Extracto
Antecedentes
La identificación de biomarcadores predictivos es esencial para el desarrollo exitoso de la terapia dirigida. Similar a la insulina factor de crecimiento 1 receptor (IGF1R) ha sido examinada como una diana terapéutica potencial para varios tipos de cáncer. Sin embargo, los ensayos clínicos recientes mostraron que el anticuerpo anti-IGF1R y la quimioterapia no son eficaces para tratar el cáncer de pulmón.
Metodología /Principales conclusiones
Con el fin de definir biomarcadores para predecir el éxito de la terapia dirigida IGF1R, nos evaluó el efecto anti-proliferación de figitumumab (CP-751,871), un anticuerpo anti-IGF1R humanizado, contra nueve gástrico y ocho líneas celulares de cáncer hepatocelular. De 17 líneas celulares de cáncer, figitumumab inhibe eficazmente el crecimiento de tres líneas celulares (SNU719, HepG2, y SNU368), disminución de los niveles de p-AKT y p-STAT3, e indujo G 1 detención de una manera dependiente de la dosis. Curiosamente, estas células mostraron co-sobreexpresión y la movilidad alterada del IGF1R y la insulina receptor (IR). Immunoprecipitaion (IP) y los ensayos de ELISA confirmaron la presencia de receptores heterodiméricos de IGF1 R /IR en las células figitumumab sensible. El tratamiento con figitumumab condujo a la disociación de los receptores heterodiméricos de IGF1-dependiente y se inhibe el crecimiento del tumor con disminución de los niveles de receptores heterodiméricos en un modelo de xenoinjerto de ratón. Seguidamente, encontramos que tanto IGF1R e IR eran ligada a N en las células glyosylated figitumumab sensible. En particular, la espectrometría de masas mostró que tenía IGF1R glicanos N-ligados al N913 en tres líneas celulares figitumumab sensible. Hemos observado que la ausencia de glicosilación ligada a N en N913 dio lugar a una falta de localización de IGF1R membranosa y la insensibilidad figitumumab.
Conclusión y significado
Los datos sugieren que el nivel de N-Linked glicosilada IGF1R /IR receptor heterodimérico está muy asociada con la sensibilidad a anticuerpo anti-IGF1R en células de cáncer
Visto:. Kim JG, Kang MJ, Yoon YK, Kim HP, Parque J, Song SH, et al. (2012) La heterodimerización de glucosilada similar a la insulina factor de crecimiento 1 y los receptores de insulina en las células cancerosas sensibles a los anticuerpos anti-IGF1R. PLoS ONE 7 (3): e33322. doi: 10.1371 /journal.pone.0033322
Editor: Frank T. Kolligs, Universidad de Munich, Alemania |
Recibido: 29 de octubre de 2011; Aceptó 7 de febrero de 2012; Publicado: 16 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado en parte por el cuidado de la salud de Corea 21 y R & amp tecnología; proyecto D, Ministerio de Salud, Bienestar & amp; La Familia, la República de Corea (A091081), y con el apoyo de la Subvención Nº R31-2008-000-10103-0 del programa de la Universidad de Clase Mundial del MEST y la NRF. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con sus ligandos secretados, IGF1 y IGF2, similar a la insulina factor de crecimiento 1 receptor (IGF1R) es altamente expresado en muchas células de cáncer humano, incluyendo gástrico (GC) y el carcinoma hepatocelular (HCC) [1] - [ ,,,0],5]. Como resultado, una variedad de estrategias que inhiben la vía de señalización IGF1R se han desarrollado en las últimas dos décadas [6]. Entre ellas, una estrategia terapéutica contra el cáncer usando anticuerpos totalmente humanizados se ha convertido en un importante foco de investigación [7], porque tiene un gran potencial para convertirse en agentes terapéuticos contra el cáncer exitosas que podrían inhibir eficazmente la proliferación de células de cáncer de baja toxicidad y proporcionar beneficios clínicos cuando se administra en combinación con quimioterapia [8] - [14]. Un anticuerpo monoclonal anti-IGF1R completamente humanizado (figitumumab) ha sido probado en ensayos clínicos de fase III; Sin embargo, la mejora estadísticamente significativas se demostró mediante la administración de figitumumab junto con la quimioterapia estándar para pacientes con cáncer avanzado de pulmón no microcítico (CPNM) [15].
Muchos estudios han demostrado que la isoforma del receptor de la insulina ( IR) se sobreexpresa de forma anormal en varios tipos de cáncer y puede promover el crecimiento del tumor [16] - [19]. Este acciones IR una alta homología de secuencia con IGF1R, en particular en el dominio quinasa intracelular [7], [20]. IR pro-receptores pueden formar receptores heterodiméricos (horas) con IGF1R pro-receptores después de la traducción, antes de la escisión para generar dos subunidades alfa extracelulares y dos subunidades beta que contienen extracelular, transmembrana y dominios de tirosina quinasa [21]. Por lo tanto, cuando las células IGF1R co-expresa e IR, los pro-receptores pueden heterodimerizarse para crear IGF1 R /IR CR [22] - [24]. Estos HRs también pueden ser sobreexpresados en diversas células tumorales y las muestras como resultado tanto de IGF1R y IR sobreexpresión [2], [25], [26]. En consecuencia, la abundancia relativa de IRs afecta a la activación del sistema IGF a través de los CRI, que responde tanto a la insulina y IGF [27] - [29]. En las células cancerosas con altos niveles de IGF1 R /IR CR, IGF1 y IGF2 activan varias vías de señalización corriente abajo a través de receptores heterodiméricos en lugar de a través IGF1Rs homodimeric [30].
Una serie de estudios han tratado de identificar biomarcadores predictivos con preclínica y la relevancia clínica [15], [31], [32]. La identificación de biomarcadores predictivos para el seguimiento de la eficacia de la terapia dirigida IGF1R para los pacientes adecuados, sin embargo, todavía se necesita. En el presente estudio, hemos demostrado que figitumumab posee una alta afinidad por los receptores heterodiméricos IGF1R /IR, así como los receptores de homodímero de IGF1 e inhibe el eje de señalización en el cáncer gástrico y células de carcinoma hepatocelular IGF /IGF1R. Además, nuestros datos muestran que los receptores heterodiméricos IGF1R unido a la membrana funcional /IR juegan un papel importante en la señalización IGF1 [26], [33] y por lo tanto puede servir como biomarcadores para predecir la sensibilidad a anticuerpo anti-IGF1R.
resultados
efecto anti-proliferativa de figitumumab
Como primer paso, se evaluó el efecto antiproliferativo de figitumumab, un anticuerpo monoclonal que previene la unión a ligandos de IGF1R [12], en 17 líneas celulares de cáncer (Figura 1A). Algunas células que se consideran sensibles a figitumumab, como SNU719, HepG2, y SNU368, mostraron una disminución dependiente de la dosis de la viabilidad celular; IC
30 valor de figitumumab (inhibiciones de crecimiento de ~ 30%) para cada línea celular fueron de 0,063 mg /ml, 0,062 g /ml, y 0,047 g /ml, respectivamente (Tabla 1).
) Análisis del efecto anti-proliferativo de figitumumab en las células de carcinoma gástrico y hepatocelular. Dos grupos de células cancerosas, incluyendo nueve líneas celulares de cáncer gástrico y ocho líneas celulares de carcinoma hepatocelular, se trataron con concentraciones crecientes de figitumumab (0, 0,1, 1, y 10 mg /ml) durante 120 h para inhibir el crecimiento de las células de control en un 30%. La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo MTT. Seis son los mismos pozos se utilizaron para cada análisis, y se llevaron a cabo al menos tres experimentos independientes. Los datos de los pocillos replicados se presentan como la media de las células restantes. Bares = ± SE. B) Efecto de figitumumab en la vía de señalización de IGF1R. análisis de inmunotransferencia se realizó para observar el efecto dosis-respuesta de figitumumab (0,1-10 mg /ml) en la señalización de IGF1R. células SNU638, SNU719, SNU354, HepG2, y SNU368 se expusieron a concentraciones crecientes de figitumumab para 72 h. Se analizaron los niveles de las proteínas asociadas con la vía de IGF1R y sus formas activadas. se muestran las diferencias con respecto al control. En cada panel, se muestran manchas representativos de tres experimentos independientes. C) Efecto de figitumumab en la distribución del ciclo celular. células figitumumab sensible (SNU719, HepG2, y SNU368) se trataron con concentraciones crecientes de la droga [0 mg /ml (barra sólida negro), 0,1 mg /ml (barra de sólido de color gris), 1 mg /ml (barra blanca), y 10 mg /ml (gris oscuro tramado bar)] para 48 h y luego se tiñeron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de células en el G
0 /G 1, S y G
se muestran
2 /M fases. Las columnas representan la media de tres experimentos independientes; Bares = ± SE. *
P-
valores & lt; 0,05, **
P-
valores & lt; 0,01. D) Efecto de la figitumumab sobre el crecimiento tumoral en ratones con xenoinjertos de HepG2. células HepG2 (1 × 10
7) se inyectaron en el flanco derecho de ratones desnudos (n = 5). El tratamiento con figitumumab (125 mg /ml [6,3 mg /kg de peso corporal], una vez por semana durante 3 semanas) se inició una vez que el volumen del tumor había llegado a 200 mm
3. No se observó ninguna pérdida significativa de peso corporal durante el curso del estudio. Los tumores se midieron con calibradores en intervalos regulares. Los círculos sólidos = tratamiento con vehículo de control solo (control), los triángulos abiertos = tratamiento con figitumumab. Las diferencias entre los dos grupos (tamaños de los tumores de los ratones de control y los de los ratones tratados con figitumumab) se compararon de día 17 hasta el final del periodo de tratamiento (día 21) utilizando
t
prueba de Student de dos caras . *
P-
valores & lt; 0,05; **
P-
valores. & Lt; 0,01 frente al control
figitumumab altera la señalización principalmente a través de Akt y STAT3 vías IGF1R e induce G
1 detención
Para examinar el mecanismo a través del cual figitumumab inhibe la proliferación celular, se examinó si había alguna diferencia en la señalización aguas abajo entre las células sensibles y resistentes en presencia de suero después del tratamiento a largo plazo con dosis seriadas de figitumumab (Figura 1B). En este experimento, sólo las células figitumumab sensibles mostraron una disminución marcada de los niveles de p-AKT y p-STAT3 de una manera dependiente de la dosis; sin embargo, no hubo cambios en los niveles de p-ERK. También se observó que figitumumab disminuyó el nivel de IGF1R celular total en SNU719 células, lo que sugiere que la baja regulación de este receptor podría representar un proceso de degradación mediada por anticuerpos [8]. Hemos investigado si figitumumab inducida baja regulación de la expresión de infrarrojos, así como los niveles de IGF1R en otras células en varios puntos de tiempo diferentes. Curiosamente, figitumumab causó la disminución rápida de los niveles totales de IGF1R después de 3 horas en SNU668 y SNU739 células (células de IR-negativo) pero no lo hizo significativamente baja regular la expresión ya sea IR o IGF1R en las otras líneas celulares (Figura S1). Por el contrario, figitumumab no regular por disminución pAKT, gratificación o pSTAT3 en las células resistentes.
Para determinar la dependencia de la señal de IGF1R en células sensibles, el próximo realizado experimentos con siRNA para silenciar la expresión de IGF1R (Figura S2A). Los resultados indicaron que IGF1R siRNAs específicos de secuencia inducidos profunda IGF1R baja regulación sin influir en la expresión de IR y mostraron una clara correlación entre la capacidad de siRNA y figitumumab para inhibir la fosforilación de señales específicas de aguas abajo, tales como p-AKT y p- STAT3, sólo en las células sensibles. También se investigaron los efectos de la caída de IGF1R en la proliferación de células sensibles y confirmamos que silenciar la expresión de IGF1R resultó en un efecto antiproliferativo sobre las células sensibles (Figura S2B). En resumen, estos resultados mostraron que los efectos antiproliferativos de figitumumab están mediados específicamente a través de la baja regulación de Akt y STAT3 vías de señalización en lugar de a través de la vía de señalización de ERK en células sensibles que tienen una fuerte dependencia de señalización IGF1R.
a fin de analizar los mecanismos mediante los cuales figitumumab inhibe la proliferación y supervivencia de las células cancerosas, se realizó un análisis de citometría de flujo (Figura 1C). Figitumumab indujo un aumento dependiente de la dosis similar en el porcentaje de células SNU719, HepG2, y SNU368 en la fase G1. Sin embargo, no hubo aumento de la tasa de apoptosis (por ciento de células sub-G1; datos no mostrados). Este análisis mostró que figitumumab disminución de la viabilidad celular mediante la inhibición del ciclo celular sin inducir apoptosis.
La actividad antitumoral de figitumumab en un modelo de tumor de xenoinjerto
A continuación trató de una prueba más de la actividad figitumumab
in vivo fotos: por el uso de HepG2 establecer xenoinjertos debido a su sensibilidad a figitumumab
in vitro
. Para evaluar el efecto de figitumumab sobre el crecimiento tumoral
in vivo
, tumores de xenoinjertos fueron cultivados en ratones desnudos atímicos. Como se muestra como se muestra en la Figura 1D, que se repite la administración semanal de dosis única de figitumumab (6,3 mg /kg de peso corporal) a los animales portadores de tumores HepG2 como resultado la inhibición del crecimiento tumoral sustancial para 21 d de la dosificación figitumumab y el crecimiento del tumor inhibió significativamente en el día 17 ( P & lt; 0,01). Además, hemos probado el efecto de figitumumab de moléculas relacionadas con IGF1R-1 después del tratamiento d figitumumab. Figitumumab reduce eficazmente los niveles de IGF1 R fosforilada y IRS1 (Figura S3 A). En conjunto, estos datos mostraron que el tratamiento con una dosis única de figitumumab inhibe eficazmente el crecimiento de tumores mediante la inhibición de la activación de IGF1R y IRS1.
IGF1R sobreexpresa y forma IGF1R IR /IR receptores heterodiméricos en células figitumumab sensible
para identificar un objetivo para predecir la sensibilidad a figitumumab, expresión de IGF1R proteínas relacionadas y moléculas de señalización corriente abajo se analizaron en paralelo por Western Blot. Curiosamente, encontramos que las células cancerosas figitumumab sensible a todo sobreexpresa IGF1R; basales niveles de expresión de IR fueron también mucho más alta en comparación con la de otras células resistentes (Figura 2A). Sobre la base de un informe reciente [31], esperábamos que sería figitumumab inhibir específicamente el crecimiento de células que sobreexpresan IGF1R o su forma fosforilada, pero no los que sobreexpresan IR debido figitumumab no se une a los RI [12]. Sin embargo, los niveles de proteína de IR eran más sensibles a figitumumab que cualquier otra proteína. Como se muestra en la Figura 1A, el efecto anti-proliferativo de figitumumab fue más débil en células que sobreexpresan únicamente IGF1R, como SNU668 y SNU739, que en las células que sobreexpresan tanto IGF1R y IR. Este hallazgo sugiere que diferentes
in vitro
sensibilidad de las células a figitumumab se asocia con ambos niveles de IGF1R e IR que a su vez pueden afectar el nivel de IGF1R receptores heterodiméricos /IR [2].
) El análisis por inmunotransferencia de IGF1Rβ total y los niveles de proteína IRβ. Dos tipos de células de carcinoma gástrico y hepatocelular se cosecharon 24 h después de la siembra y inmunotransferencia con anti-IGF1Rβ anticuerpo, anticuerpo anti-IRβ, y tubulina de anticuerpos anti-α se realizó. Para ambos tipos de células, se muestran las transferencias representativos de tres experimentos independientes. B) Análisis de la presencia de IGF1R /receptor heterodimérico IR (horas) usando inmunoprecipitación. proteínas celulares totales (1 mg) a partir de células se utilizaron para la inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-IGF1R, separados por SDS-PAGE a voltaje constante (80 V), y transferencia Western con un anticuerpo anti-IRβ. A continuación, la transferencia se desnudó y se volvió a sondear con anticuerpo anti-IGF1Rβ C) Análisis cuantitativo de IGF1R homodímero, homodímero de IR, y IGF1R /IR niveles heterodímero utilizando un ELISA. Tampón de lisis (100 l) que contiene la misma cantidad de proteínas (50 mg /pocillo) a partir de 11 líneas celulares de cáncer, incluyendo células MCF7 (control positivo) se sembraron en pocillos recubiertos con anticuerpos anti-IGF1R y se detectó con un anticuerpo de detección anti-IR. pozos Anti-IR revestidas de anticuerpo, estándares de proteína de IR, y el anticuerpo de detección anti-IR se usaron como estándares en el receptor heterodimérico ELISA. Se midió la absorbancia a 450 nm. Los valores se expresan como la media ± SEM nanogramos de proteína del receptor por cada 50 g de proteína total. Las líneas celulares se enumeran según su sensibilidad a figitumumab. Bares = ± SE. D) Efecto de figitumumab en IGF1R mediada IGF1- /IR hrs. Las células se privaron de suero durante 24 h y después se trató con figitumumab, IGF1, o no se tratan. células SNU719 se incubaron con figitumumab (10 mg /ml) durante 1 h a 37 ° C seguido de la estimulación con IGF1 (100 ng /ml) durante 30 min. La inmunoprecipitación se realizó con un anticuerpo anti-IGF1R y transferencia Western. Entrada = lisado celular total y sin IP.
Dado que se conoce comúnmente que IGF1R e IR pueden formar heterodímeros cuando ambos son co-sobreexpresa debido a sus estructuras altamente homólogas [2], hemos realizado experimentos de inmunoprecipitación de determinar si IGF1R interactúa con IR para formar heterodímero en células figitumumab sensible. Como se muestra en la Figura 2B, las células que sobreexpresan tanto IGF1R y IR, tales como SNU719, HepG2, y SNU368, contenían IGF1R /heterodímeros IR. La línea celular SNU601, que mostró modesta sensibilidad a figitumumab, también contenía IGF1R heterodímeros /IR. Para determinar si figitumumab reconoce preferentemente /receptores heterodiméricos IR IGF1R en células sensibles [12], hemos realizado experimentos de inmunoprecipitación utilizando figitumumab como el anticuerpo usado para la inmunoprecipitación. Se detectaron niveles significativos de ambos IGF1R y IR en las células figitumumab sensible en inmunoprecipitados figitumumab, lo que sugiere que este anticuerpo tiene una capacidad superior para reconocer tanto el homodímero de IGF1R y heterodímero IGF1R /IR predominantemente en las células sensibles (Figura S4).
IGF1R también medido cuantitativamente, IR y IGF1R niveles /IR de recursos humanos utilizando ELISA con anticuerpos específicos que reconocen específicamente IGF1R o IR y no reaccionan de forma cruzada entre sí. Se compararon 11 líneas celulares de cáncer, incluyendo MCF7 (Figura S5) que ha sido evaluado en un estudio anterior [2]. Los niveles de IR variaron desde 0,08 hasta 2,3 ng /50 g de proteínas celulares totales, y los niveles de IGF1R variaron desde 0,50 hasta 10,6 ng /50 g de proteínas celulares totales (Tabla 2). Estos resultados indican que la expresión de IGF1R y IR fueron similares, y la mayoría de los resultados del ELISA correlacionaron estrechamente con los resultados de transferencia Western (Figura 2A). El nivel celular de IGF1 R /IR CR varió 0,39 a 0,99 ng /g 50 proteínas celulares totales. El nivel de los CR era mayor en las células sensibles que las células resistentes (Figura 2C), lo que sugiere que el nivel de expresión de la /receptor heterodimérico IR IGF1R correlacionó significativamente con la sensibilidad a los fármacos.
Formación de IGF1 dependiente de ligando IGF1R /heterodímero IR es inhibida por el anticuerpo anti-IGF1R
para definir aún más el mecanismo de la actividad antiproliferativa figitumumab relacionada con la expresión heterodímero de IGF1 R /IR, que también examinó los cambios en la expresión del receptor heterodimérico ligando-dependiente (Figura 2D ). Se encontró que los heterodímeros obligados a ligandos de IGF1, pero esta formación dependiente de ligando IGF1 fue suprimida por figitumumab en células sensibles. En SNU368, parecía que figitumumab suprime no sólo ligandos de IGF1 que se unen a los HRs, sino también la expresión de IGF1R /IR horas en ausencia de ligando IGF1. los niveles de receptor heterodimérico en células SNU638 y SNU354, sin embargo, eran relativamente estables en presencia de figitumumab. Además, no hubo formación de heterodímeros dependiente de insulina detectable o disociación debido a figitumumab. La fosforilación en respuesta a 100 nM de insulina también no se redujo por figitumumab (Figura S6). Tomados en conjunto, los resultados de este experimento demostraron que los heterodímeros de IGF1 R /IR respondieron bien a IGF1, y el bloqueo de IGF1 por figitumumab inducida por la baja regulación de IGF1R IGF1 ligando dependiente de la formación de heterodímeros /IR en las líneas de células sensibles al fármaco.
sobreexpresión selectiva de IR induce la formación de receptor heterodímero y aumenta el efecto antiproliferativo de figitumumab
para evaluar si el efecto de figitumumab se restringió a SNU719, HepG2, células o SNU368, hemos realizado estudios en células con bajos niveles de expresión de IR, incluyendo SNU739 y SNU886 células, transfectadas con pcDNA3.1-IR que indujo una alta expresión de IR. Como se muestra en la figura 3A, los niveles de expresión de IR en las células transfectadas aumentado notablemente en comparación con las células transfectadas con el pcDNA3.1 (-) vector vacío. Por otra parte, los CRI IGF1 R /IR también se formaron en las células transfectadas-IR. Para examinar si la formación de recursos humanos de IGF1 R /IR debido al aumento de los niveles de proteína de IR podría mejorar la sensibilidad a los fármacos, se realizaron ensayos de MTT. El resultado mostró que las células transfectadas con IR eran más sensibles al efecto antiproliferativo aumento de figitumumab (Figura 3B). Estos resultados indican que los niveles elevados de células cancerosas permitido IR y IGF1R para formar IGF1 R /IR horas y aumentaron su respuesta anti-proliferativa a figitumumab.
A) Efecto de la transfección de infrarrojos de IGF1R niveles /IR de recursos humanos en IR- líneas de células negativas. Las células fueron transfectadas con el pcDNA3.1 (-) vector de expresión que contiene de tipo salvaje IR cDNA. Una cantidad igual de lisados de células transfectadas con el vector vacío o pcDNA3.1 (-) que contiene cDNA IR se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-IGF1R seguido por análisis de Western blot de IRβ y IGF1Rβ. B) Efecto de IR-transfección sobre la sensibilidad figitumumab. Las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos, se trató con figitumumab para 5 d, y se sometieron a ensayos de MTT. símbolo sólido triángulo con líneas discontinuas = vector vacío (pcDNA3.1-), símbolos círculo sólido con líneas = pcDNA3.1 (-) IR. Barra = ± SE. Los valores medios se derivaron de seis réplicas. Los experimentos se repitieron por triplicado.
N-glicosilación de IGF1 R e IR en las células sensibles
Además de la asociación entre los CRI y sensibilidad a los fármacos, también se encontró que la glicosilación ligada a N (NLG) es un factor importante adicional que influye en la respuesta a figitumumab. Secante para la subunidad anti-IGF1Rβ reveló dos isoformas de alrededor de 95 y 105 kDa en la mayoría de las células; sin embargo, las células sensibles mostraron una débil banda de 105 kDa y una más fuertes bandas a 115 kDa (Figura 4A). En resumen, IGF1Rβ en células figitumumab sensible migró más lentamente en SDS-PAGE de que en las células resistentes. Curiosamente, secante para la subunidad anti-IRβ produce el mismo patrón de bandas como la de IGF1Rβ. Con el fin de determinar si las diferencias en masa molecular entre las células sensibles y resistentes se deben a diferencias en la N-glicosilación, que IGF1R enzimáticamente desglicosilada y IR con PNGage F, que elimina todos los tipos de glicanos N-ligados. El tratamiento con PNGage F aumentó la movilidad electroforética de tanto IGF1Rβ y IRβ en todas las células figitumumab sensible (Figura 4B), indicando que IGF1Rβ y IRβ en las células sensibles eran en su mayoría N-ligado glicosilada.
A) El análisis por inmunotransferencia de diferente patrón de migración IGF1Rβ en SDS-PAGE. los patrones de movilidad electroforética de IGF1Rβ se analizaron en paralelo por bloting occidental. Los experimentos se repitieron al menos tres veces con resultados similares. B) Análisis de IRβ y IGF1Rβ N-glicosilada en líneas celulares sensibles por desglicosilación enzimática con PNGage F. Todas las muestras se incubaron a 37 ° C durante 12 h con las proteínas PNGage F. IGF1Rβ y IRβ se analizaron en paralelo por transferencia Western. Las transferencias que se muestran son representativos de tres experimentos independientes.
Un sitio NLG específica de IGF1R en las células sensibles a figitumumab
Se determinó a continuación si la variación de NLG de la subunidad podría ser IGF1Rβ otro biomarcador candidato a la sensibilidad figitumumab. Para identificar un sitio específico dentro de la subunidad NLG IGF1Rβ, se utilizó una combinación de análisis de espectrometría de masas (MS) enzimática de-glicosilación y. Después de evaluar las muestras de células sensibles y resistentes tanto, hemos identificado glicosilación específica de sitio en Asn900 y Asn913 entre los cinco sitios putativos NLG (Asn747, 756, 764, 900 y 913) de la subunidad IGF1Rβ. Otros sitios NLG (Asn747, 756 y 764) eran difíciles de identificar debido a la presencia de múltiples sitios NLG y la falta de sitios de escisión proteolítica dentro de la región de secuencia de péptido (Figura 5A). Por lo tanto, nos centramos en los residuos Asn900 y Asn913 para evaluar las diferencias NLG específica de sitio entre las células figitumumab-sensibles y resistentes. Un completo patrones de péptido fragmentación del péptido tríptico (
897NPGNYTAR
904) contenidos péptido anteriormente N-glicosilada en la Asn900 (una adición de 1 Da, N + 1) se observó tanto de células sensibles y de resistencia, que abarcado el residuo Asn del sitio de glicosilación en Asn900 (Figura S7). Estos resultados demostraron que Asn900 se glicosilada tanto en las células sensibles a fármacos y resistentes. Sin embargo, los péptidos con NLG en Asn913 se identificaron sólo en las células sensibles, pero no resistentes, lo que sugiere que este sitio específico NLG no estaba glicosilada en las células resistentes.
A) Identificación de la ocupación del sitio NLG de subunidades IGF1Rβ . subunidades IGF1Rβ que contienen sitios de glicosilación unidos a N (Asn747, Asn756, Asn764, Asn900 y Asn913) se aislaron a partir de tanto células (SNU638 y SNU354) fármaco sensible (SNU719, HepG2 y SNU368) y la resistencia y se identifican por MS en tándem por un aumento de 1.0 Da de la masa correspondiente de Asn como resultado de la conversión de N-ligada Asn glicosilada a Asp. Todo el tren de morro en Asn900 tanto en las células sensibles y de resistencia fueron determinados para ser ocupado con N-glicosilación (rectángulo relleno). NLG en Asn913 de las líneas celulares sensibles (HepG2, SNU719 y SNU368) se determinaron para ser ocupado con N-glicosilación (rectángulo relleno), mientras que N-glycosites en Asn913 de las líneas celulares de resistencia (SNU638 y SNU354) se encontró que eran desocupada con N-glicosilación. (Rectángulo abierto). B) Efecto del sitio de mutación N913Q en las pautas de movilidad electroforética de IGF1Rβ. células Huh7 (una línea celular de IGF1R-negativo) se transfectaron con el pcDNA3.1 vacío (-) vector de expresión (Control), pcDNA3.1 (-) que contiene de tipo salvaje IGF1R cDNA (IGF1R WT) o pcDNA3.1 (- ) con IGF1R cDNA tipo de mutación (IGF1R N913Q). a continuación, una cantidad igual del lisado celular de las células transfectadas se sometió a análisis de transferencia Western para IGF1Rβ. C) Efecto de N913Q sitio de la mutación en la formación de receptores heterodiméricos IR IGF1R /. a continuación, una cantidad igual del lisado celular de células transfectadas se sometió a inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo anti-IGF1R seguido por análisis de transferencia Western para IRβ y IGF1Rβ. Entrada = lisado celular total y sin IP. D) Efecto de N913Q sitio de la mutación en la localización de IGF1R. Un ensayo de inmunofluorescencia se llevó a cabo para observar la localización de IGF1R. reactividad IGF1R se visualizó por microscopía confocal de barrido láser (barra de escala: 30 micras). se muestran imágenes representativas. Verde: IGF1R, azul: núcleos. E) Efecto de N913Q sitio de la mutación en la sensibilidad figitumumab. células Huh7 transfectadas con pcDNA3.1 vacío - vector, vector que contiene de tipo salvaje IGF1R cDNA, o vector que contiene IGF1R (N913Q) el tipo de mutación de ADNc se sembraron en placas de 96 pocillos y se trata con concentraciones crecientes de figitumumab durante 120 h (izquierda () ). porcentajes de viabilidad celular con 1 mg /ml figitumumab (derecha). Seis replicar pozos fueron incluidos en cada análisis, y se llevaron a cabo al menos tres experimentos independientes. Los datos de los pocillos replicados se presentan como la media de las células restantes. *
P-
valores & lt; 0,05; **
P-
valores. & Lt; 0,01
A fin de verificar el sitio consenso de florines (N913) y su importancia funcional, un mutante IGF1R dirigida al sitio se construyó. Asn913 se sustituye por un residuo de glutamina para producir un N913Q (Asn913 ln) mutante. Para evaluar las consecuencias funcionales de esta mutación, de tipo salvaje IGF1R y la construcción de mutantes se expresaron transitoriamente en células Huh7. Como se muestra en la Figura 5B, los niveles de expresión de tipo salvaje y mutante IGF1R en las células transfectadas se incrementaron notablemente en comparación con las células transfectadas con el pcDNA3.1 vacío - vector (). Sin embargo, la mutación N913Q apareció como una banda de 105 kDa que migra más rápido que la proteína de tipo salvaje que produce un patrón de migración similar de la proteína en electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) en SNU719 células. Estas observaciones confirmaron que la banda de ~115 kDa en células sensibles correspondió a IGF1R que era NLG en el N913.
Curiosamente, parece que la eliminación de azúcares unidos a N de N913 del IGF1R no tuvo ningún efecto aparente sobre las formaciones de HR IGF1 R /IR. Más bien, esta mutación sólo afectó sobre el estado NLG del receptor ya que los niveles de recursos humanos se incrementaron notablemente en las células de IGF1R transfectadas con mutantes y el receptor mutante mostraron una tasa de migración aumento en SDS-PAGE (Figura 5C). Este resultado sugiere que la eliminación del azúcar unida a N del sitio N913 alterado el perfil de bandas de SDS-PAGE de IGF1Rβ pero no tuvo efecto en la heterodimerización de IGF1R y IR.
NLG regula localización IGF1R a la membrana plasmática y determina la sensibilidad a figitimumab
a continuación realizó un ensayo de inmunofluorescencia para determinar si la mutación del sitio consenso N913 impidió la superficie celular expresión de IGF1R. Las células que expresan de tipo salvaje IGF1R tenían una gran cantidad de IGF1R unida a la membrana plasmática, mientras que la forma mutante se mantuvo principalmente dentro de las células con relativamente poca o ninguna localización en la membrana plasmática (Figura 5D). Para evaluar la funcionalidad de NLG-deficientes-IGF1Rs en comparación con la forma de tipo salvaje, se realizaron ensayos de MTT. Los resultados mostraron que el efecto anti-proliferativo de figitumumab se incrementó mediante la sobreexpresión de tipo salvaje IGF1R, mientras que las células transfectadas con el mutante IGF1R no mostraron ningún cambio en la sensibilidad al fármaco (Figura 5E). Estos resultados sugieren que la falta de azúcares ligados a N en N913 en el IGF1R causada localización predominantemente citoplasmática del receptor mientras que de tipo salvaje IGF1R apareció para localizar a la membrana de plasma con una mayor sensibilidad a figitumumab. Por lo tanto, en NLG N913 parece ser esencial para IGF1R y resultados funcional unido a la membrana en un aumento de la respuesta al anticuerpo anti-IGF1R en células de cáncer.
Discusión
figitumumab (CP-751 871) tiene sido probado de forma activa en pacientes con mieloma múltiple, pero es necesaria la identificación de biomarcadores y mecanismos para predecir la respuesta al tratamiento y por lo tanto ayudar con la selección de pacientes para maximizar los beneficios clínicos. Los datos de este estudio sugieren que el nivel de HRs IGF1R /IR puede ser un posible biomarcador de diagnóstico para predecir la sensibilidad a anticuerpo anti-IGF1R, en particular en GC y células de HCC. Estudios previos han informado de que el nivel de IGF1R en sí puede tener valor predictivo en cáncer de mama, de pulmón y colorrectal [31], [34]. En nuestro estudio, sin embargo, ni expresión de IGF1R solo ni los niveles de otras moléculas IGF1R asociados, incluyendo IRS1, podría ser utilizado para predecir suficientemente sensibilidad figitumumab (datos no mostrados). En lugar de ello, se encontró que un factor importante para la respuesta a figitumumab parecía ser altos niveles de expresión de IR porque sólo las células sensibles a la droga mostraron altos niveles de IR, así como IGF1R (Figura 2A). Considerando que varios estudios anteriores mostraron que la sobreexpresión tanto de IGF1R y IR puede conducir a un aumento de la formación de IGF1R /IR horas y ampliar el grupo de sitios de unión de IGF1 en diversos tumores malignos humanos [2], [27], [35 [3], no.