Extracto
Debido a las bajas tasas de respuesta global de 10-47% a la terapéutica del cáncer dirigidos, allí es una creciente necesidad de biomarcadores predictivos. El objetivo fue identificar los genes que predicen la respuesta a los cinco inhibidores de tirosina quinasa ya aprobados. Hemos probado 45 líneas celulares de cáncer de sensibilidad al sunitinib, erlotinib, lapatinib, sorafenib y gefitinib en las dosis administradas clínicamente. Se determinó una matriz de resistencia, y se compararon los perfiles de expresión génica de los subconjuntos de líneas celulares resistentes vs. sensibles. genes triplicado firmas de expresión se obtuvieron a partir del proyecto caArray. Importancia del análisis de microarrays y clasificar los productos se aplicaron para la selección de características. Noventa y cinco genes también se midieron por RT-PCR. En el caso de cuatro genes de resistencia a sunitinib asociados, los resultados se validaron en muestras clínicas por inmunohistoquímica. Se identificó una lista de 63 genes superiores asociadas con la resistencia contra los cinco inhibidores de tirosina quinasa. Quantitative análisis RT-PCR confirmó 45 de 63 genes identificados por análisis de microarrays. Sólo dos genes (
ANXA3
y
Rab25
) estaban relacionados con la sensibilidad frente a más de tres inhibidores. El análisis inmunohistoquímico de carcinomas de células renales metastásico tratados con sunitinib confirmó la correlación entre RAB17, LGALS8, y EPCAM y la supervivencia global. En resumen, se determinó biomarcadores predictivos para los cinco inhibidores de tirosina quinasa, y validado biomarcadores de resistencia sunitinib por inmunohistoquímica en una cohorte de pacientes independiente
Visto:. Pénzváltó Z, Tegze B, Szász AM, Sztupinszki Z, LIKO I, Szendrői A, et al. (2013) La identificación de mecanismos de resistencia en contra de cinco inhibidores de tirosina cinasa de focalización erbB /RAS Camino en 45 líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (3): e59503. doi: 10.1371 /journal.pone.0059503
Editor: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Alemania |
Recibido: 21 Agosto, 2012; Aceptado: 15 Febrero 2013; Publicado: 29 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Pénzváltó et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por el OTKA PD 83154, por el proyecto Predict (concesión no. 259303 de la llamada Health.2010.2.4.1.-8), por el TÁMOP-4.2.1.B-09/1 /KMR-2.010-0001 y por la Fundación Alexander von Humboldt. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. La afiliación del Dr. István LIKO con Gedeon Richter no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
la terapia dirigida en el tratamiento del cáncer se refiere a la aplicación de agentes especiales que actúan sobre las características moleculares específicos de vías de transducción de señales implicadas en el desarrollo de el fenotipo canceroso. inhibidores de erlotinib, gefitinib, sorafenib, sunitinib y lapatinib se utilizan todos clínicamente tirosina quinasa (TKIs), los receptores de orientación y miembros aguas abajo de la vía ERBB /RAS [1]. Erlotinib y gefitinib son inhibidores de tirosina quinasa reversibles factor de crecimiento epidérmico (EGFR) usados en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas. Alrededor del 10% de los pacientes responden al tratamiento en la población de Europa y América del Norte [2]. Lapatinib inhibe el dominio tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento epidérmico receptor humano 2 (HER2). Está aprobado para el tratamiento del cáncer de mama, donde la tasa de respuesta global a este tratamiento es del 24% [3]. Sorafenib inhibe RAF, VEGFR, PDGFR, Flt-3, receptores de c-kit. La tasa de respuesta parcial es 10%, cuando se administra a pacientes con carcinoma avanzado de células renales [4]. Sunitinib es una pequeña molécula de objetivos múltiples de la tirosina quinasa del receptor (RTK) inhibidor que fue aprobado por la FDA para el tratamiento del carcinoma de células renales (CCR) y tumor del estroma gastrointestinal resistentes a imatinib (GIST). tasa de respuesta objetiva es del 31% en el tratamiento de primera línea del carcinoma de células renales [5]. Debido a las bajas tasas de respuesta global de 10-47% [6] - [10], existe una creciente necesidad de biomarcadores que predicen la respuesta al tratamiento terapia dirigida
Además de los parámetros farmacocinéticos, un tumor puede desplegar diferentes molecular. mecanismos para lograr la resistencia frente a los agentes de terapia dirigida: la molécula diana puede estar sujeto a modificaciones, alteraciones de aguas abajo de la vía pueden conducir a la resistencia contra un agente de dirección una molécula de aguas arriba, o de otras vías pueden ser activadas que median alternativamente la supervivencia y la proliferación de células cancerosas. Por ejemplo, la mutación T790M de la
EGFR
gen conserva la capacidad del receptor para activar la vía de aguas abajo, pero disminuye al mismo tiempo la unión de gefitinib y erlotinib al receptor y por lo tanto conduce a la resistencia a fármacos [11].
MET
amplificación causa resistencia contra erlotinib y gefitinib a través de la activación de las vías alternativas [12]. Interleucina-8 puede activar una ruta alternativa que conduce a la resistencia a sunitinib [13]. Las mutaciones de los genes de los miembros de aguas abajo de la vía también pueden contribuir a la resistencia frente a los agentes de terapia dirigida, como se ha descrito antes en el caso de
KRAS
[14],
PTEN
[15],
BRAF
[16], y
PIK3CA
[17]. Cuando un componente de aguas abajo del sistema de señalización activa la vía, la inhibición por el bloqueo de un miembro de aguas arriba ha demostrado ser ineficaz. Estos cambios aguas abajo pueden utilizarse como predictores negativos para los agentes de aguas arriba de este elemento adictivo de la vía que actúan, como se ha descrito antes para
KRAS
[18]. Si
KRAS
alberga una mutación activadora, agentes que actúan sobre el EGFR no tendrá ningún efecto sobre el crecimiento del tumor [19].
Estudios anteriores ya han descrito que el uso de los datos de expresión génica, junto con
in vitro
ensayos de sensibilidad a los fármacos, se puede utilizar para desarrollar las firmas que podrían clasificar respuesta a los agentes anticancerígenos convencionales [20], [21]. En otro estudio, un panel de líneas celulares de cáncer se trató con dasatinib, un inhibidor de quinasa multidiana, y la sensibilidad al fármaco se midió. En paralelo, los datos de expresión generados desde el mismo panel de líneas celulares se utilizaron para desarrollar una firma para predecir la sensibilidad a la droga [22]. En un estudio diferente, se utilizó un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón para desarrollar la expresión de genes firmas que predicen la sensibilidad a los inhibidores de EGFR gefitnib [23] y erlotinib [24]. Por último, los genes importantes comunes de un
in vitro
y un
in vivo
estudio fueron capaces de predecir la respuesta a la rapamicina [25]. Aunque centrado en agentes terapéuticos individuales en un tipo de cáncer, estos estudios ya demostraron el poder de perfiles de expresión génica para predecir la respuesta a un agente específico.
En el presente estudio, se tomaron un enfoque más amplio con el objetivo de identificar los genes firmas asociadas con la resistencia intrínseca frente a 5 inhibidores de tirosina quinasa ya aprobados destinados a la /RAS-vía ERBB. Para la obtención de nuevos biomarcadores predictivos, correlacionamos la sensibilidad de las 45 líneas de células cancerosas en representación de 15 entidades diferentes a los patrones de expresión. Los mejores genes candidatos destacados fueron validados mediante QRT-PCR. Por último, la validación clínica se realizó mediante inmunohistoquímica basado en microarrays de tejidos en una serie de carcinomas de células renales de pacientes tratados con sunitinib.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La aprobación número para la recogida de la muestra por el Comité de Ética de Investigación (ETT-TUKEB) (Hungría) Científico Nacional y es el nº 185/2007. consentimiento general se obtuvo antes de la cirugía. El Comité de Ética de la Investigación Científica y Nacional no solicitó una autorización específica por escrito, ya que, se trataba de un estudio retrospectivo, y los pacientes fueron manejados de forma anónima.
Cell Cultura y
Se obtuvieron 45 líneas celulares de la ATCC . Antes de la selección, la ausencia de
KRAS
mutación en las líneas celulares se confirmó usando el Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (búsqueda realizada en la 25
de junio de 2010). Las células se cultivaron de acuerdo con los protocolos de ATCC (http://www.lgcstandards-atcc.org/). Además, los antibióticos (penicilina-estreptomicina, Invitrogen, cat. No .: 15070-063, anfotericina B, Invitrogen, cat. No .: 15290-026) se añadieron. Las líneas celulares se resumen en la Tabla 1. Una visión general del estudio se presenta en la Figura 1.
Las cajas con fondo gris representan los pasos de formación, mientras que el fondo blanco representa las etapas de validación.
el aislamiento de ADN y control de Calidad
se aisló el ADN utilizando el Qiagen DNeasy Tissue Kit de sangre y (Qiagen, Hilden, Alemania, cat. no .: 69506) de acuerdo con la guía del usuario del producto. Cantidad y calidad del ADN fueron probados mediante el uso de un sistema Nanodrop 1000 (BCM, Houston, TX, EE.UU.). DNA (A260) y las concentraciones de proteínas (A280) y la pureza de la muestra (relación 260/280) se midieron y sólo se utilizó ADN de alta calidad para su posterior análisis. ADN se almacenó a -80 ° C.
Autenticación de Líneas Celulares
La autenticación se realizó para las líneas celulares obtenidas Hace más de 4 años a partir de ATCC utilizando la repetición corta en tándem (STR) análisis de 10 específica loci en el genoma humano y un marcador específico de ratón. La autenticación se lleva a cabo por el Sistema de Identificación StemElite en el Centro de Análisis de Fragmentos, Johns Hopkins University (Baltimore, EE.UU.). STR perfiles de las líneas celulares aplicadas fueron comparados con la base de datos de perfil STR del Instituto Leibniz DSMZ - Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (http://www.dsmz.de). Todas las líneas celulares incluidos en este estudio estaban libres de contaminación.
Pruebas de resistencia
Las drogas se han utilizado en su forma disponible en el mercado, y se aplicaron a las células en 3 concentraciones (C1, C2, C3 ). C1 = 0,1 * C2 y C3 = 10 * C2. C2 concentración se deduce de las dosis clínicamente usados (ver Tabla 2).
El ensayo de MTT (Roche, Cat. No .: 11465007001), se utilizó para probar el efecto antiproliferativo de los reactivos y viabilidad celular. En cada experimento, las células 2000 /pocillo se sembraron en 100 l de medio en placas de 96 pocillos. Un día después de la incubación, las células se tiñeron preintervención. Al mismo tiempo, los cultivos se trataron con los 5 fármacos estudiados en concentraciones C1, C2 y C3. En el quinto día se terminó el experimento y se tiñeron las células. La absorbancia se leyó con un Thermo Scientific Multiskan® FC. La absorbancia medida a 595 nm se corrigió con el fondo medido a 690 nm. Todas las mediciones se repitieron tres veces y para el cálculo de los valores de índice de resistencia (RI), se utilizaron los promedios de las 3 medidas. El índice de resistencia (RI) se calculó mediante la fórmula [26]: donde N
pre es el valor de absorbancia medio de control previo (que representa el número de células al inicio del tratamiento), N
mensaje es el medio valor de absorbancia de control (que representa el número de células al final del tratamiento con el tratamiento con vehículo solamente), y N
2 es el valor de absorbancia medio de las células tratadas tratadas con la concentración C2 del fármaco estudiado. las concentraciones de C1 y C3 se utilizaron como controles internos para controlar el rango dinámico de los agentes. Sólo las líneas celulares que cumplieron con los criterios de calidad de N
Post & gt; N
pre y desviación en el crecimiento celular dentro de las repeticiones. & lt; 15% se incluyeron en la evaluación
Selección de características
microarrays de datos sin procesar para las líneas celulares fueron generados en el proyecto de GSK caArray (ftp://caftpd.nci.nih.gov/pub/caARRAY/transcript_profiling). caArray fue desarrollado utilizando las directrices de compatibilidad caBIG, así como las normas de la sociedad de expresión de genes de datos de microarrays (MGED) para los datos de microarrays. Después de la descarga, los archivos fueron raw.CEL MAS5 normalizada en el entorno estadístico R (www.r-project.org) utilizando la biblioteca affy Bioconductor [27]. MAS5 clasificado entre los mejores métodos de normalización cuando se compara con los resultados de las mediciones QRT-PCR en nuestro estudio reciente [28]. Cada línea celular se midió en los microarrays por triplicado - en la etapa final de la pre-procesamiento de la media de estos se calcularon. A medida que la sonda fija con muy baja abundancia no sólo son poco probable que mantenga importancia biológica, pero también están propensos a errores, hicimos un filtrado para conservar únicamente los conjuntos de sonda con una expresión media de 100 y la expresión máxima a lo largo de 1000. La base de datos normalizada completa se presenta en Tabla S1
.
El conjunto completo de datos que consiste en los perfiles de expresión ha sido arreglado en 2 clases, de acuerdo con las propiedades de resistencia de las líneas celulares. Se excluyeron las líneas de células intermedias. Este procedimiento de selección resultó en 5 conjuntos de datos, que fueron calificadas de las tareas de clasificación autónomas. Para obtener la lista de genes muy bien correlacionada con la resistencia, se utilizó el análisis de la importancia microarrays (SAM) [29] y clasificar los productos [30], [31]. Mientras SAM es el método más ampliamente utilizado, no se encontraron rango de productos para ofrecer el mejor rendimiento en una configuración similar a nuestro proyecto con el tamaño de la muestra en un resumen anterior de los métodos de selección de características disponibles [32]. La eficacia del gen establece para discriminar las líneas de células resistentes y sensibles se calculó usando análisis de predicción de Microarrays [33]. El archivo R del análisis estadístico utilizado está disponible en el material complementario como script S1.
Para evaluar la capacidad de los genes de los conjuntos de predecir la supervivencia, se realizaron búsquedas en PubMed GEO para conjuntos de datos disponibles con seguimiento clínico donde los pacientes de cáncer se trataron con uno de los cinco agentes investigados. Por último, para buscar las listas de genes similares a los genes e identificar los genes correlacionados con los genes identificados, se utilizó el motor de búsqueda CCancer [34].
Aislamiento de ARN y Control de Calidad
Después de la homogeneización utilizando Qiashredder, el RNA se aisló usando el kit Qiagen RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con la guía del usuario del producto. La cantidad y la calidad del ARN aislado se puso a prueba mediante el uso de un sistema de Nanodrop 1000 (BCM, Houston, TX, EE.UU.) y por electroforesis en gel usando un sistema Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EE.UU.). Se midieron RNA (A260) y las concentraciones de proteínas (A280) y la pureza de la muestra (relación 260/280). Sólo de alta calidad, el ARN total fue aceptada intacta para las muestras que también mostraron 18S y 28S ribosomal regulares patrón de ARN curva en el análisis Bioanalyzer. RNA se mantuvo a -80 ° C hasta que la medición RT-PCR.
TaqMan Ensayo
TaqMan PCR en tiempo real se usó para medir la expresión de 95 genes seleccionados (más un gen de mantenimiento) utilizando sistema de micro tarjeta neumático (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en 40 líneas celulares. Las mediciones se realizaron con un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900HT como se describe en la Guía del usuario de los productos. Se seleccionaron los genes para incluir la parte superior genes correlacionados con la resistencia a los diferentes agentes. Además, sobre la base de una búsqueda en la literatura, se añadieron también un conjunto de genes correlacionados con la resistencia a la terapia dirigida y miembros de la vía /RAS EGFR para análisis adicionales. La lista de genes incluidos se presenta en la Tabla S2.
Análisis de los datos de las mediciones de RT-PCR
Para el análisis de datos primarios se utilizó el software SDS 2.2. Los valores de Ct delta (que representan la expresión normalizada de expresión 18S ribosomal) se agruparon de acuerdo a las características de resistencia contra los diversos agentes en grupos. A continuación, se realizó la prueba t de Student para comparar la expresión del gen en los diversos grupos de forma independiente. La significación estadística se estableció en p. & lt; 0,05
carcinoma de células renales (CCR) de toma de muestras
Los pacientes fueron tratados en el Departamento de Urología de la Universidad de Semmelweis, Budapest, Hungría entre 2005 y 2010. Las muestras se recogieron según el protocolo de la patología del estado de la técnica de todos los pacientes operados de cáncer de células renales. Sin embargo, sólo los pacientes con enfermedad metastásica después se incluyeron en este estudio, ya que sólo estos pacientes recibieron un tratamiento de terapia dirigida. Los dos agentes en el uso clínico de CCR metastásico son sunitinib y sorafenib. De estos, sunitinib se administra en la primera configuración de la línea, por lo tanto, estos pacientes fueron elegidos para el análisis inmunohistoquímicos. microarrays de tejidos (TMA) de todas las muestras FFPE se construyeron con el instrumento del tejido micro-generador de arreglos (Histopatología Ltd., Pécs, Hungría). En el TMA, se utilizaron duplicados de 2 mm de ancho núcleos de cada tumor en representación de sus áreas más relevantes de acuerdo con la histopatología.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica (IHC) Las reacciones se realizaron en 4 micras de grosor obtenido a partir de bloques de TMA. Después de desparafinación, los portaobjetos se calientan en un horno de microondas en Target Retrieval Solution (Dako, Carpenteria, CA, EE.UU.) durante 30 minutos. Un sistema de referencia immunostainer automatizado Ventana se utilizó de acuerdo con el protocolo '880' (y '870' para LGALS8) proporcionado por el fabricante (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, EE.UU.). RAB17 (dilución, 1:200), LGALS8 (1:50), EpCAM (1:100) y CD9 (1:300) anticuerpos fueron utilizados para la tinción. Los tejidos se contratiñeron con hemalaun de Mayer (00-8011, Zymed Laboratories Inc.). Los controles positivos y negativos tejidos de control fueron aplicados en todas las carreras IHC. En caso de CD9, LGALS8, RAB17 reacción citoplasmática, para EpCAM tinción membranosa fue aceptada como correcta localización.
Los portaobjetos teñidos fueron digitalizadas con un escáner de diapositivas (MIDI Mirax Scan, 3DHistech Ltd., Budapest, Hungría), y la intensidad de la reacción de (0: reacción negativa, 1: débil positividad, 2: positividad moderada, 3: fuerte reacción) y la frecuencia de células teñidas positivamente (0:0-1%, 1:1-5%, 2:5-10%, 3:10-20%, 4:20-33%, 5:33-50%, 6:50-66%, 7:66-80%, 8:80-100%) eran evaluado por separado. Por último, la correlación entre los grupos de supervivencia de 25 percentiles, así como gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier basa en la agrupación utilizando la mediana se computaron en WinStat para Excel (R. Fitch Software, Bad Krozingen, Alemania).
resistencia
La resistencia de cada línea celular se midió por triplicado para cada una de las tres concentraciones de los cinco agentes. A continuación, las líneas celulares se clasifican en base a sus valores de IR. Un valor intermedio RI fue designado como dentro del valor de la mediana RI +/- 10% del rango de RI. Las líneas celulares que presentan mayores IR fueron designados como resistentes, y las líneas celulares con las IR inferiores como sensibles. Un resumen completo de la separación de líneas celulares en grupos se muestra en la Tabla 1.
Identificación de Genes discriminatorias
Para la clasificación, los genes fueron filtradas para incluir sólo aquellas que logran al menos una diferencia de 2 veces en la expresión media en comparación entre las líneas celulares designadas como sensibles o resistentes. A continuación, se llevó a cabo la selección de características con SAM y clasificar los productos. Sólo aquellos genes fueron aceptados como significativa, que alcanzó una tasa de falso descubrimiento por debajo del 20%. La lista completa de los genes importantes se enumeran en la Tabla S3.
La precisión de la clasificación en la configuración de validación cruzada de dejar uno-a cabo utilizando todos los genes en las líneas celulares dio como resultado una eficiencia del 92,8% en el PAM (se excluyeron las líneas celulares con resistencias intermedias). El uso de los 100 genes identificados por rango de productos resultó en 79% predicciones correctas. Las clasificaciones correctas utilizando las 100 mejores productos de rango genes identificados se presentan en las clasificaciones incorrectas de color azul y en rojo en la Tabla S4.
A pesar de que los agentes investigados están en uso clínico ya desde hace más de 7 años, no hemos podido encontrar publicado conjuntos de datos apropiados para el metanálisis del gen-conjunto identificado. Por lo tanto, no fue posible realizar un
in silico
validación en la predicción de la respuesta clínica o la supervivencia. Usando CCancer, se han identificado todos juntos 27 publicaciones con la superposición de conjuntos de genes. Estos se presentan en la Tabla S5.
TaqMan Validación de Cell Line-Gen Derivado de Perfiles
TaqManq resultados de RT-PCR se resumen en la Tabla 3. 45 de los 63 genes asociados con la resistencia en la función selección a través de los datos de microarrays fueron confirmados por debajo de P & lt; 0,05 y 23 de ellas por debajo de P & lt; 0,01. La más alta significación se logra por
ITGB4 gratis (p = 0,005) de la erlotinib-resistencia asociada, por
IADA gratis (p = 0,003) de los genes asociados a gefitinib, por
FAT4 gratis (p = 0,011) de los genes asociados con sorafenib y por
furina
y
ME1 gratis (p = 0,011) de los genes asociados a lapatinib. Varios genes se confirmaron de manera significativa de la firma de genes de resistencia a sunitinib incluyendo
KRT18 gratis (p = 0,001),
LGALS8 gratis (p = 0,019),
RAB17 gratis (p = 0,002 ),
CD9 gratis (p = 0,002) y
PPL gratis (p = 0,001). Mientras tanto, sólo 7 de los 32 genes descritos previamente en la literatura como asociado con la resistencia contra los agentes de terapia dirigida fueron confirmados. El resultado normalizado completa de los ensayos TaqMan está disponible como el cuadro S6.
Algunos de los genes estaban asociados con la resistencia contra varios agentes. La mayor importancia de éstos se logró por
COL3A1 gratis (p & lt; 0,001 en el caso de sorafenib-resistencia),
GJA1 gratis (p & lt; 0,001 en el caso de sunitinib-resistencia) y
KRT19
(p & lt; 0,001 en el caso de sunitinib-resistencia). También hemos representado los genes asociados con la resistencia contra múltiples agentes usando un circo de trama (véase la Figura 2). Usando este enfoque se puede reconocer el alto número de genes asociados con la resistencia sunitinib y la presencia de sólo un único gen correlacionada con la resistencia lapatinib. Sólo dos genes (
ANXA3
y
Rab25
) se correlacionaron con la resistencia intrínseca contra al menos cuatro agentes.
Circos parcela de RT-PCR validados correlaciones de los genes asociados con la resistencia contra múltiples agentes identificados por el análisis de microarrays. El espesor de las cintas se correlaciona con el
log (p) Red de la correlación (ver Tabla 2.). Tenga en cuenta el alto número de genes asociados con la resistencia sunitinib y el gen único asociado con la resistencia lapatinib. Los dos genes son más informativos y ANXA3 Rab25, cada uno asociado a la resistencia contra cuatro agentes.
validación basada en IHC en los carcinomas de células renales
En total, 39 pacientes tratados con sunitinib con insuficiencia renal metastásico carcinoma de células se incluyeron en el estudio. Las muestras de los pacientes se recogieron antes de la administración de TKI primera línea y, por tanto, son similares a la medición de la expresión génica en líneas celulares sin tratamiento. La edad media de los pacientes fue de 59 años, el 63% de los pacientes eran mujeres. La mediana de supervivencia global es de 14 meses con 12/39 muertes. El promedio de supervivencia es de 20 meses. metastasectomía parcial se llevó a cabo en caso de diecisiete pacientes. Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica para tres proteínas codificadas por los genes identificados se muestran en la Figura 3. Los resultados detallados en todas las muestras de todos los genes se presentan en la Tabla S7.
Los ejemplos representativos de la validación immunhistochemical para CD9, EpCAM y LGALS8. Columna de la izquierda: riñón normal, columna derecha: seleccionado tejido tumoral
El aumento de la intensidad de la tinción de LGALS8 (p = 0,026) y RAB17 (p = 0,018) y la frecuencia de células positivas para EpCAM (p. = 0,01) y LGALS8 (p = 0,01) se correlacionaron con la supervivencia mejorada. Mientras tanto, CD9 - aunque mostrando una tendencia hacia la reducción de la supervivencia en pacientes con aumento de la intensidad de tinción (p = 0,14) - no fue significativa. La trama de supervivencia de Kaplan-Meier para EPCAM se representa en la figura 4.
de Kaplan-Meier de supervivencia de las parcelas muestras CCR metastásico tratados con sunitinib divididos en dos grupos en base a la mediana de las células EpCAM positivos (p = 0,01).
Discusión
agentes de terapia selectivas que actúan a través de la vía ERBB /RAS entró en la corriente principal de las directrices de la terapia del cáncer. Como todavía sólo 10-47% de los pacientes responden a estas terapias, es de suma importancia para identificar los conductores y los posibles marcadores de resistencia. En nuestro estudio hemos utilizado las líneas celulares de cáncer y 45 firmas de expresión de genes en todo el genoma para identificar nuevos genes potenciales biomarcadores intrínsecas. Como un potencial aplicación clínica de nuestra estrategia, hemos validado los productos de los genes asociadas a la resistencia por análisis IHC en los carcinomas de células renales tratados con sunitinib.
Se utilizó un panel heterogéneo de líneas celulares de cáncer de pulmón procedentes de (utilizados ITC erlotinib y gefitinib incluir), mama (lapatinib), renales (sorafenib y sunitinib), y el hígado (sorafenib). Se excluyeron las líneas celulares con una mutación RAS conocido, ya que la activación de mutaciones RAS hacen que la inhibición de la tirosina quinasas aguas arriba completamente ineficaces, como se ha demostrado previamente para el cáncer de colon [35]. La selección de líneas celulares permite la identificación de genes relacionados con robustas vías independientes identificados previamente.
En un estudio reciente de la Barretina et al, se investigó un gran panel de líneas celulares para identificar marcadores de sensibilidad frente a un conjunto de agentes citotóxicos y agentes dirigidos incluyendo tres de los inhibidores de la tirosina quinasa utilizados en el estudio actual (erlotinib, lapatinib y sorafenib) mediante la medición de la sensibilidad a los valores de IC50 y EC50 [36]. Para aumentar la relevancia clínica de las pruebas de línea celular de cáncer, se utilizaron concentraciones de drogas aplicadas en el ámbito clínico, como se esperaba encontrar los marcadores candidatos más confiables en concentraciones alcanzables también en los pacientes [37], [38]. La robustez del método que utiliza este tipo de concentraciones clínicos predefinidos se apoya en el éxito de la validación en una cohorte clínica de los pacientes tratados con sunitinib.
Hemos encontrado que más se asocia resistencia cruzada genes relacionados con sunitinib-resistencia. Curiosamente, hasta el momento sólo unos pocos genes se han correlacionado con sunitinib-resistencia en la literatura mientras que el número de genes candidatos implicados en la resistencia contra los otros agentes es mucho más grande. Por lo tanto, nos centramos sobre todo en la resistencia de sunitinib y realizado experimentos de inmunohistoquímica en muestras tumorales para validar el potencial discriminatorio de los cuatro nuevos biomarcadores candidatos,
LGALS8
,
RAB17
,
EpCAM
, y
CD9
.
Nuestro primer gen candidato
LGALS8
codifica un miembro de la familia de galectina. Las galectinas se han implicado en muchas funciones, incluyendo el desarrollo, la diferenciación, la adhesión célula-célula, la interacción célula-matriz, la regulación del crecimiento, la apoptosis y empalme de ARN. La galectina-8 también puede estar implicado en la angiogénesis [39], y la expresión se cambia durante hypolaryngeal y la progresión del tumor de laringe [40]. El segundo gen,
RAB17
es una GTPasa específica de células epiteliales que juega un papel importante en la regulación del tráfico de membrana [41]. El tercer gen, epiteliales molécula de adhesión celular (
EpCAM
) es una proteína de membrana con propiedades proto-oncogénica que se expresa en numerosos tipos de cáncer y es un objetivo prometedor medicamento contra el cáncer. Funciona como una molécula de adhesión celular independiente del calcio homotípica. La liberación del dominio intracelular de la molécula da como resultado la activación de la vía Wnt [42]. Alta expresión de
EpCAM
se asocia con un mal pronóstico en el carcinoma de la vesícula biliar [43]. Por último,
CD9
juega un papel en muchos procesos celulares, incluyendo la diferenciación, la adhesión, la transducción de señales, crecimiento, y en la supresión de la motilidad de células de cáncer y la metástasis. Miyake
et al
demostró que en pacientes con carcinomas ductales invasivos de la disminución de la expresión de
CD9
proteína se asocia con un mal pronóstico [44]. Los resultados de la tinción IHC confirmaron las correlaciones entre los
LGALS8, RAB17
y
EpCAM
y la supervivencia de pacientes con carcinoma renal tratados con sunitinib, mientras CD9 no logró alcanzar el potencial discriminatorio significativo.
según los resultados de nuestro estudio estos genes podrían representar nuevos candidatos para identificar pacientes que pueden beneficiarse de la terapia con sunitinib. Si bien el análisis inmunohistoquímico validado 3 de los 4 candidatos de biomarcadores, se necesita un estudio clínico más grande para estimar rigurosamente el poder y confirmar su significado clínico.
En la última década, la adicción oncogén ha sido reconocida como una de las factores clave de la evolución del cáncer, que también puede marcar las vías y los genes para terapias específicas [45]. Sin embargo, debido a la adaptación de las células cancerosas, adicción a las drogas que resulta del tratamiento intensivo puede superar la adicción oncogén como se ha demostrado recientemente en líneas celulares de cáncer de pulmón [46]. Para entender estos procesos, la identificación de los genes, que comparten un papel funcional en la resistencia contra varios agentes de terapia dirigida, es de alta prioridad
.
A pesar del mecanismo de acción similar, fue identificado ningún gen que se correlaciona con la sensibilidad frente a los cinco agentes en nuestro estudio. Dos genes,
ANXA3
y
Rab25
se relaciona con cuatro fármacos.
Anexina 3 gratis (ANXA3) desempeña un papel en el crecimiento celular y la transducción de señales [47], y estaba enlazado a la resistencia de platino en el cáncer de ovario [48]. El producto de la
ANXA3
gen también fue identificado como uno de los objetivos de la tirosina-fosforilación de EGFR mediante inmunoprecipitación y Western Blot [49].
ANXA3
fue identificado como uno de los cuatro genes regulados implicados en la progresión del cáncer de próstata en un estudio reciente que compara EGFR mutado y los tumores no mutados [50]. Nuestros resultados implican la posibilidad de la participación de los
ANXA3 Hoteles en vías colaterales que permitan a las células cancerosas para eludir la terapia de TKI.
Rab25
es un miembro de la familia del oncogén RAS. La pérdida de
Rab25
se asoció con adenocarcinomas colorrectales humanos [51] y el cáncer de mama triple negativo [52], pero el gen todavía no se ha investigado en relación a tirosina quinasa resistencia. Futuros estudios que incluyeron pacientes con tirosina quinasas simultáneamente secuenciados y señalización RAS se necesitan los miembros de la vía para evaluar su relevancia en la terapia dirigida.
En resumen, presentamos un análisis de tuberías integral para futuros estudios de los inhibidores de tirosina quinasa investigados. Como una prueba de principio hemos seleccionado un conjunto de genes asociados con la resistencia a sunitinib (el agente con los biomarcadores predictivos menos publicadas) para las pruebas en una cohorte clínica.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
microarrays de datos normalizados de todos los genes en todas las líneas celulares.
doi: 10.1371 /journal.pone.0059503.s001 gratis (XLSX)
Tabla S2. List de los genes seleccionados para la validación de QRT-PCR.