Extracto
células T reguladoras (Treg) mediada por la inmunosupresión representa uno de los mecanismos de evasión inmune del tumor es crucial y el principal obstáculo para el éxito de la inmunoterapia tumoral. La hipoxia, una característica común de los tumores sólidos, se ha asociado con la inmunosupresión potenciada, disminución de la respuesta terapéutica, la progresión maligna y la invasión local. Por desgracia, el vínculo entre la hipoxia y la tolerancia inmune mediada por Treg en el cáncer gástrico sigue siendo poco conocida. En nuestro estudio, las células T reguladoras y factor inducible de hipoxia-1α se encontraron una correlación positiva entre sí y se incrementaron con la progresión del tumor. A
in vitro
estudio posterior indicó que los sobrenadantes derivados de células de cáncer gástrico bajo condiciones hipóxicas, podrían inducir la expresión de Foxp3 a través de TGF-β1. Estos resultados confirman el papel crucial de las células T reguladoras como diana terapéutica en el tratamiento del cáncer gástrico y siempre pensamientos útiles para el diseño de la inmunoterapia para el cáncer gástrico en el futuro
Visto:. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) intratumoral La hipoxia promueve la tolerancia inmune induciendo Reguladora de las células T a través de TGF-β1 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10.1371 /journal.pone.0063777
Editor: Nupur Gangopadhyay, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Enero, 2013; Aceptado: 6 Abril 2013; Publicado: 27 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Deng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghai (10410709400, 10411950100), la Fundación Nacional de Ciencia natural de China, (81000968, 81101540, 81101637 y 81172273) y el Nacional de clínicas de clave de asunto especial de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico representa una de las causas más comunes de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de los avances significativos en los enfoques diagnósticos y terapéuticos durante las últimas décadas, el pronóstico del cáncer gástrico sigue siendo pésimo debido a su alta recurrencia y metástasis [2]. Inmunocitos hace tiempo se reconoce como un factor de promoción de crecimiento tumoral en el microentorno del tumor [3], sin embargo, la base molecular subyacente permanece en gran parte enigmática. Una mejor comprensión de los mecanismos en el cáncer gástrico será beneficioso para desarrollar esquemas terapéuticos eficaces.
intratumoral hipoxia es una característica común de los tumores sólidos, lo que podría influir en la progresión de los tumores mediante la activación de las vías bioquímicas y celulares clave [4 ], [5], [6]. Los estudios también demostraron que la hipoxia juega un papel fundamental en la supresión inmune mediada por tumor, lo que contribuye a mantener el escape inmunológico de tumores [7], [8]. Recientemente, un enlace confirmado entre la hipoxia tumoral y la tolerancia inmune a través del reclutamiento de células T reguladoras (Treg) se ha establecido en el cáncer de ovario [9]. Por lo tanto, una hipótesis se ha presentado que la hipoxia puede proporcionar obstáculos para las intervenciones terapéuticas inmunes.
Tregs se han reportado en la circulación y los tejidos tumorales de pacientes con diversos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular y Aumentado cáncer de páncreas [10]. La acumulación de datos también indicaron que la presencia de células T reguladoras resultó en un mayor riesgo de la progresión del cáncer [11], [12], [13]. Por otra parte, la inmunosupresión mediada por Treg se considera que es uno de los mecanismos de evasión inmune cruciales en tumor por lo que son capaces de superar la actividad anti-tumor de células CD8 de células citotóxicas, células dendríticas y células asesinas naturales [14]. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos subyacentes de Treg enriquecimiento en el cáncer gástrico será de gran valor para la orientación células T reguladoras para lograr un resultado clínico beneficioso. Aunque los mecanismos no se entienden bien, algunos estudios han indicado que el TGF-β1 está involucrado en ella [15].
En este estudio, la hipótesis de que el cáncer gástrico puede adquirir una ventaja selectiva mediante la inducción de células T reguladoras en condiciones de hipoxia a través de la vía de señalización de TGF-β1 y ello evitando la vigilancia inmune. Para demostrar nuestra hipótesis, se analizó la expresión de factor inducible de hipoxia-1α (HIF-1α) y Foxp3 en tejidos de cáncer gástrico, se evaluó el efecto de la hipoxia sobre la producción de TGF-β1 en líneas celulares de cáncer, y finalmente dilucidado el papel de mediador hipoxia enriquecimiento de Treg en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras
incluido en parafina, secciones de tumor fijadas en formalina se obtuvieron de 99 pacientes con cáncer gástrico que se sometieron a cirugía la resección de diciembre 2006 a febrero de 2008 a la Segunda Escuela de Medicina clínica de la Universidad de Yangzhou. Los datos de seguimiento se resumieron a partir de octubre de 2012 con una mediana de seguimiento de 53 meses (rango 4-70 meses). La supervivencia global (OS) se definió como desde el momento de la cirugía para el último seguimiento o la hora de la muerte.
Muestras de sangre periférica se obtuvieron de 20 pacientes con cáncer gástrico un día antes y 10 días después de la cirugía a partir de julio 2012 a octubre de 2012. Los sueros se congeló a -80 ° C inmediatamente después de la centrifugación para su uso futuro. Se aislaron las células inmediatamente mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante un gradiente de densidad de Ficoll.
Ninguno de los pacientes había recibido fármacos inmunosupresores o quimioterapia antes de la resección quirúrgica. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética (Comité de Ética de la Segunda Escuela de Medicina Clínica de la Universidad de Yangzhou, Yangzhou), y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes en el estudio.
tinción inmunohistoquímica
Las secciones seriadas (5 micras) de especímenes fijados con formalina, incluidos en parafina se realizaron. Las secciones se deparaffinized y rehidratada clasificado en el alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante el tratamiento de los portaobjetos en tampón de EDTA en un microondas durante 10 minutos. Conejo anti-humana HIF-1α anticuerpo primario (Bioworld, EE.UU.), anticuerpo TGF-β1 de ratón anti-humano (Santa Cruz, EE.UU.) y anticuerpo de ratón anti-Foxp3 humano (Abcam, EE.UU.) se utilizaron para los anticuerpos primarios. Diaminobencidina (DAB) se utilizó para sustrato después de la contratinción con hematoxilina para la sola tinción. Doble tinción se realizó con 2 cromógenos diferentes:. cromógeno DAB (color marrón) para HIF-1α y el cromógeno rápido rojo (color rojo) para el TGF-β1 o Foxp3
La inmunorreactividad de puntuación
HIF -1α tinción núcleo fue evaluada siguiendo el método descrito [16], la puntuación de tinción = intensidad de la inmunorreactividad (IR) × proporción de células teñidas positivamente. la intensidad de IR se estratificó en cuatro categorías: 0, sin IR; 1, IR débil; 2, IR moderadamente fuerte; y 3, fuerte IR. La proporción de células positivas se clasificó en cinco grupos: 0, sin tinción; 1, & lt; 2% de tinción; 2, 2-10% de tinción; 3, 11-29% de tinción; y 4, & gt;. tinción
Un sistema de puntuación modificado el 30% se utilizó para Foxp3
+ células [17]. Diez campos se contaron en alta potencia para Foxp3. El número absoluto de linfocitos por campo de gran aumento (CGA 400) se determinó. Se calculó la media del número de células positivas teñidas por campos de alta potencia.
Cultivo celular y la inducción de hipoxia
líneas celulares de cáncer gástrico humano, AGS y BGC823, se obtuvieron del Instituto de Shanghai de la célula biología, Academia china de Ciencias (Shanghai, china). Todas las células se propagaron en 5% de CO
2 a 37 ° C en DMEM o RPMI 1640 (HyClone Tianjin, China) suplementado con 10% FBS (Gibco, Australia), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina ( HyClone Tianjin, china). Para los experimentos de hipoxia, las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos, se lavaron dos veces con PBS cuando crecieron a 60-80% de confluencia, se mantuvo en medio AIMV exento de suero (Invitrogen, EE.UU.) para una incubación durante la noche, y luego se coloca en un modular cámara de la incubadora (Ruskinn Obras, YK) durante 24 h bajo hipóxica (1,0% de o
2) o normoxia condiciones (21% o
2), ambos con 5% de CO
2 a 37 ° C. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -80 ° C para la determinación posterior de las concentraciones de TGF-β1 y para el ensayo de co-cultivo. Todos los
in vitro
validación de los experimentos se llevaron a cabo en al menos tres ejemplares.
inmunofluorescencia
Las células (1 × 10
5 /pocillo) se sembraron en cubreobjetos en una placa de 24 pocillos para un cultivo de 24 h. Posteriormente, se fijaron en metanol frío durante 30 min a ser permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 durante otros 30 min. Las células se lavaron tres veces, bloqueados por el 10% de suero de cabra en PBS durante 30 min, y se incubaron con anticuerpo anti-humano de TGF-β1 (Santa Cruz, EE.UU.) y anticuerpo HIF-1α anti-humana (Epitomics, EE.UU.) en un congelador a 4 ° C durante la noche. Se detectó el anticuerpo primario a través de Alexa488 conjugado segundo anticuerpo (Invitrogen, EE.UU.) y Alexa Fluor 594 conjugado con segundo anticuerpo (Invitrogen, EE.UU.), respectivamente. Los cubreobjetos fueron examinadas bajo microscopía de fluorescencia OLYMPUS.
La extracción de RNA y Cuantitativas PCR en tiempo real (qPCR)
Cada una de las dos líneas celulares descritas anteriormente se cultivó en pocillos por triplicado en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia , como se describió anteriormente. El ARN total se aisló a partir de células inmediatamente de normoxia o hipoxia en el final del experimento, usando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). El ARN total (5 ng) se transcribió de forma inversa usando cDNA de transcripción inversa kits (Takara, Dalian, China), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. qPCR se realizó en un SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Dalian, China). Doblar los cambios en la expresión de cada ARNm de TGF-β1 en relación con GAPDH se calcularon basándose en el ciclo umbral (Ct) como 2
-Δ
(Ct), donde Ct = Ct
target - Ct
GAPDH y Δ (Ct) = Ct
hipoxia - Ct
normoxia. Los cebadores de TGF-beta 1 fueron: adelante, 5'-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 '; inversa, 5'-AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC-3 ', y los cebadores GAPDH fueron: hacia adelante, 5'-GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3'; revertir, 5'-GGTGT CGCTG TT GAAGT CAGAG-3 '. qPCR se realizó por triplicado.
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Se determinó la concentración de TGF-β1 en los sobrenadantes de los cultivos y los sueros utilizando un kit ELISA (eBioscience, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.
Aislamiento y cultivo de células T
PBMCs de donantes fueron etiquetados indirectamente con bocktail biotina-anticuerpo y las microbolas anti-biotina. CD4 + células T
se separaron mediante selección negativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Alemania). CD4
+ células T fueron etiquetados directamente con CD25 micro perlas y CD4
+ CD25
- Las células T se aislaron por selección negativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (pureza & gt; 95%; Miltenyi Biotec, Alemania) . Los sobrenadantes recogidos a partir de células AGS cultivadas en condiciones de normoxia o condiciones de hipoxia se diluyeron con medio fresco AIMV (01:03), llamado medio de normoxia y medio hipóxico, respectivamente. Un total de 1,0 × 10
6 /ml de CD4
+ CD25
- Las células T se estimularon con anti-CD3 /CD28 perlas recubiertas con (1:05; Invitrogen, USA) ± IL-2 (200 u /ml; Peprotech) para 72 h en medio (medio de control sin suero AIM-V), medio de normoxia o medio hipóxico. En algunos experimentos, el TGF-β1 humano recombinante (2 ng /ml; I & amp; D Systems, EE.UU.) y el TGF-β1 inhibidores de quinasa del receptor LY-364947. (5 M; Merck, Alemania) se añadieron a los cultivos
Citometría de Flujo
análisis de Fenotipo de las células t reguladoras se realizó con una BD FACS AriaII citómetro de flujo (BD, EE.UU.). Brevemente, las células se marcaron con CD4-FITC y Foxp3-PE (eBioscience, San Diego, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Para analizar la prevalencia de células T reguladoras CD4
+ Foxp3
+ se evaluaron las células T después de la compuerta de CD4
+ células T y se expresaron como porcentaje del total de CD4
+ células T.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en SPSS 17.0 para Windows. Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando una sola vía prueba de ANOVA, Mann-Whitney o χ
2 de prueba, en su caso. La correlación fue examinado por un correlación de Pearson. el tiempo de supervivencia acumulada se calculó a través de Kaplan-Meier y se analizaron mediante la prueba de log-rank. Los datos se expresan como medias ± SEM. La significación estadística se fijó en
P
. & lt; 0,05
Resultados
HIF-1α y expresión de Foxp3 en el cáncer gástrico tejidos
Después de la confirmación histológica de gástrica cáncer (Fig. 1A, superior izquierda y hacia abajo-izquierda), se determinó la expresión de HIF-1α y Foxp3 por inmunohistoquímica en 99 pacientes. HIF-1α con baja expresión (Fig. 1A, superior) y de alta expresión (Fig. 1A, hacia abajo) se encuentra predominantemente en el citoplasma y núcleo de células de cáncer en el margen del tumor, y se anotó el único tinción HIF-1α nuclear. Es interesante observar que, en algunos casos, los linfocitos también mostraron fuerte expresión de HIF-1α. Foxp3 con baja expresión (Fig. 1A, superior derecha) y de alta expresión (Fig. 1A, abajo a la derecha) fue visto en el núcleo de los linfocitos, la mayoría de los cuales estaban ubicados en el margen del tumor
.
( a) Foxp3 y la expresión de HIF-1α en especímenes de cáncer gástrico (secciones en serie) se determinaron por H & amp; e y tinción inmunohistoquímica. Representante H & amp; E tinción (arriba a la izquierda y abajo a la izquierda) y las imágenes de tumores que expresan pequeñas (superior e inferior-derecha) o grandes (abajo y abajo-derecha) cantidades de HIF-1α y Foxp3, respectivamente. (B) Histogramas mostró que la expresión de HIF-1α (izquierda) o Foxp3 (derecha) son significativamente más alta en el tumor metastásico que en tumor metastásico. Se realizó un análisis (C) de Kaplan-Meier para comparar la supervivencia global entre los pacientes con alta y baja expresión de Foxp3 (izquierda), así como la expresión positiva y negativa de HIF-1α (derecha). magnificaciones originales: × 100; × 400 (adiciones); Los valores representan la media ± SEM. *
P
. & Lt; 0,001
A continuación, las expresiones de HIF-1α y Foxp3 en los tejidos tumorales fueron comparados con no metastásico en pacientes (n = 52) y metastásico (n = 47) El cáncer gástrico. Tanto la puntuación media de HIF-1α y el número de Foxp3
+ células en pacientes con metástasis fue mayor que en los pacientes no metastásicos (HIF-1α, 7,69 ± 0,45 vs 5,41 ± 0,40,
P Hotel & lt; 0,001 , la figura 1B, izquierda;. Foxp3, 14,61 ± 1,01 vs 8,07 ± 0,95,
P Hotel & lt; 0,001, figura 1B, derecha)
Relación entre el sistema operativo y HIF-1α o Foxp3.. en el cáncer gástrico tejidos
Desde la última fecha de seguimiento, 50 de 99 (50,5%) pacientes estaban vivos, con una mediana de seguimiento de 64 meses (rango 57-70), mientras que 49 habían muerto de la enfermedad , con una mediana de tiempo hasta la muerte de 28 meses (rango 4-64). Para dilucidar la relación entre la expresión de HIF-1α o Foxp3 y OS, HIF-1α se clasificó como negativo (n = 34; anota ≤4) o positivo (n = 65; puntuaciones de & gt; 4), mientras que Foxp3 se clasificó como bajo (n = 51F) o alta (n = 48) usando el número medio (8,6 células /HPF) como el punto de corte. En nuestro estudio, la SG en Foxp3-baja grupo fue significativamente mayor que en Foxp3 grupo alto (
P = 0,017
, Fig. 1C, izquierda), mientras que el grupo de HIF-1α-negativo fue significativamente más alto que el HIF positiva del grupo -1α-(
P
= 0,009, figura 1C, derecha).
Asociación entre HIF-1α o Foxp3 y características clínico
La correlación entre las características clinicopatológicas y la expresión de HIF-1α o Foxp3 se evaluó posteriormente (Tabla 1). No se encontró correlación entre HIF-1α o expresión de Foxp3 y la edad o el sexo de los pacientes, así como el tamaño del tumor. Sin embargo, hubo un aumento en la tasa positiva de HIF-1α con la profundidad de la invasión tumoral (
P =
0.013). También se encontró una tendencia similar entre la expresión de HIF-1α (
P Hotel & lt; 0,001) o Foxp3 (
P
= 0,008) y el estadio tumoral. Además, se encontró una correlación significativa entre la metástasis de los ganglios linfáticos y la expresión de HIF-1α (
P = 0,029
) o Foxp3 (
P Hotel & lt; 0,001).
Relación entre HIF-1α y Foxp3 o TGF-β1 en el cáncer gástrico tejidos
el resultado inmunohistoquímico antes mencionado indica que el número de Foxp3
+ células fue de fuerte correlación positiva con la puntuación de HIF-1α en pacientes con metástasis
(r = 0,772
,
P Hotel & lt; 0,001; Fig. 2A, izquierda), pero no en pacientes sin metástasis (
r =
0,461,
P = 0,001
; Fig. 2A, derecha). A continuación realizó inmunohistoquímica doble tinción para evaluar la presencia de co-expresión entre HIF-1α y Foxp3 o TGF-β1. Los resultados mostraron que Foxp3
+ células se reúnen principalmente en los sitios cercanos a la región del tumor hipóxico con alta expresión de HIF-1α (Fig. 2B). Por otra parte, la mayoría de las células tumorales elevados de HIF-1α fueron alta expresión de TGF-β1 (Fig. 2C).
(A) La correlación de HIF-1α y Foxp3 en metastásico (izquierda) y el tumor no metastásico (derecha) , tal como se determina mediante el uso de la tinción inmunohistoquímica. (B) tinción doble de HIF-1α (marrón, el núcleo de las células cancerosas) y Foxp3 (rojo, el núcleo de los linfocitos). Las flechas rojas indican las células tumorales que expresan alta HIF-1α y azul flechas Foxp3
+ células. (C) la tinción doble de HIF-1α (marrón, el núcleo de las células cancerosas) y el TGF-β1 (rojo, el citoplasma de las células cancerosas). Las flechas rojas indican las células tumorales que expresan co-alta HIF-1α y TGF-β1, y las flechas azules para alta HIF-1α. aumento original × 200.
circulante células T reguladoras y TGF-β1 en la pre-cirugía y post-cirugía de pacientes
Para dilucidar la relación entre células T reguladoras y la concentración de TGF-β1 en el suero, CD4
+ Foxp3 se analizaron
+ células T en pacientes con cáncer gástrico a través de citometría de flujo (Fig. 3A). La frecuencia de células T reguladoras antes de la cirugía fue mayor que después de la cirugía (9,84 ± 0,40% vs 8,47 ± 0,33%,
P
& lt; 0,001, Fig 3B.). las concentraciones de TGF-beta 1 después de la cirugía se redujo significativamente en comparación con los antes de la cirugía (6431.95 ± 629.24 vs 7581.56 ± 556.45 pg /ml,
P
= 0,005, Fig. 3C). Una correlación positiva entre la frecuencia de Treg y la concentración de TGF-β1 se encuentra en el suero antes de la operación (
r = 0,454
,
P = 0,044
, Fig. 3D).
( a) parcelas representativos mostraron la frecuencia de CD4
+ Foxp3 células
+ T antes y 10 días después de la cirugía en la sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico, como se determina por análisis de citometría de flujo. (B) Un histograma muestra la frecuencia de células CD4
+ células Foxp3
+ T en sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico antes y 10 días después de la cirugía. (C) Un histograma mostró la concentración de TGF-β1 en sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico antes y 10 días después de la cirugía. (D) Correlación de la CD4
+ Foxp3
+ T células frecuencia y la concentración de TGF-β1 en la sangre periférica de 20 pacientes con cáncer gástrico antes de la cirugía. Los valores representan la media ± SEM. *
P
. & Lt; 0,001
TGF-β1 es muy upregulated en líneas celulares de cáncer gástrico en condiciones de hipoxia
Para identificar si la hipoxia induce la secreción de TGF β1 en células de cáncer gástrico, los niveles de TGF-beta 1 se investigaron en dos líneas celulares de cáncer gástrico, AGS y BGC823, bajo condiciones hipóxicas o normóxicas. La expresión de ARNm de TGF-β1 en condiciones de hipoxia se aumentó en comparación con condiciones de normoxia (Fig. 4A). Consistente con qPCR, los niveles de TGF-beta 1 en el sobrenadante de cultivo mostraron resultados similares (Fig. 4B). Además, las expresiones de TGF-β1 y HIF-1α también se detectaron por inmunofluorescencia, y los resultados mostraron un aumento de TGF-β1 y la expresión de HIF-1α en condiciones de hipoxia en comparación con el de en condiciones de normoxia (Fig. 4, C).
. (A) Un histograma mostró la expresión de ARNm de TGF-β1 en las líneas celulares AGS y BGC823. (B) Un histograma mostró el nivel de TGF-β1 en el sobrenadante de cultivo de las dos líneas celulares. (C) de inmunofluorescencia doble tinción mostró TGF-β1 y la expresión de HIF-1α en las dos líneas celulares. Alexa fluor594 (rojo nuclear), Alexa488 (indocarbocyanin verde) y DAPI (nuclear-counterstaining azul). aumento original x 200. Los valores representan la media ± SEM. * P & lt;. 0.001
La hipoxia aumenta la capacidad de inducir células T reguladoras a través de TGF-β1 en líneas celulares de cáncer gástrico
Para probar la hipótesis de que la hipoxia inducida por TGF-β1 contribuye a la aumento de células T reguladoras, que circula CD4
+ CD25
- células T de individuos sanos se trataron con los sobrenadantes de las células bajo diferentes condiciones. Los gráficos de puntos mostraron diferentes medios que inducen la expresión de Foxp3 en células CD4
+ T (Fig. 5A). La expresión de Foxp3 de células T en medio de normoxia, hipoxia medio y medio TGF-β1 humano recombinante fueron todos incrementa en comparación con el medio de control (
P
& lt; 0,001). Además, la expresión de Foxp3 en el medio hipóxico fue significativamente mayor que en el medio de normoxia (13,04 ± 0,74% vs 6,76 ± 0,35%,
P
& lt; 0,001, Fig 5B.). Además, como se le añadió LY-364947 para cada tipo de medio, la expresión de Foxp3 disminuyó abiertamente (
P
. & Lt; 0,001, Figura 5C).
(A) parcelas representativas mostró la expresión de Foxp3 en las células CD4
+ CD25
- células T cultivadas con diferentes medios de comunicación durante 72 h. Los sobrenadantes de las células AGS cultivadas en normoxia o condición hipóxica fueron llamados medio de normoxia y medio hipóxico, respectivamente, mientras que el medio AIM-V con o sin TGF-β1 humano recombinante (reTGF-β1) fue nombrado reTGF-β1 medio y medio de control, respectivamente . (B) Un histograma muestra la expresión de Foxp3 en las células CD4
+ CD25
- células T cultivadas con diferentes medios de comunicación. (C) Un histograma muestra que el TGF-β1 inhibidor de quinasa del receptor LY-364947 (TGF-β1 En) extirpa parte del indution de Foxp3 en las células CD4
+ CD25
- células T cultivadas en diferentes medios. Los valores representan la media ± SEM. *
P
. & Lt; 0,001
Discusión
Durante la última década, la evidencia emergente ha sugerido que las células T reguladoras contribuir a la creación de los tumores, al afectar la antitumoral inmune respuesta, o incluso estimular la metástasis directamente [18], [19]. Las pruebas obtenidas en los últimos años demostró frecuencias de células T reguladoras intratumorales aumentó en el cáncer gástrico, que se han relacionado con las características clínico-patológicas desfavorables y mal pronóstico [20], [21], [22]. De acuerdo con estos resultados ya se ha informado, nuestro estudio proporciona evidencia de que la frecuencia de células T reguladoras infiltrantes del tumor aumentó con el avance de las fases del tumor. Además, las células T reguladoras también proporcionó un factor pronóstico para después de la cirugía del cáncer gástrico. Además, se confirmó que el número de células T reguladoras en el cáncer gástrico metastásico son significativamente mayores que en el cáncer gástrico no metastásico. Los resultados anteriores apoyan la noción de que las células T reguladoras pueden contribuir a la progresión del tumor y puede ser una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico. Así, el próximo tratado de explorar el mecanismo subyacente que media Treg enriquecimiento en el cáncer gástrico.
La hipoxia tumoral es bien reconocida como un factor clave que resulta en la resistencia al tratamiento y el mal pronóstico para el cáncer gástrico [6], [16], [ ,,,0],23]. HIF-1α, como la firma molecular principal para la hipoxia, es el principal regulador de aguas abajo de la respuesta hipóxica en células tumorales [24]. Los resultados de nuestro estudio demuestran que la HIF-1α correlacionado con una categoría de comportamiento maligno, incluyendo la profundidad de la invasión, metástasis en los ganglios linfáticos y la promoción de la etapa del tumor. Sorprendentemente, los pacientes con cáncer gástrico con alta HIF-1α tenían una peor supervivencia que aquellos con baja HIF-1α, que fortalece aún más nuestra propuesta de que HIF-1α, o más bien la hipoxia, está conectado con la progresión del cáncer gástrico.
Durante mucho tiempo se ha reconocido que las células tumorales están protegidos contra daños inmune en microambientes tumorales hipóxicas; Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo objeto de escrutinio [25]. A partir de ahora, poco se sabe acerca de si existe un vínculo entre la hipoxia y la inmunosupresión mediada por Treg en los tumores. Varios estudios recientes han estudiado la regulación hipóxica de células T reguladoras, con resultados contradictorios. Ben-Shoshan
et al.
[26] informó de que la hipoxia aumenta el número y las propiedades de supresión de células T reguladoras para dictar un programa anti-inflamatoria. Wei
et al.
[7] también confirmó que la hipoxia aumenta la capacidad de glioblastoma multiforme para inducir células T reguladoras, y por lo tanto juega un papel clave en la supresión inmune mediada por tumor. Sin embargo, Dang et al. [27] encontró que HIF-1α inhibe la diferenciación de Treg Foxp3 por la orientación de proteínas para su degradación. En nuestro estudio, hemos presentado una correlación fuertemente positiva entre el número de células T reguladoras y la expresión de HIF-1α, lo que sugiere que la hipoxia puede contribuir a la infiltración de células T reguladoras en el cáncer gástrico. Vale la pena señalar que, en nuestros estudios, la mayoría de células T reguladoras se encuentran en la región cerca de las células cancerosas que expresan HIF-1α. Por lo tanto, es necesaria una mayor aclaración de si las moléculas hipoxia asociada liberadas de las células cancerosas contribuyen al enriquecimiento de células T reguladoras en el cáncer gástrico.
Si bien los mecanismos implicados en el enriquecimiento de células T reguladoras en los tumores todavía no se entienden bien, nos y otros investigadores han demostrado recientemente que las células tumorales pueden servir como una fuente de TGF-β1, que se requiere para la inducción y el mantenimiento de células T reguladoras
in vitro
y
in vivo
[28], [29], [30]. En el estudio actual, la frecuencia de células T reguladoras y TGF-β1 en circulación antes de la cirugía fue mayor que después de la cirugía, y los dos parámetros mostró una correlación positiva, lo que sugiere que el TGF-β1 derivado de tumor puede contribuir al aumento de células T reguladoras en gástrico cáncer.
la hipoxia, una característica común de los cánceres, puede inducir a las células cancerosas a citoquinas inmunosupresoras secretas incluyendo TGF-β1 [7], [31]. Los resultados de nuestro estudio demuestran la mayoría de las células de alta TGF-beta 1 fueron las células cancerosas que expresan HIF-1α en los tumores. Un
in vitro
estudio demostró la expresión de TGF-β1 aumentó en mayor medida en células de cáncer gástrico en cultivo hipóxicas, que también es consistente con estudios anteriormente mencionados. En base a los resultados, la hipótesis de que las células cancerosas secretan TGF-β1 para inducir la producción de células T reguladoras en el cáncer gástrico. Para probar nuestra hipótesis, aislado CD4
+ CD25
- las células T de individuos sanos fueron cultivadas en sobrenadantes diluidos de las células tumorales bajo diferentes condiciones de cultivo. Los resultados mostraron que la expresión de Foxp3 de las células T cultivadas en medio hipóxico fue significativamente mayor que las células cultivadas en medio de normoxia. Por otra parte, la adición extra de TGF-β1 recombinante humana aumentó significativamente la expresión de Foxp3, mientras que la adición de LY-364947, un inhibidor del receptor de TGF-β1, la reducción de expresión de Foxp3. Por lo tanto, estos resultados establecen una relación directa entre la hipoxia, el TGF-β1 y células T reguladoras en el cáncer gástrico.
Sin embargo, nuestro estudio preliminar también mostró que el TGF-β1 no fue modificado por el estabilizador de HIF-1α, cloruro de cobalto (CoCl
2), o HIF-1α inhibidor, 2-metoxiestradiol (2ME2) en AGS y BGC823, aunque el HIF-1α se incrementó por la hipoxia (datos no mostrados). Estos resultados sugirieron que HIF-1α puede ser no asociada con la inducción de TGF-β1 en células de cáncer gástrico en condiciones de hipoxia, que es coherente con el estudio anterior [32]. Además, la producción de células T reguladoras podría no ser completamente ablación mediante el bloqueo de TGF-β1, lo que indica que otras citoquinas o vías también pueden estar implicados. Además, las células de cáncer no son la única fuente de citoquinas dentro del microambiente del tumor. Por lo tanto, se necesitan más estudios para confirmar el mecanismo subyacente de la acumulación de Treg en el cáncer gástrico
.
En conclusión, el presente estudio demostró que la hipoxia potencia la capacidad del cáncer gástrico para evadir la vigilancia inmune por hasta la regulación de la expresión de TGF-β1, induciendo de este modo células T reguladoras en los tumores. Además, nuestros datos también proporcionan pruebas de la existencia de intercelular diafonía entre células tumorales y células T reguladoras, que podría regular las respuestas inmunes anti-tumorales.