanzado de la vejiga; Sin embargo corroboración en serie más grande es obligatorio
El análisis de Kaplan-Meier que muestra la asociación entre pAKT, pmTOR y expresiones ps6 en el CSS de los tumores positivos STN MIBC:. La comparación realizada por la prueba de log-rank (p = 0,027); + tumores negativos pAKT y pmTOR y ps6 censurados; ⧫ censurado pAKT y /o pmTOR y /o ps6 tumores positivos.
La inhibición de la vía PI3K /Akt /mTOR en modelos animales
ratones tumores de vejiga inducidos por BBN imitando la histología y la naturaleza molecular de los cánceres humanos [20,21], se hacen pruebas de STn y ps6, el efector aguas abajo de la vía mTOR. Se observó ninguna expresión STn en el urotelio ratones sanos, de acuerdo con la observación anterior de la vejiga humano sano [5].