Extracto
Belinostat es un inhibidor de HDAC de clase hidroxamato que ha demostrado actividad en el linfoma de células T periféricas y está siendo sometido a ensayos clínicos para neoplasias no hematológicas. Hemos estudiado la farmacocinética de Belinostat en pacientes con carcinoma hepatocelular para determinar la vía principal del metabolismo de Belinostat. La farmacocinética de belinostat en pacientes con cáncer de hígado se caracterizaron por el aclaramiento plasmático rápido de belinostat con un extenso metabolismo con más de 4 veces mayor exposición sistémica relativa de metabolito principal, glucurónido belinostat que la de belinostat. Hubo una variabilidad interindividual significativa de la glucuronidación Belinostat. La principal vía de metabolismo implica la glucuronidación mediada por UGT1A1 y una buena correlación ha sido identificado entre la formación Belinostat glucurónido y glucuronidación de sustratos de UGT1A1 conocidos. Además, los microsomas de hígado albergar UGT1A1 * 28 alelos tener actividad glucuronidación inferior para belinostat comparación con aquellos con UGT1A1 de tipo salvaje. La principal vía metabólica de Belinostat es a través de la glucuronidación mediada principalmente por UGT1A1, una enzima altamente polimórficos. El significado clínico de este hallazgo queda por determinar
Registro de prueba gratis
ClinicalTrials.gov NCT00321594
Visto:. Wang LZ, J Ramírez, Yeo W, Chan M-YM , Thuya WL, Lau J-YA, et al. (2013) La glucuronidación por UGT1A1 es la vía dominante de la metabólico Disposición de Belinostat en cáncer de hígado pacientes. PLoS ONE 8 (1): e54522. doi: 10.1371 /journal.pone.0054522
Editor: John Luk, Johnson & amp; Johnson Medical, China
Recibido: 2 Agosto, 2012; Aceptado: December 12, 2012; Publicado: 30 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue patrocinado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (Programa de Terapias Experimentales) y el Consejo Nacional de Investigación médica de Singapur (NMRC /CSA /021/2010). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Tenga en cuenta que es un producto Belinostat TopoTarget. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
inhibidores de la deacetilasa
histonas (HDACIs) han demostrado tener actividad contra el cáncer en las células malignas a través acetilación de las proteínas tanto de las histonas y no histonas. La acetilación de las histonas media la modulación epigenética de genes que pueden inducir apoptosis, inhibir el crecimiento celular y reducir la neoangiogénesis [1] - [7]. Varios HDACIs se han aprobado para el tratamiento de linfoma de células T periféricas o cutánea [8] - [10]
Belinostat es un inhibidor de deacetilasa de histonas pan-a base de ácido hidroxámico en desarrollo clínico como una terapia anti-cáncer en. una gama de hematológicos y sólidos neoplasias malignas, tanto como agente único, así como las terapias de combinación [11] - [18]. Actualmente Belinostat se ha concedido la vía rápida y la designación de fármaco huérfano por la Food and Drug Administration de EE.UU. para el tratamiento de linfoma periférico de células T en recaída o refractario. Aunque clínicamente el fármaco ha sido relativamente bien tolerado, los eventos adversos comunes incluyen fatiga, náuseas y vómitos y letargo, alcanzando el grado 3 a la dosis máxima tolerable de 1200 mg /m
2 dados en el 30 minuto (min) infusiones para 5 días consecutivos cada 3 semanas. Belinostat está disponible en ambas formulaciones orales e intravenosos, y como se espera que el fármaco a administrar de forma crónica, son posibles toxicidades acumulativas. Por lo tanto, sería importante para determinar el metabolismo de Belinostat, para entender su
in vivo
disposición. Hasta ahora, se sabe muy poco sobre las vías metabólicas de Belinostat
Otros miembros de los inhibidores de HDAC de clase del ácido hidroxámico como vorinostat y panobinostat someten metabolismo primario por glucuronidación [19] -. [21]. Por otro lado, romidepsin, un inhibidor de HDAC de clase tetrapéptido cíclico, experimenta un metabolismo principalmente por CYP3A4 [22]. Por lo tanto, la hipótesis de que la glucuronidación sería la vía principal para el metabolismo de belinostat. Además, muchas isoformas glucuronosil transferasa son altamente polimórficos y la función de impacto, por ejemplo, la deleción homocigótica de alelos UGT2B17 (UGT2B17 * 2) da como resultado el metabolismo defectuoso de vorinostat [23]. De acuerdo con ello, sería importante identificar la principal isoforma de metabolización de fármaco de Belinostat, para comprender mejor la influencia de la farmacogenética en la variabilidad interindividual de la farmacodinámica Belinostat. Esto también proporciona una guía para futuros estudios de interacción de fármacos.
En este estudio, hemos estudiado la farmacocinética de Belinostat e identificamos sus metabolitos sobre la base de los espectros de masas y absorción UV máxima. Se identificaron el metabolito dominante de belinostat como glucurónido belinostat, y más estudiado la glucuronidación de belinostat utilizando un panel de isoenzimas UGT y microsomas de hígado humano, para determinar la isoforma principal responsable de su metabolismo. Por último, se exploró la influencia potencial de farmacogenética en la farmacodinámica de Belinostat
Materiales y Métodos
El protocolo para este ensayo está disponible como información de apoyo.; véase el Protocolo S1.
Reactivos
Belinostat (PXD101) fue un regalo del Instituto Nacional del Cáncer (Bethesda, MD, EE.UU.). Belinostat glucurónido (belinostat-G) se separó cromatográficamente con HPLC-UV y se aisló a partir de plasma humano usando un colector de fracciones. Su estructura química y la pureza ha sido verificado a través de LC-MS /MS (API 4000 espectrómetro de masas de triple cuadrupolo; AB Sciex, Concord, Canadá) y el análisis de HPLC-UV. Vorinostat glucurónido (vorinostat-G), el patrón interno, fue un regalo de Merck Sharp & amp; Dohme (IA) Corp. El acetonitrilo (grado HPLC), metanol (grado HPLC), etanol (grado analítico), ácido fórmico (grado analítico), dihidrato de fosfato de hidrógeno de disodio (Na
2HPO
4,2 h
2O) y ácido ortofosfórico (85%) se obtuvieron de Merck (Darmstadt, Alemania). Se usó agua directo QTM (Millipore Milford, MA, EE.UU.) para la preparación de la fase móvil. supersomas UGT humanos y UGT A y B de Reacción-Solutions se compraron de BD Gentest (San Jose, CA, EE.UU.). Estos son ADNc expresó UGT y un panel de 12 (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17) se utilizó.
microsomas de hígado humano Preparación
hígados humanos procedentes de 37 donantes normales de raza blanca se procesaron en el laboratorio del Dr. Maria Relling en el hospital infantil St. Jude de Investigación (Memphis, TN, EE.UU.) y fueron proporcionados por el Sistema de Contratación tejido hepático y Distribución (financiado por#N01- DK-9-2310) y por la Red Cooperativa de Tejidos Humanos. Los 37 microsomas de hígado humano (HLM) se aislaron a partir de diferentes muestras de hígado con ninguna correlación entre sí. Los microsomas se prepararon por centrifugación diferencial.
cohortes del estudio
Este ensayo multicéntrico de fase I de Belinostat se llevó a cabo en Hong Kong y Singapur. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito de acuerdo con las directrices de Buena Práctica Clínica, y el protocolo fue aprobado por las juntas de revisión institucional del Hospital Príncipe de Gales, Hong Kong y el Hospital de la Universidad Nacional de Singapur. Diecisiete pacientes fueron tratados con belinostat en dosis crecientes de 600 (n = 3), 900 (n = 3), 1200 (n = 6), 1400 (n = 5) mg /m
2 diariamente por vía intravenosa (iv) infusión durante 30 min durante 5 días cada 21 días.
farmacocinéticas Evaluación
muestras de sangre se recogieron en puntos de tiempo de muestreo predeterminado en día 1 antes de la dosis en, 15 min, 30 min, 45 min, 1 hora (h), 1,5 h, 2 h, 3 h, 5 h y 24 h postinfusional y día 5 en predosis, 30 min, 1 h, 1,5 h, 3 h, 5 h postinfusional y día 22 tras el inicio de 30 min iv infusión en una fase I de ensayos clínicos de Belinostat. Muestras de sangre venosa se habían recogido en tubos heparinizados. muestras de sangre recogidas se centrifugaron a 3000 g durante 10 a 15 min y el plasma (sobrenadante) se separó del sedimento celular y se almacenaron en tubos lisos a -80 ° C hasta el análisis. Las concentraciones de Belinostat y Belinostat glucurónido fueron cuantificados por cromatografía líquida método modificado de alto rendimiento /espectrometría de masas [24]. Brevemente, vorinostat-G se utilizó como estándar interno para belinostat-G. El espectrómetro de masas fue operado en el modo de iones positivos con las transiciones de masa óptimos de Belinostat-G:
m /z
495 & gt; 93 y vorinostat-G:
m /z
441 & gt; 232, respectivamente . El método analítico se validó bien con una buena linealidad (coeficiente de determinación, r
2≥0.999) en el rango de 1-100 M durante Belinostat-G.
Identificación de Belinostat Los metabolitos y el aislamiento de Belinostat- G
detección de metabolitos en muestras de pacientes se procesó con HPLC-UV a 268 nm, la longitud de onda de absorción máxima de belinostat. la separación de la línea de base de todos los analitos se logró en el Alltima C
18 (× 2,1 mm, 5 micras 150 mm) de columna. Fase móvil disolvente A era mM Na
2HPO
4 (pH 4,2, ajustado con ácido ortofosfórico), mientras que la fase móvil B disolvente compuesto de 70% de acetonitrilo y 30% de metanol (v /v). 20 Se utilizó un programa gradiente de fase móvil - porcentaje inicial de disolvente A era 75% (v /v) y la de disolvente B era 25% (v /v); porcentaje de disolvente B se aumentó a 95% (v /v) durante 13 min e inmediatamente cambió de nuevo a 25% (v /v) durante 7 min antes de la inyección de la muestra subsiguiente. tiempo de servicio de cada muestra fue de 25 min. El caudal se mantuvo a 0,5 ml /min.
Los metabolitos potenciales Belinostat se verificaron adicionalmente con un espectrómetro de masas en tándem en las exploraciones Q1, de productos y precursores. El aislamiento y purificación del metabolito principal de belinostat se realizó en un 3,9 × 300 mm de columna C18 Nova-Pak (Waters, Irlanda), usando tampón de 20 mM de acetato de amonio (pH 5,0) y 100% de metanol en una composición de la fase móvil inicial de 60% :40% (v /v) con una velocidad de flujo de 0,6 mL /min. El metanol se aumentó a 95% durante 10 min e inmediatamente cambió de nuevo a 40% de 6 min antes de la siguiente inyección. ß-glucuronidasa hidrólisis y espectrometría de masas (tanto en modo positivo y negativo) para determinar la pureza y la identidad del metabolito principal.
Prueba de estabilidad ácida para Belinostat-G
1 mg /ml de belinostat -G y vorinostat-G se preparó en varios vehículos con diferentes valores de pH. Estos vehículos incluyen 10 mM de acetato de amonio (pH = 6,5), formiato de amonio 10 mM (pH = 6,0), ácido acético 0,1% (pH = 3,2) y 0,1% de ácido fórmico (pH = 2,6). Todas estas muestras de ensayo se incubaron a 37 ° C durante 24 h. Se utilizó agua Milli Q (pH = 5,5) como solución de control que se almacenó en -20 ° C. Todas las muestras se analizaron por LC-MS /MS para obtener los valores de área de pico para belinostat-G y vorinostat-G. La estabilidad ácida de ambos compuestos conjugados se evaluó mediante la comparación de la relación de área de pico de las muestras de prueba frente al control.
in vitro
potencia de evaluación sobre Belinostat y Belinostat-G
Para determinar la presencia o ausencia de actividad dependiente de la dosis de belinostat y belinostat-G contra las células de cáncer hepatocelular, células humanas de carcinoma de hígado hepatocelular (HepG2) se sembraron en dos placas de 24 pocillos a 10.000 células por pocillo. Para una placa, se añadieron 5 concentraciones diferentes de belinostat para obtener 2 réplicas por concentración (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 mM). Para la otra placa, se añadieron de manera similar concentraciones molares iguales de belinostat-G. Después de 72 h, las células se tiñeron con pintura violeta de genciana (0,5% w /v; B.P.) y se evaluó su viabilidad. Además, las sensibilidades de HepG2 a Belinostat y belinostat-G fueron cuantitativamente midieron usando el ensayo de MTS. En resumen, las células HepG2 se sembraron en placas de 96 pocillos a 3.000 células /pocillo fueron tratados con dosis diferentes de siete belinostat o belinostat-G y luego evaluados para la inhibición del crecimiento con Promega CellTiter 96® AQ
ueous ensayo de proliferación celular no radiactivo . Después de incubar 24 h, solución de drogas 100-l o medio en blanco se añadió en cada pocillo de placas de 96 pocillos. 72 h después, se añadieron 20 l de MTS /PES en cada pocillo de incubación de 3 h. valores de DO se midieron la longitud de onda de 490 nm. inhibición del crecimiento celular se calculó sobre la base de las unidades luminiscentes con la resta de la lectura de fondo para pozos único medio que contiene. La inhibición del crecimiento se define como el porcentaje de las unidades luminiscentes medias de los pocillos tratados con el fármaco más que a partir de los pocillos de control sin tratamiento. El experimento se realizó por triplicado. IC
50 valores se calcularon utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.).
Western Blot
Para el análisis de transferencia Western, las células HepG2 tratadas con belinostat se cosecharon y se lisaron en tampón de lisis celular que contiene 50 mM Tris HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Las concentraciones de proteína se cuantificaron usando el ensayo de Bradford (Invitrogen). Las proteínas se separaron en un gel de SDS-PAGE 12% y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. La unión de proteína no específica fue bloqueada por incubación con 5% de leche sin grasa (BioRad Laboratories) en 0,1% PBS-Tween (PBST) a temperatura ambiente durante 1 h y se incubaron con anticuerpos específicos, la histona H3 y Ac-H3 [K9 /K14] (Señalización celular), a 4 ° C durante la noche. A continuación se añadieron apropiadas rábano picante peroxidises-conjugados específicos de cada especie secundaria de anticuerpos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h seguido de la detección utilizando un kit de quimioluminiscencia (GE Healthcare).
Proyección de 12 UGT humano supersomas y Análisis Cinético
A de incubación típico consistía en 50 g de UGT, UDPGA 2 mM (UGT reacción en solución A), 50 mM Tris-HCl, mM MgCl 8
2 y 0,025 mg /ml alameticina (Reacción UGT Solución B) en un volumen de incubación final de 100 mL. Antes de la adición de sustrato, la mezcla de incubación fue precalentado y se equilibró durante 5 min a 37 ° C. Las reacciones se iniciaron por adición de solución belinostat 10 mM en DMSO y se incubaron a 37 ° C durante 30 min; las reacciones se terminaron mediante la adición de 200 l de metanol y agitación en vórtex enfriado con hielo. La mezcla de incubación se agitó en vórtex y se centrifugó (10.060
g
) a 4 ° C durante 10 min, y los sobrenadantes se analizaron. microsomas de insectos sin UGT ADNc sirvieron como control negativo. Los parámetros cinéticos (
K
my
V
max) de la glucuronidación por Belinostat supersomas UGT1A1 fueron determinados usando concentraciones de sustrato del 10 al 750 mM. Las incubaciones se llevaron a cabo como se describe anteriormente. Tres experimentos independientes se realizaron para el análisis cinético.
Estudio de Correlación con UGT1A1 Sustratos, Expresión Génica UGT1A1 y UGT1A1 * 28 Polimorfismo
En un estudio de correlación de la glucuronidación de Belinostat y UGT1A1 sustratos, glucuronidación Belinostat era medida como se describe anteriormente usando 100 belinostat mu M y 50 g HLM; esta concentración de Belinostat fue seleccionado ya que está cerca de la Km de la UGT1A1. La glucuronidación de la bilirrubina, la tiroxina y SN-38 en estas microsomas, la medición de la expresión génica UGT1A1 y genotipado de UGT1A1 * 28 se han descrito anteriormente [25] - [27].
Análisis de Datos
belinostat-G velocidad de formación (
v
) se calculó como Cm, 30 min /tiempo de incubación /concentración CYP, donde Cm, 30 min fue la concentración de metabolitos después de 30 min de incubación. Los gráficos de la concentración de sustrato, S (eje X) frente a
A continuación, se construyeron v
(eje Y). Km y Vmax se calcularon utilizando la ecuación de Michaelis-Menten (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE.UU.). (1)
Asociación entre glucurónido Belinostat se realizaron concentración y UGT1A1 sustratos utilizando tanto la correlación de Pearson y (software GraphPad Prism, La Jolla, CA) pruebas de correlación de Spearman. Se estimaron los parámetros farmacocinéticos basados en el modelo de análisis no compartimental utilizando el software WinNonlin versión 5.3 (Pharmsight, Sunnyvale, CA, EE.UU.). exposición relativa de belinostat-G en el plasma del paciente se representa por la relación de las AUC concentración molar de belinostat-G sobre belinostat. Se utilizó análisis de varianza de una sola vía (ANOVA) para determinar la significación entre los genotipos con pruebas Tukey post-hoc para el ajuste para la comparación entre los grupos individuales. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Farmacocinética y Metabolismo del Belinostat en el plasma humano
Las concentraciones de Belinostat y Belinostat-G en 17 pacientes. inscrito en una fase I de ensayos clínicos en el carcinoma hepatocelular (HCC) se cuantificaron para la estimación de los parámetros farmacocinéticos (Tabla 1). Belinostat siguió una farmacocinética lineal a dosis entre 600 y 1.400 mg /m
2, con mayor variabilidad interindividual del aclaramiento en dosis más altas. Los coeficientes de variación de Liquidación (CL) fueron 29,0% y 30,6% en 1200 y 1400 mg /m
2, respectivamente. Belinostat fue eliminado rápidamente después de la administración i.v. la administración debido a la intensa fase II glucuronoconjugación, M1 (Figura 1)
Cromatograma en el día 5 y el día 22 (A).; Día 1 (B).
cinco metabolitos de Belinostat se identificaron a través de la comparación de la absorción de la radiación ultravioleta (UV) de las muestras de plasma a 268 nm antes y después de la dosificación. se detectaron perfiles cromatográficos similares en días 1 (Figura 1B) y el día 5 (Figura 1A). Los iones de productos de MS /MS de estos cinco metabolitos monitorizados en modo positivo apoyaron su identificación estructura química (Tabla 2). Glucuronidación era la vía más importante del metabolismo Belinostat; dos vías de biotransformación alternativos implicados metilación a belinostat de metilo y la reducción del grupo hidroxámico a su correspondiente amida belinostat. ácido Belinostat y el glucósido Belinostat otras 2 metabolitos secundarios detectados. La vía metabólica propuesta de belinostat se indica en la Figura 2. Las estructuras químicas de estos metabolitos se propuesta en base a sus picos de masa de moléculas protonadas [M + H]
+, 2 veces picos de masa de moléculas [2M + H]
+ y perfiles fragmentación de masas generados por la exploración producto. Estas estructuras se confirmaron por análisis de iones de fragmentación de iones precursores, que reveló un ion común producto (m /z 93, fragmento fenilamino) de belinostat y sus cinco metabolitos. Sobre la base de las estructuras de metabolitos, el resto hidroxamida es la estructura clave para la potencia de belinostat. Escaneado de m /z espectros partir del plasma de pacientes apoyado glucuronidación de belinostat través de la detección de 495, 989, 493 representa la belinostat protonada G, protonado doble belinostat G, y desprotonado belinostat G, respectivamente. La estructura química de belinostat-G aislado de plasma fue aclarada por espectrometría de masas. Una serie de espectros de masas de Belinostat-G fueron adquiridas a proponer la estructura química. Por ejemplo, m /z 495 y m /z 989 se identificaron como sus protonadas picos de masa de moléculas [M + H]
+ y 2 veces picos de masa de moléculas [2M + H]
+, respectivamente. La exploración en modo negativo detectó su ion primario desprotonado correspondiente como m /z 493 [M-H]
-. Un perfilado fragmentación masa similar en modo positivo se encontró tanto para belinostat y belinostat-G. Basado en el ión producto común (fragmento fenilamino), una exploración ion precursor de m /z 93 se procesa en belinostat y belinostat-G para derivar sus iones primarios como m /z 319 [M + H]
+ para belinostat y m /z 495 [m + H]
+ para belinostat-G, respectivamente. Asumiendo que esto era correcta, se esperaría que las estructuras químicas de sus metabolitos que poseen espectros UV similar para estos metabolitos y su compuesto de origen, así debido a la similitud de sus estructuras moleculares básicos, y esto con el apoyo de análisis espectral UV generada por el detector de arreglo de diodos (DAD) que muestra máxima longitud de onda similares a 268 nm para belinostat y sus cinco metabolitos.
El principal metabolito se identificó como belinostat-G que se confirmó aún más mediante reacción de hidrólisis enzimática. El belinostat-G aislado a partir de muestras de plasma de pacientes se sometió a
Escherichia colitis
derivado β-glucuronidasa (6,8 mg /ml) de la incubación durante 5 h, y la mezcla de reacción resultante se analizó mediante LC-MS /MS. El análisis farmacocinético cuantitativo indicó que la exposición belinostat-G era 4 veces mayor que la de belinostat en el plasma humano basado en la relación AUC concentración molar de belinostat-G /belinostat (Tabla 1). Por lo tanto, la glucuronidación Belinostat se confirmó que era la vía metabólica dominante para Belinostat.
Estabilidad de Belinostat-G en ácido de Medio Ambiente
Para caracterizar mejor la glucuronidación de Belinostat, hemos probado la estabilidad ácida de Belinostat -GRAMO. Belinostat-G y vorinostat-G, un control paralelo para belinostat-G, se demostró que ser estable después de 24 h de incubación a 37 ° C en varias soluciones ácidas (pH 2.6- pH 6.5). La variación en las concentraciones medidas al comienzo del experimento y después de 24 h era muy marginal (& lt; 4%). Esto es consistente con nuestra estructura O-conjugado propuesta de belinostat-G (M1) que se muestra en la Figura 2. Sin embargo, la degradación menor (7%) se identificó sólo cuando el valor de pH se redujo a 2,6. Los resultados confirmaron belinostat está conjugado con glucurónido en la posición O, como O-glucurónidos pero no N-glucurónidos de ácidos hidroxámicos son estables en medio ácido [28], [29]. Como vorinostat-G ha sido confirmado que se trata de un glucurónido conjugado O [30], se demuestra que el aislado Belinostat-G es un metabolito O-conjugado también.
Determinación de
in vitro
Efectos de citotoxicidad de belinostat y belinostat-G
Figura 3a y 3b muestran los resultados de las concentraciones en aumento de dosis de belinostat y belinostat-G llevaron a cabo en placas de 24 pocillos separados después de la incubación durante 72 h. Como concentración belinostat aumentó, el número de células viables (violeta manchado) mostró disminución dependiente de la dosis. Por el contrario, el aumento de las concentraciones de Belinostat-G no parece afectar la viabilidad celular dentro del intervalo de concentración ensayado. Como tal, a concentraciones equimolares entre 0-10 mM, belinostat demuestra citotoxicidad significativa dependiente de la dosis mientras que belinostat-G no lo hace. Además, los resultados de los ensayos de MTS eran también consistentes con la del ensayo de tinción (Figura 3c). acetilación de la histona H3 para la exposición Belinostat demostró un tiempo y aumento dependiente de la concentración (Figura 3d)
a:. Belinostat de incubación; b: Belinostat-G de incubación; (Plantillas para concentraciones añadidas (inferior) y los resultados de 24 pocillos concentraciones crecientes de dosis en células HepG2 (superior) C:. Resultados de MTS para Belinostat (IC
50 = 6,4 M) y Belinostat-G (no puede ser convergente) .. d: la actividad de acetilación Belinostat en las células HepG2 (western blot) a: acetil histona 3 aumenta con el incremento de dosis después de 5 h de incubación; B: cambios cinéticos de la histona acetil 3 con incremento de tiempo a las 10 M
in vitro
Screening metabolismo de UGT para belinostat-G Formación y la cinética de
UGT1A1 glucuronizado belinostat significativamente (Figura 4A), mientras que no se observó después de la incubación con el metabolismo UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 , UGT1A9, UGT1A10, UGT2B15 y UGT2B17. metabolismo menor (menos de 3%) se detectó con UGT1A3, UGT1A8, UGT2B4 y UGT2B7. 73,6% y 89,4% de belinostat se convirtió en belinostat-G después de 2 h y 4 h de incubación con UGT1A1, respectivamente (Figura 4B). Enzima parámetros cinéticos para la glucuronidación de belinostat se estimaron ajustando los datos agrupados a partir de incubaciones UGT1A1 realizados por triplicado a la ecuación de Michaelis-Menten. Los valores aparentes de Km y Vmax para la formación glucurónido 99,6 M y min /mg de proteína 353,1 pmol /, respectivamente (Figura 5). El aclaramiento intrínseco (Vmax /Km) para la formación de belinostat-G se estimó en 3,5 l /min /mg de proteína. En los microsomas de insecto de control, no se observó formación belinostat-G.
Los valores aparentes de Km y Vmax para la formación glucurónido fueron 99,6 M y /min /mg de proteína 353,1 pmol, respectivamente.
correlación de la glucuronidación de belinostat con UGT sustratos
En microsomas de hígado humano, la asociación entre la glucuronidación de belinostat y UGT sustratos se sometieron a pruebas paramétricas (correlación de Pearson) y no paramétrica (correlación de Spearman) pruebas. formación Belinostat-G fuertemente correlacionada con la formación de bilirrubina glucurónido (Figura 6A) (Pearson r
2 = 0,53; Spearman r
2 = 0,61 p & lt; 0,0001) y otros sustratos bien establecidos de UGT1A1 como tiroxina y SN38 (Pearson r
2 = 0,68; Spearman r
2 = 0,81 y Pearson r
2 = 0,82; Spearman r
2 = 0,62, respectivamente, todos p & lt; 0,001) (Figura 6B y 6C). concentraciones Belinostat-G después de la incubación con el HLM se correlacionó bien con la expresión de UGT1A1 mRNA (Pearson, r
2 = 0,66, p & lt; 0,0001, Figura 7A). Tomados en conjunto, estos sugieren que la UGT1A1 es la isoforma predominante en la glucuronidación UGT Belinostat
A:. La bilirrubina-G; B: tiroxina-4-G /CPT-11; . C: SN38-G /CPT11
R: Correlación de la formación Belinostat glucurónido con la expresión de UGT1A1 en microsomas de hígado humano; B: formación de glucurónido Belinostat por microsomas de hígado humano de acuerdo con el tipo silvestre, heterocigotos y homocigotos UGT1A1 * 28 genotipos
UGT1A1 Genotipo y glucuronidación de Belinostat en los microsomas hepáticos y correlación con la expresión genética de UGT1A1
UGT1A1 es una enzima polimórfica con variantes alélicas que influyen en su actividad enzimática. UGT1A1 * 28 es un polimorfismo frecuente que reduce la actividad de glucuronidación. Por lo tanto, para determinar el efecto de UGT1A1 * 28 sobre la formación de belinostat-G, que mide concentraciones belinostat-G después de la incubación de belinostat con cada una de 37 muestras HLM previamente genotipo para
UGT1A1 * 28
. Los post-incubación de 30 min concentraciones Belinostat-G (media ± DE) fueron 15,39 ± 6,00, 11,35 ± 4,11 y 7,14 ± 3,28 mmol de UGT1A1 * 1 homocigotos, UGT1A1 * 28 heterocigotos y homocigotos microsomas, respectivamente. Un análisis ANOVA de una vía demostró que se detectó una diferencia significativa entre los grupos (p = 0,01). análisis post hoc de Tukey sugirió que solamente la diferencia entre UGT1A1 * 1 y UGT1A1 * 28 microsomas homocigotos fue estadísticamente significativa. Como se muestra en la Figura 7B, UGT1A1 * 1 microsomas homocigotos tuvieron 2 veces mayores concentraciones medias de Belinostat-G en comparación con UGT1A1 * 28 microsomas homocigotos después de la incubación (
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Discusión
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe que describe la glucuronidación de belinostat. Hemos demostrado que belinostat sufre un extenso metabolismo a través de la glucuronidación se produce en el resto de hidroxamato, lo que lleva a la inactivación de su citotoxicidad. Esto es consistente entre otros inhibidores de hidroxamato de HDAC clase, así, donde la glucuronidación juega un papel importante en su metabolismo. El metabolito de perfiles después de la incubación con un panel de supersomas que sobreexpresan isoformas de UGT específicos, correlación con las tasas de glucuronidación de sustratos de UGT1A1 conocidos usando microsomas de hígado humano, y el análisis del perfil de espectrometría de masas de belinostat en una cohorte de pacientes con evidencia de cáncer de hígado, siempre que la glucuronidación belinostat
in vitro
y
in vivo
está mediada principalmente por UGT1A1. Curiosamente, la isoforma de la enzima que metaboliza principalmente otra vorinostat inhibidor de HDAC basado hidroxámico
in vivo
es UGT2B17, mientras que belinostat es metabolizado por UGT1A1, que es una isoforma más abundante en el hígado humano [31]. UGT1A1 está presente en el tracto gastrointestinal, lo que probablemente reducir la absorción oral de belinostat, y conducir a la reducción de la biodisponibilidad [32]. Además, la alta eficiencia de UGT1A1 para la metabolización de Belinostat probablemente reducirá aún más su biodisponibilidad oral a través de un extenso metabolismo de primer paso, lo que representa un desafío para el desarrollo de Belinostat oral.
Los inhibidores de HDAC que se encuentran en desarrollo clínico tienen potencial para efectos secundarios graves. Algunos de los efectos relacionados con la clase incluyen trombocitopenia, prolongación del intervalo QT en el electrocardiograma, fatiga severa y los efectos secundarios gastrointestinales, y estos parecen ser dependientes de la dosis. Belinostat se ha asociado con fatiga, diarrea y prolongación del intervalo QT en fase I y fase II [11], [33]. En vista de su estrecha ventana terapéutica, es importante determinar los factores tales como la farmacogenética de Belinostat que dan cuenta de la variabilidad interindividual de su farmacocinética. Anteriormente mostró que los pacientes con alelos UGT2B17 eliminados tienen una menor vorinostat-glucurónido relación vorinostat área bajo la curva y mayores efectos secundarios [20]. De acuerdo con ello, sería importante para comprender el alcance de la variabilidad interindividual de la farmacocinética y la farmacodinámica Belinostat atribuibles a la expresión polimórfica de UGT1A1. Nuestro estudio en microsomas hepáticos humanos es el primer paso en esta dirección.
UGT1A1 * 28 es un polimorfismo genético en la región promotora en una repetición adicional TA está presente en la caja TATA que por lo general tiene 6 repeticiones de TA, y resultados en la reducción de expresión de UGT1A1 [34]. En microsomas de hígado humano, la glucuronidación de SN-38, el metabolito activo de irinotecan, es menos eficiente en microsomas albergan UGT1A1 * 28 en comparación con el de tipo salvaje genotipo [25]. Concordantemente, los individuos con uno o más alelos UGT1A1 * 28 experimentan un mayor riesgo de neutropenia del tratamiento con irinotecán en dosis superiores a 250 mg /m
2 [35], [36]. Este polimorfismo es también más común en caucásicos que los asiáticos, con una frecuencia alélica de alrededor del 30% en los caucásicos y el 10% en los asiáticos [37]. Nuestros datos muestran que la UGT1A1 * 28 se asoció con una reducción de la glucuronidación Belinostat, lo que sugiere que los pacientes con este genotipo pueden llegar a tener una mayor exposición a Belinostat activo resultante de alteración en la depuración de Belinostat. A pesar de las consecuencias clínicas de esta exposición mayor con la dosis recomendada de Belinostat Actualmente se desconocen, se espera que los mayores efectos tóxicos a Belinostat. Si esto se demuestra, genotipificación UGT1A1 antes de la terapia Belinostat, tal como está actualmente disponible para irinotecan, es una forma de individualizar la terapia.
Ya sea UGT1A1 * 28 influye en la farmacocinética y la farmacodinámica más crucial de Belinostat en pacientes queda correspondientes; nuestros datos apoyan la necesidad de tales estudios futuros en los pacientes.