Extracto
Introducción
A pesar de las mejoras en las estrategias de tratamiento para el carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC), los resultados no han mejorado significativamente; destacando la importancia de identificar nuevos enfoques terapéuticos para apuntar esta enfermedad. Para hacer frente a este reto, se procedió a evaluar el papel del hierro en el CECC.
Se evaluaron Diseño Experimental
Los niveles de expresión de los genes relacionados con el hierro en líneas celulares HNSCC utilizando RT-PCR cuantitativa. efectos fenotípicos celulares se evaluaron utilizando la viabilidad (MTS), la supervivencia clonogénico, BrdU, y ensayos de formación de tumores. La importancia pronóstica de las proteínas relacionadas con hierro se determinó mediante inmunohistoquímica.
Resultados
En un panel de líneas celulares HNSCC, hemocromatosis (HFE) fue uno de los genes más sobreexpresados que participan en la regulación del hierro.
in vitro
desmontables de HFE en líneas celulares HNSCC disminuyó significativamente la expresión de hepcidina (HAMP) y el nivel de hierro intracelular. Esto a su vez, dio lugar a una disminución significativa de la viabilidad celular HNSCC, clonogenicidad, la síntesis de ADN, y la señalización de Wnt. Estos cambios celulares se invirtieron por la re-introducción de hierro de nuevo en las células después de HNSCC knockdown HFE, lo que indica que el hierro estaba mediando este fenotipo. Concordantemente, el tratamiento de células HNSCC con un quelante del hierro, ciclopirox olamina (CPX), redujo significativamente la viabilidad y supervivencia clonogénico. Por último, los pacientes con alta expresión HFE experimentaron una reducción de la supervivencia en comparación con los pacientes con baja expresión HFE.
Conclusiones
Nuestros datos identifican como potencialmente HFE nuevo marcador pronóstico en el CECC que promueve la progresión tumoral
a través de
HAMP y niveles elevados de hierro intracelular, dando lugar a aumento de la proliferación celular y la formación de tumores. Por lo tanto, estos resultados sugieren que los quelantes de hierro podrían tener un papel terapéutico en la gestión de los CECC
Visto:. Lenarduzzi M, Hui DBY, Yue S, Ito E, Shi W, Williams J, et al. (2013) La hemocromatosis mejora la progresión tumoral
a través de
Regulación al alza de hierro intracelular en cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 8 (8): e74075. doi: 10.1371 /
Editor journal.pone.0074075: Seema Singh, Universidad del Sur de Alabama Mitchell Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Junio, 2013; Aceptado: July 22, 2013; Publicado: 26 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Lenarduzzi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por fondos del Instituto de Investigación del cáncer de Ontario, los Institutos canadienses de Investigación en Salud, y el Presidente Elia Dr. Mariano en cáncer de cabeza y cuello Investigación. Los autores también agradecen el apoyo filantrópico de la familia de Wharton, el equipo de Joe y Gordon Tozer. Michelle Lenarduzzi es un beneficiario de becas de la Iniciativa para la Formación Fundación Estratégica Terry Fox a la excelencia en la radiación de Investigación del Siglo 21 (EIRR21) en los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la Beca Ontario Graduate (OGS) y la Biofísica Médica Excelencia premio. También se presta apoyo del Instituto de la familia de Campbell para la Investigación del Cáncer y el Ministerio de Salud y la planificación a largo plazo. CIHR - http://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html, EIRR21 - http://www.eirr21.utoronto.ca/, OGS - https://osap.gov.on.ca /OSAPPortal/en/A-ZListofAid/TCONT003465.html. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) es el sexto cáncer más común en todo el mundo, con ~ 650.000 nuevos casos diagnosticados y ~ 350.000 muertes al año [1,2]. La mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad localmente avanzada, ya pesar de los nuevos enfoques de tratamiento, las tasas de supervivencia libre de enfermedad a los 5 años se han estancado en un 30-40% [3]. Estos malos resultados ponen de relieve la importancia de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a esta enfermedad.
El hierro es un elemento esencial que interviene en múltiples procesos clave, incluyendo ADN y la síntesis del grupo hemo, la señalización de Wnt, y el metabolismo celular [4,5]. Muchas células cancerosas exhiben un aumento de la demanda de hierro con el fin de mantener su alta síntesis borde ADN celular. En consecuencia, los genes implicados en la regulación del hierro son a menudo desregulado en el cáncer. Aquí, se presenta la sobreexpresión de la hemocromatosis (HFE) en HNSCC, y demostrar su capacidad de alterar el hierro intracelular y aumentar la proliferación celular.
La hemocromatosis es la glicoproteína transmembrana, similar al tipo de molécula principal de histocompatibilidad de clase 1 ( MHC) que se asocia con B
2-microglobulina para el transporte intracelular a la membrana plasmática [6]. En la membrana, HFE puede unirse a cualquiera de los receptores de transferrina 1 (TRF1) o receptor de la transferrina 2 (TFR2). Los sitios de unión de HFE y hierro unido a transferrina en superposición TFR1 [7], regulando de este modo la absorción de hierro en las células. Sin embargo, la evidencia más reciente también sugiere que un papel central de HFE es estimular la expresión de la hormona reguladora de hierro, la hepcidina (HAMP), ya sea a través de unión con TFR2 [8], o de forma independiente [9]. La función de HAMP es internalizar y degradar la ferroportina (FPN), el único exportador celular de hierro [10]; que conduce a un aumento en los niveles de hierro intracelular mediante la inhibición de liberación de hierro [10]. Como un ejemplo, la sobreexpresión de HFE en los macrófagos y las líneas celulares de adenocarcinoma de colon inhibe el flujo de salida de hierro celular [11,12].
Por otra parte, las mutaciones genéticas en
HFE
conducen a la condición de sobrecarga de hierro, hemocromatosis hereditaria (HH). La forma más común de HH es causada por una única mutación de pares de bases en HFE que resulta en un cambio C282Y [6], que interrumpe la interacción entre HFE con B
2-microglobulina, y por lo tanto la orientación de HFE a la célula membrana. Los pacientes con HH tienen niveles inapropiadamente bajos de HAMP [8], poniendo de relieve la importancia de HFE para el HAMP. Low HAMP da como resultado la liberación de hierro a partir de macrófagos reticuloendoteliales, y permite la absorción continua de hierro en el intestino, lo que conduce a un exceso de hierro en la circulación [13]. En consecuencia, la transferrina se satura de circulación, lo que resulta en la acumulación de hierro en las células del parénquima de varios órganos finales, lo que resulta en la cirrosis, diabetes, cardiomiopatía, y el cáncer [13,14].
En el presente estudio, se presenta la sobreexpresión de HFE en HSNCC, que a su vez aumenta los niveles celulares de HAMP, y el hierro intracelular. Perturbando los niveles intracelulares de hierro, HFE puede promover la proliferación celular, la síntesis de ADN, la señalización de Wnt, y la formación de tumores
.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices del Comité de Cuidado de animales de la Universidad Health Network (Toronto, Canadá). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network (Número de protocolo: 342.19).
Las muestras de pacientes se obtuvieron de 26 pacientes HNSCC, con la aprobación del Comité de Ética de Investigación Institucional de la Universidad Health Network, (REB aprobación#07-0521-CE). Estas muestras incluían grupo de 12 pacientes en recaída y 14 no acertaron en recaída, con un tiempo medio de seguimiento de 3 años. Los datos clínicos de estos 26 pacientes se proporcionan en la Tabla S1. Escrito o el consentimiento oral no se podría obtener de los pacientes debido al período de nuestra cohorte (2003-2007). Por lo tanto, nuestro Consejo de Ética de Investigación Institucional de la Universidad Health Network renunció a la exigencia del consentimiento informado por escrito de los participantes de este estudio.
Líneas de Células y Reactivos
La línea celular HNSCC FaDu hipofaringe humana se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las líneas de células escamosas de laringe humanos, UTSCC-8 y UTSCC-42a (regalos de tipo R Grenman, Hospital de la Universidad de Turku, Turku, Finlandia) [15,16] se mantuvieron con DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (Wisent, Inc) y 100 mg /L de penicilina /estreptomicina. Las células epiteliales orales normales (RE) fueron adquiridos comercialmente y se cultivaron en el medio recomendado (Celprogen). Se mantuvieron todas las células en una incubadora a 37 ° con humidificado 5% de CO
2, autenticado en el Centro de Genómica Aplicada (Hospital para Niños Enfermos, Toronto, Canadá) usando el kit de AmpF /STR Identificador Amplificación por PCR (Applied Biosystems) , y de manera rutinaria la prueba de contaminación por micoplasmas usando el kit de detección de Mycoalert (Lonza Group Ltd).
Cuantificación de mRNA
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares utilizando el kit de purificación de ARN total (norgen), a continuación, a transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen Canadá) de acuerdo a las especificaciones. Se evaluaron ferroportina (FPN), la hepcidina (HAMP), la hemocromatosis (HFE), receptor de transferrina 1 (TFR1), la cadena pesada de ferritina (FTH1), la cadena ligera de ferritina (FTL) y ferritina mitocondrias (FtMt): los niveles de transcripción de los genes de hierro regulación de QRT-PCR, utilizando SYBR Green Mix Master (Applied Biosystems), y el sistema de detección ABI PRISM 7900 Secuencia (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA), como se describe anteriormente [17]. El primer secuencias utilizadas en este estudio están listados en la Tabla S2.
Los experimentos de transfección
Los efectos biológicos de HFE se investigaron mediante siRNAs dirigidos HFE. siHFE1 (Hs_HFE_5 FlexiTube siRNA) y siHFE2 (Hs_HFE_2 FlexiTube siRNA) fueron adquiridos de Qiagen. Un siRNA revueltos (Hs_Control_ss Flexitubo siRNA) sirvió como control negativo. Todas las transfecciones se realizaron en medio completo sin antibióticos utilizando Lipofectamine 2000 y 20 nM siRNA, tal como se describe anteriormente [18].
Reactivos
El ciclopirox olamina (CPX), mesilato de deferoxamina sal (DFO), férrico citrato de amonio (FAC) se obtuvieron de Sigma-Aldrich.
viabilidad y clonogénicos Ensayos
La viabilidad de las células transfectadas con HNSCC siHFE + radiación (RT), o células tratadas con CPX, se determinado utilizando CellTiter 96 no radiactivos Ensayo de proliferación celular (MTS) (Promega Biosciences), según las recomendaciones del fabricante. La capacidad de formación de colonias de las células transfectadas con HNSCC siHFE + RT, o células tratadas con CPX + RT se determinó usando el ensayo clonogénico como se describió anteriormente [19]. Brevemente, 48 horas después de la transfección con siHFE ó 72 horas después del tratamiento con CPX, las células se volvieron a FaDu sembraron en placas de 6 pocillos, y se incubaron a 37
0C bajo 5% de CO
2 durante 10-12 días. A continuación, las placas se lavaron y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en metanol al 50%, y después se contó el número de colonias. La fracción de células supervivientes se calculó por comparación de siHFE vs. siCTRL o CPX vs. CTRL.
Citometría de Flujo
La citometría de flujo se realizaron análisis en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences), análisis se realizaron utilizando el software FlowJo 7,5 (Árbol Star, San Carlos, CA, EE.UU.), como se describe anteriormente [17].
lábil hierro
La piscina de hierro lábil celular se midió utilizando calceína-acetoximetiléster (calceína-AM) según lo especificado por el fabricante (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron con 1 M de calceína-AM durante 15 minutos a 37 ° C. Las células se lavaron con PBS, a continuación, se mide por citometría de flujo, como se describe anteriormente [18].
incorporación de BrdU
incorporación BrdU se midió usando Exalpha BrdU Biológica colorimétrico ELISA Kit. Brevemente, las células transfectadas se incubaron con el reactivo de BrdU durante 24 horas, se fijaron, se tiñeron y analizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se describió anteriormente [18].
Experimentos ROS
especies de oxígeno reactivo
intracelulares (ROS) niveles se midió usando el no específica 5- (y 6-) clorometil-2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA; excitación 488 nm, emisión 525 nm) como se indica por el fabricante (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron con 5 uM de CM-H2DCFDA durante 30 minutos a 37 ° C. Las células se lavaron con PBS, a continuación, se mide por citometría de flujo [18].
Western Blot
FaDu células fueron transfectadas con siHFE o control, 48 horas después de la transfección, las células se lisaron en Tris 1M -HCl (pH 8), NaCl 5 M, y 1% NP40 más el cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics). La concentración de proteína se determinó como se describe anteriormente [17]. Las membranas se sondaron con anticuerpo anti-B-catenina monoclonal de conejo (Señalización Celular, 8814) o anticuerpo monoclonal anti-HFE (Abnova), seguido de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Abcam). GAPDH y expresión de la proteína α-tubulina se utilizaron como controles de carga. Western blots se cuantificaron con el Adobe Photoshop Pixel Cuantificación de plug-in (Richard Rosenman Publicidad & amp; Diseño).
Los experimentos de rescate de hierro
FaDu células fueron transfectadas con siHFE o control; 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 5μM de DFO, 5μM de FACS o un control negativo (DMSO). Cuarenta y ocho hora después de la transfección, las células FaDu se trataron con o sin 2 Gy de RT. Cinco días después de la transfección, se midió la viabilidad celular como se describió anteriormente.
tumor Formación Ensayo
FaDu células fueron transfectadas con siCTRL o siHFE. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogieron las células viables y se suspendieron 2.5x10
5 células en 100 l de medios de comunicación, y se inyectaron por vía intramuscular en el músculo gemelo izquierdo de 8 a 10 semanas de edad inmunodeficiencia combinada severa (SCID) BALB /c ratones. El crecimiento del tumor se monitorizó midiendo el diámetro del tumor además de la pierna (TLD) de dos a tres veces por semana; los ratones fueron sacrificados una vez que el TLD alcanzó 13 mm como punto final de la integridad personal.
ensayo de formación de tumor con CPX
Para el estudio CPX, dos semanas siguientes FaDu implantación de células tumorales como se ha descrito anteriormente, los ratones se trataron todos los días de lunes a viernes por sonda oral con CPX (25 mg /kg) en el control del agua o vehículo para un total de dos semanas. El crecimiento del tumor se monitorizó midiendo el diámetro del tumor además de la pierna (TLD) tres veces por semana; los ratones fueron sacrificados una vez que el TLD alcanzó 13 mm como un punto final humano.
La inmunohistoquímica se evaluó de Hierro Proteínas
La expresión de TFR1 y HFE en 26 secciones de biopsia CECC diagnósticos primarios utilizando la recuperación de antígenos microondas en combinación con el sistema de niveles-2 Ultra estreptavidina, y anti-HFE (Sigma HPA017276, 1/300 de dilución), o anti-TFR1 (Sigma HPA028598, 1/500 de dilución), como se describe anteriormente [17]. Brevemente, 4-Um secciones fueron deparaffin, se trata con un reactivo de la recuperación de antígeno, se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3% y se incubaron con anticuerpos anti-HFE o anti-TFR1 a 4 ° C durante la noche. El día siguiente, las secciones se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado y estreptavidina para completar la tinción. La tinción citoplasmática de anti-HFE o anti-TFR1 se puntuó de 0 a 3 en base a la intensidad de la tinción que se definió en consecuencia: 0 (sin tinción); 1 (aumento de la tinción leve en comparación con el epitelio normal correspondiente); 2 (aumento de la tinción moderada) y 3 (aumento de la tinción intensa).
Análisis estadístico
Todos los experimentos se han realizado al menos tres veces independientes, y los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). La comparación entre los dos grupos de tratamiento se analizó utilizando
t
test de Student. Se aplicaron dos pruebas parciales. Los resultados se consideraron significativas si el valor de p era menor que o igual a 0,05. Análisis y gráficos se realizaron utilizando GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc).
Resultados
HFE se sobreexpresa en líneas celulares HNSCC en comparación con la línea celular NOE
Para identificar diferencialmente expresado genes de hierro regulación en HNSCC, los niveles basales de expresión de ARNm en tres líneas celulares HNSCC se comparó con los de un NOE usando QRT-PCR. HFE se observó que el nivel de expresión más alto de & gt; sobreexpresión de 80 veces en HNSCCs contra la línea celular NOE (Figura 1A). Ferritina (FTH1) tuvo el segundo nivel más alto de la sobreexpresión en el FaDu y células UTSCC 42a, en comparación con el NOE. Es de destacar que TFR1 también parecía estar ligeramente sobreexpresa en HNSCC en comparación con la línea celular de NOE.
(A) QRT-PCR análisis de FPN, HAMP, HFE, TFR1, FTH1, FTL y expresión FtMt en Fadu 42a UTSCC y líneas celulares de cáncer UTSCC8 HNSCC, normalizado a esos genes en células NOE. células (B) FaDu fueron transfectadas con 20 nM de siCTRL o siHFE1. La viabilidad celular se evaluó en células FaDu por el ensayo de MTS de 24-72 horas después de la transfección. células (C) FaDu fueron transfectadas con 20 nM de siCTRL o siHFE1, entonces irradiado 48 horas después de la transfección (4 Gy). La viabilidad celular se evaluó por el ensayo de MTS 5 días después de la transfección. (D) la supervivencia clonogénico de las células FaDu se midió 10 a 12 días después de volver a la siembra de las células tratadas con siCTRL (20 nM) o siHFE1 (20 nM) durante 72 horas. (E) La viabilidad celular de las células de NOE se evaluó mediante el ensayo de MTS 24, 48 y 72 horas después de la transfección con 20 nM de siCTRL o siHFE1. células (F) NOE fueron transfectadas con 20 nM de siCTRL o siHFE1 o 2 ?, entonces irradiado 48 horas después de la transfección (4 Gy). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTS 5 días después de la transfección. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,005, p = ns (no significativo)
Efectos in vitro de HFE en la regulación
Con el fin de evaluar la importancia biológica de HFE sobreexpresión, desmontables experimentos se realizaron en células HNSCC utilizando un enfoque de siRNA. caída sostenida se logró en las células FaDu por hasta 72 horas utilizando dos siRNAs dirigidos independientes HFE, tanto en la transcripción y los niveles de proteína (Figuras S1A y S1B). células HNSCC demostraron una reducción significativa en la viabilidad celular con o sin radiación después de la transfección con siHFE comparación con siCTRL (Figura 1B-C, S1C-E). Además, la capacidad de las células para formar colonias HNSCC se redujo significativamente con o sin radiación después de la transfección con siHFE en comparación con el siCTRL (Figura 1D, S1F-G). Por el contrario, la viabilidad de las células NOE con o sin radiación se mantuvo sin cambios después de la transfección con siHFE en comparación con el siCTRL (Figura 1E-F, S1H). En general, estas observaciones demostraron que la disminución de HFE reduce preferentemente viabilidad y clonogenicidad en HNSCC comparación con las células de NOE. Para comprender mejor el mecanismo (s) responsable de la mediación de este fenotipo, se determinó la capacidad de HFE para regular hierro celular.
HFE regula HAMP y la piscina de hierro lábil en las células HNSCC
Para determinar si HFE estaba involucrado en la regulación de la hepcidina (HAMP), que mide los niveles de mRNA de HAMP por QRT-PCR después de la transfección con siHFE. células FaDu demostraron una disminución significativa en el nivel de transcripción de ARNm HAMP (& lt; 0,5 veces) para hasta 72 horas después de la transfección con siHFE en comparación con el siCTRL (Figura 2A). Además, la piscina de hierro lábil (LIP) también se redujo significativamente (por ~ 20%) después de caída HFE en las células en comparación con HNSCC siCTRL (Figura 2B). En contraste, no hubo cambios significativos en el labio en células NOE con siHFE transfección (Figura 2C). En general, estos experimentos demostraron la capacidad de HFE para alterar los niveles de hierro celulares preferentemente en HNSCC comparación con las células de NOE. Para determinar si los niveles intracelulares de hierro estaban implicados en la mediación de estos fenotipos siHFE, hemos realizado una serie de experimentos de rescate de hierro.
(A) QRT-PCR de los niveles de HAMP a las 24, 48 y 72 horas después de la transfección con 20 nM cada uno de siHFE1, o siHFE2, con relación a veces el cambio en las células tratadas con siCTRL. (B) Celular depósito de hierro lábil (LIP) en las células FaDu y UTSCC8 transfectadas con 20 nM de cada uno de siCTRL o siHFE, detectados por citometría de flujo con calceína-AM en 24-72 horas después de la transfección. (C) LIP celular de las células transfectadas con NOE 20 nM de siCTRL o siHFE, detectados por citometría de flujo con calceína-AM en 24-72 horas después de la transfección. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,005, p = ns (no significativo)
Hierro media la proliferación de las células de HFE
La viabilidad celular se midió en las células tratadas HNSCC con solo siHFE, siHFE con un quelante de hierro deferoxamina (DFO), o siHFE combinado con hierro soluble (FAC), con y sin RT (figuras 3A & amp; S2A-B). Estos estudios demostraron que la adición de DFO reduce aún más la viabilidad de las células después de HNSCC HFE knock-down, que fue completamente rescatado por la adición de FAC; RT no tuvo ningún efecto diferencial significativo en este proceso. Estos resultados confirmaron que el hierro era un mediador crítico de estos efectos. a continuación, se procedió a evaluar los efectos de siHFE sobre los procesos dependientes de hierro aguas abajo.
células (A) FaDu fueron transfectadas con 20 nM de cada uno de siCTRL o siHFE1, después se trató con 5 M de DFO, o 5 uM de FAC , 24 horas después de la transfección, seguido de ± RT (4 Gy), 48 horas después de la transfección. La viabilidad celular se evaluó por el ensayo de MTS 5 días después de la transfección. incorporación (B) BrdU se evaluó en células FaDu 5 días después de la transfección con 20 nM de cada uno de siCTRL o siHFE1, ± RT (4 Gy, 48 horas después de la transfección). células (C) FaDu fueron transfectadas con 20 nM de cada uno de siCTRL o siHFE, ± RT (4 Gy, 48 horas después de la transfección). Nivel total de ROS celular fue detectada por citometría de flujo con CM-H2DCFDA 24-72 horas después de la RT. (D) de Western Blot de B-catenina se midió en las células FaDu 24-72hr después de la transfección con siCTRL (20 nM) o siHFE1 (20 nM); imágenes (arriba), la cuantificación (abajo). * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005, *** P & lt; 0,0005, p = ns (no significativo) guía empresas
El ensayo de incorporación de BrdU se empleó para medir los cambios en la síntesis de ADN. células transfectadas con HNSCC siHFE demostraron una reducción significativa (60%) en la incorporación de BrdU en comparación con las células tratadas con siCTRL (Figura 3B, S2C). En contraste, no se observó ningún cambio significativo en la incorporación de BrdU para las células transfectadas con NOE siHFE comparación con siCTRL-tratamiento (Figura S2D). La citometría de flujo se utilizó para medir los cambios en los niveles de ROS después siHFE. Como era de esperar, las células FaDu demostraron una reducción significativa en los niveles de ROS después de la transfección con siHFE comparación con siCTRL, con y sin RT (Figuras 3C y S2E). Por último, la vía Wnt se examinó mediante el análisis de los cambios en la B-catenina. FaDu células transfectadas con siHFE demostraron una reducción significativa (~ 40%) en los niveles de B-catenina por hasta 72 horas las células tratadas con siCTRL comparación (Figura 3D).
siHFE reduce marginalmente la formación de tumores in vivo
a continuación, se evaluaron los efectos de HFE knock-down en un
in vivo
modelo de tumor en. Tumorigenicidad se midió
in vivo utilizando ratones SCID
inyecta por vía intramuscular con las células transfectadas con FaDu siHFE o siCTRL. Supresión de siHFE disminuyó marginalmente la formación de tumores en comparación con el control negativo, notable en puntos de tiempo posteriores (& gt; 27 días). (Figura S2F)
quelante del hierro reducido CPX la proliferación celular en líneas celulares HNSCC
Dados los desafíos en la aplicación terapéutica de una estrategia de siRNA, las células HNSCC se trataron con un quelante aprobado clínicamente-hierro, ciclopirox olamina (CPX), para determinar si el fenotipo siHFE podría ser recapitulado. El tratamiento de líneas celulares con HNSCC 5 uM de CPX resultó en una reducción significativa en la formación de colonias, con o sin RT, en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig 4A, S3A-B). Por el contrario, CPX tuvo un efecto mucho menor sobre la viabilidad de NOE comparación con las células FaDu (Figura 4B). Desafortunadamente, la administración de CPX durante 2 semanas a 25 mg /kg no pudo reducir el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto de FaDu (Figura S3C).
(A) se midió la supervivencia clonogénico de las células FaDu 10 a 12 días después de re-siembra de células que se trataron con etanol (5 uM) o CPX (5 uM) durante 72 horas, seguido por RT (0, 2, 4 o 6 Gy). (B) La viabilidad celular de las células FaDu y NOE se evaluó mediante el ensayo de MTS 72 horas después del tratamiento con CPX (2,5 uM, 5 uM o 10 uM). * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,005, *** P & lt; 0,0005, p = ns (no significativo)
proteínas de hierro son desregulados en muestras de tejidos HNSCC primaria
la inmunohistoquímica (IHC) se utilizó para confirmar visualmente la expresión de HFE y TFR1 en los tejidos HNSCC. se observó Intense inmuno-expresión tanto de HFE y TFR1 en el citoplasma de las células tumorales, pero no en el estroma adyacente o la infiltración de linfocitos (Figura 5A y 5B). En contraste, se observó una mínima inmuno-expresión de HFE y TFR1 en una laringe normal (Figura 5C-D), lo que confirma la mayor expresión de HFE y TFR1 en HNSCC vs. tejidos normales. Cuando la expresión de HFE o TFR1 se dicotomizaron entre alta (IHC ≥2)
vs
baja. (IHC & lt; 2) los niveles, los antiguos grupos experimentaron una menor supervivencia global en comparación con el último (Figura 5E-F ; p = 0,08); aunque la significación estadística no se alcanzó debido al tamaño pequeño de la muestra. Del mismo modo, la mediana de la puntuación de IHC para ambos HFE y TFR1 fue mayor en las muestras de los pacientes frente a no recayeron en recaída (Figura S4A-B), pero fue estadísticamente significativa sólo para la expresión HFE (p = 0,04).
(a) una imagen representativa de HFE expresión inmunohistoquímica de una biopsia CECC primaria; flechas que indican las células tumorales que exhiben señal citoplasmática. (B) Una imagen representativa de TFR1 expresión inmunohistoquímica de una biopsia CECC primaria; flechas que indican las células tumorales que presentan señal de membrana citoplasmática. (C) Una imagen representativa de HFE expresión inmunohistoquímica de una laringe normal. (D) Una imagen representativa de TFR1 expresión inmunohistoquímica de una laringe normal. parcela (E) de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes HNSCC en dicotomía basada en la alta (≥2)
vs
. baja (& lt; 2) las puntuaciones HFE inmunohistoquímica. trama (F) de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes HNSCC en dicotomía basada en la alta (≥2)
vs
. baja (& lt; 2). TFR1 puntuaciones de inmunohistoquímica
Discusión
Aquí, se presenta por primera vez que la sobreexpresión HFE parece ser un nuevo mecanismo responsable de la progresión de la enfermedad CECC. La sobreexpresión de HFE en HNSCC conduce a un aumento de la hepcidina, que a su vez promueve la acumulación de hierro intracelular, lo que resulta en un aumento de la síntesis de ADN, elevado los niveles de ROS, la señalización de Wnt, toda proliferación de células tumorales de conducción y clonogenicidad, con hierro como un mediador crítico en este proceso (figura 6). Una estrategia terapéutica potencial en este contexto es la utilización de un agente quelante del hierro olamina ciclopirox (CPX), que preferentemente se redujo la supervivencia clonogénico y la viabilidad en las células HNSCC, con efectos mínimos sobre los NOE. Por otra parte, HFE y la sobreexpresión TFR1 demostraron una tendencia hacia una peor evolución, que documentan colectivamente el papel crítico de la desregulación de hierro en la progresión de la CECC.
Esquema mostrando que la sobreexpresión HFE conduce B2M vinculante para el tráfico de membrana celular. HFE aumenta HAMP, ya sea directamente oa través de TFR2. HAMP continuación, sale de la célula, a través de un mecanismo desconocido, y a su vez se degrada FPN, que conduce a la acumulación de hierro. En conjunto, esto da como resultado en un aumento de la síntesis de ADN, elevado ROS y la señalización de Wnt, toda proliferación de células tumorales de conducción y clonogenicidad. Cajas en rojo indican los datos demostrados en este estudio.
La evidencia adicional de la importancia de estos hierro regulación de los genes son proporcionados por el examen de las bases de datos disponibles públicamente CECC (www.oncomine.org) [20 ], lo que confirma la sobreexpresión significativa tanto de HFE [21], y TFR1 [21-23] en HNSCC muestras de los pacientes, lo que demuestra que esto es de hecho una vía comúnmente dysregulated en esta enfermedad. Por otra parte, HFE también se sobreexpresa en otros tipos de cáncer, incluyendo el cerebro [24], y los carcinomas de células renales [25]. Para identificar mecanismo (s) potencial que conduce a su sobreexpresión, la base de datos HNSCC TCGA usando el software Portal Genomic cáncer CBio [26] fue interrogado mediante la comparación de los niveles de transcripción tumorales para el número de copias de ADN en 295 conjuntos de datos discretos de pacientes. La mayoría de estos fueron HNSCCs diploide para
HFE
; por lo tanto, alteración cromosómica no parece ser responsable de su sobreexpresión. Sin embargo, la amplificación de la
se observó TFR1
gen en el 18% de las muestras de HNSCC, que correspondían a elevados niveles de expresión de ARNm TFR1, indicando alteración genómica como un mecanismo para TFR1 sobreexpresión en CECC. Dada la compleja red de proteínas implicadas en la regulación del hierro [27], está claro que múltiples mecanismos son responsables de la desregulación de hierro en los cánceres humanos. Por ejemplo mTOR, que se activa con frecuencia en HNSCC [28] se ha vinculado recientemente a la estabilidad TFR1 y regulación de hierro [29], proporcionando otro mecanismo para la desregulación de hierro en HNSCC. Por lo tanto, hay probablemente varios mecanismos diferentes que representan el sobreexpresión HFE en HNSCC, que produce una perturbación de hierro
La hemocromatosis (HFE) es una glicoproteína transmembrana, expresado en términos generales en todo el cuerpo humano [30].; uno de sus principales funciones es la de regular la hepcidina (HAMP) [8], que a su vez, interioriza y ferroportina degradada (FPN) (véase la Figura 6) [10]. HAMP de alguna manera sale de la célula, a continuación, se une a FPN en la membrana plasmática, haciendo que la fosforilación de tirosina que conduce a la internalización de FPN. Una vez internalizado, es FPN-de fosforilada, a continuación, ubiquitylated y degrada a través de la vía lisosomal [31]. En última instancia, la degradación de FPN por HAMP conduce a la retención intracelular de hierro.
En condiciones fisiológicas, HAMP está presumiblemente secretada por el hígado en respuesta a cambios en los niveles de hierro en plasma. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que HAMP puede jugar un papel patológico en tumores malignos humanos; por ejemplo, bajo FPN y alta HAMP se han asociado con un mal pronóstico en cáncer de mama [32]. Los niveles elevados de ARNm HAMP correlacionados con baja expresión FPN en el carcinoma colorrectal [33]. El mecanismo exacto (s) por el cual el HAMP elevada contribuye a la carcinogénesis aún no se ha dilucidado; sin embargo, es concebible que HAMP podría ser secretada por las células cancerosas para degradar FPN, lo que aumenta los niveles intracelulares de hierro, según lo sugerido por nuestros datos. De hecho, los niveles séricos de HAMP elevada se han asociado con metástasis de carcinoma de células renales [34]; así, los niveles altos de HAMP urinarios se han observado en pacientes con mieloma múltiple [35], lo que sugiere tanto la secreción patológica de HAMP por las células cancerosas. Además, las células HeLa transfectadas transitoriamente con un plásmido que contiene FPN y se expusieron a HAMP, dieron como resultado la internalización de FPN [10], lo que demuestra que los tumores responden a HAMP de una manera similar como los hepatocitos o macrófagos
.
La red de regulación de hierro contiene más de 151 especies químicas y 107 reacciones pasos [27], por lo tanto, está estrechamente regulada. El fenómeno de las células de cáncer que requieren más hierro para mantener su alta síntesis borde ADN celular se observa en muchos tumores malignos diferentes.