Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es una de las tres principales causas de mortalidad por cáncer. CRC mata a más de 600.000 personas al año en todo el mundo. La causa más común de muerte por CRC es la metástasis en órganos distantes. Sin embargo, los biomarcadores para CRC metástasis permanecen mal definidos. Se han comparado las líneas celulares primarios y metastásicos CRC para sus perfiles de la angiogénesis en proteínas y perfiles de señalización intracelular para identificar nuevos biomarcadores para el CRC metástasis. Con este fin, hemos utilizado líneas celulares primarios y metastásicos CRC como un sistema modelo y la línea celular de colon humano normal como control. La angiogénesis perfiles de dos líneas celulares de CRC isogénicas, SW480 y SW620 y HT-29 y T84 reveló que el VEGF se regula positivamente tanto en SW620 y T84 mientras que el factor de coagulación III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF AA /AB, endotelina I y CXCL16 fueron regulados a la baja específicamente en líneas de células metastásicas. Además, hemos encontrado que TIMP-1, anfirregulina, endostatina, angiogenina se upregulated en SW620 mientras que en downregulated T84. Angiogenina se downregulated en T84 y GM-CSF también se downregulated en SW620. Para inducir la metástasis de las células CRC, las células tratadas con citoquina proinflamatoria IL-6. Tras el tratamiento con IL-6, la transición epitelial-mesenquimal se indujo en células de CRC. Cuando DLD-1 y células HT-29 fueron tratadas con IL-6; Akt, STAT3, AMPKα y los niveles de fosforilación de Bad se incrementaron. Curiosamente, SW620 mostró el mismo patrón de activación de la señal con el tratamiento con IL-6 de HT-29 y DLD-1. Nuestros datos sugieren que la Akt, STAT3, AMPKα y activación inadecuado pueden ser biomarcadores para el cáncer colorrectal metastásico. tratamiento con IL-6 redujo específicamente los niveles de fosforilación de EGFR, receptor HER2, la insulina y el IGF-R 1R de la tirosina quinasa del receptor estudio matriz con HT-29. Tomados en conjunto, se han identificado nuevos biomarcadores para CCR metastásico a través de la matriz de la angiogénesis-anticuerpo y los estudios de matriz de señalización intracelular. El presente estudio sugiere que esos nuevos biomarcadores pueden ser utilizados como biomarcadores de pronóstico de CRC, y como posibles objetivos para la terapia CRC metastásico
Visto:. Chung S, S Dwabe, Elshimali Y, Sukhija H, AroH C, Vadgama JV (2015) La identificación de nuevos biomarcadores para el cáncer colorrectal metastásico utiliza matriz angiogénesis-anticuerpo y matriz de señalización intracelular. PLoS ONE 10 (8): e0134948. doi: 10.1371 /journal.pone.0134948
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: 5 de Noviembre, 2014; Aceptado: July 15, 2015; Publicado: 10 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Chung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud (NIH, NCI, NIMHD, NCATS) Subvenciones a JV Vadgama: U54 CA143931, U54MD007598, UL1TR000124. S. Steven Chung es un erudito con el apoyo de la Clínica de Investigación de Desarrollo de la Educación y de la carrera por el NIMHD 5MD007610, premio piloto de U54MD007598 y apoyo al desarrollo de la carrera U54CA143931
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia .
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y la segunda en mujeres en todo el mundo, lo que representa aproximadamente 608.000 muertes en todo el mundo [1]. A pesar de una mejora considerable en las modalidades terapéuticas, más del 50% de los pacientes con CCR finalmente desarrolló la enfermedad recurrente y metástasis que conduce a la muerte dentro de los 5 años del diagnóstico [2]. La metástasis se produce en una fase de la progresión del tumor por las células metastásicas variantes que poseen actividades invasivos se caracterizan por un aumento de la migración celular, la invasión de tejidos, y la colonización de órganos. Hasta la fecha, los mecanismos que provocan la metástasis CRC no se entienden completamente.
Cáncer biomarcadores específicos juegan un papel importante en la detección de cáncer, el pronóstico, prevención y tratamiento. Durante las últimas cuatro décadas, se han hecho esfuerzos significativos para caracterizar biomarcadores útiles para el CCR [3-5]. Sin embargo, no hay biomarcadores valiosos para CRC metástasis. Por lo tanto, es esencial para identificar nuevos biomarcadores que pueden usarse para predecir el potencial metastásico de CRC, servir como indicadores de pronóstico y servir como dianas celulares para la terapia dirigida en CRC. En nuestro estudio, hemos utilizado los arrays de anticuerpos relacionados con la angiogénesis con CRC líneas celulares primarios y metastásicos para identificar y caracterizar los nuevos biomarcadores asociados con la metástasis del cáncer colorrectal.
La angiogénesis y el desarrollo de las metástasis son intrínsecamente conectada. Los datos experimentales sugieren que las metástasis tumorales se ve influenciada por factores solubles secretadas desde el tumor original [6-8]. En este documento, se investigaron los perfiles de expresión de proteínas relacionadas con la angiogénesis específico para identificar genes conjunto angiogénesis metástasis. Inicialmente, se estudiaron dos líneas celulares de cáncer colorrectal SW480 y SW620 isogénicas. La línea celular de cáncer primario SW480 fue derivada de carcinoma de colon en estadio B de Dukes obtenida de un paciente masculino de 50 años de edad y la variante SW620 metastásico fue derivado de tumor del mismo paciente con metástasis a los ganglios linfáticos [9]. Dado que la variación de los antecedentes genéticos se puede evitar en gran medida para estas dos líneas celulares, que constituyen un modelo único para el estudio de la metástasis del cáncer colorrectal. A continuación, estudiamos otro par de líneas celulares de cáncer primarios y metastásicos, HT-29 y T84. T84 fue derivado de las células de CRC que había metástasis en el pulmón [10].
Varias citoquinas pro-inflamatorias liberadas por las células inmunes innatas y adaptativas se han mostrado para regular el crecimiento de células de cáncer y contribuir a la promoción de tumores y la metástasis . Entre estos, la interleucina-6 (IL-6) realiza un lugar central en el desarrollo del cáncer humano y la metástasis. Un aumento de la expresión de IL-6 se ha asociado con un pronóstico desfavorable en pacientes con diversos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de colon [11]. Varios estudios han encontrado un incremento en la expresión de IL-6 en los pacientes con CRC, donde IL-6 niveles están elevados en el suero de los pacientes y en el tejido tumoral en sí [12-13]. IL-6 expresión se asoció con el estadio del tumor, tamaño, metástasis y la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal [14]. Basándose en estas observaciones, se trataron células de cáncer colorrectal con IL-6 para inducirlos a llegar a ser más invasivo y metastásico. Monitorizamos cambios en el fenotipo de transición epitelial-mesenquimal, marcador de células Oct-4 y el controlador de EMT STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3) fosforilación madre en respuesta a tratamiento con IL-6 de una manera dependiente de la dosis. Nuestro estudio proporciona evidencia adicional sobre la CRC fisiopatología metástasis, y lo más importante, el descubrimiento de nuevos biomarcadores y dianas farmacológicas potenciales para la terapia CRC metastásico.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer y de citoquinas
SW480, SW620, HT-29, RKO, T84 y DLD-1 CRC líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). línea celular de colon humano normal FHC (CRL-1831) también se adquirió en la ATCC. Se mantuvieron en un cultivo monocapa en DMEM /F12 (medio de Eagle modificado por Dulbecco) con suero bovino fetal al 10%, 2,5% de L-glutamina y 0,5% de penicilina /estreptomicina largo de este estudio. IL-6 se adquirió de Sigma (número de catálogo: I3268, Sigma, St Louis, MO). Se añadió IL-6 en el cultivo celular a 1, 5, 10 unidades por ml según sea necesario. Una unidad se define como la cantidad de IL-6 requerida para inducir la proliferación media-máxima de las células T-1165
in vitro
.
Array de anticuerpos relacionados con la angiogénesis
Human Kit de angiogénesis matriz fue adquirido de R & amp; D Systems (número de catálogo ARY007, Minneapolis, MN, EE.UU.). 1 x 107 células fueron lavadas con PBS 1X y se solubilizaron con tampón de lisis 1X proporcionado en el kit. La membrana anticuerpo angiogénesis se colocó en el 4-bien multi-plato. se añadieron 2 ml de tampón de bloqueo en cada matriz de la membrana. La membrana se incubó durante 1 hora en una plataforma oscilante. Después de la incubación, se retiró el tampón de bloqueo. La membrana anticuerpo se lavó dos veces con el tampón de matriz de lavado 1X y se colocaron 1,5 ml de lisados celulares sobre la membrana. La membrana se incubó durante la noche a 4 grados Celsius en un agitador orbital. La membrana se lavó con 20 ml de tampón de lavado 1X matriz y se continuó la incubación en el agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. se añadieron 2 ml de solución de estreptavidina-HRP sobre la membrana. Se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, se realizaron tres lavados con tampón 1X gama de lavado. La membrana se lavó y se trató con Lumi Glo y peróxido. El sistema de documentación de gel Bio-Rad (Bio-Rad, número de catálogo 170-8195, Hercules, CA, EE.UU.) se utilizó para tomar imágenes detalladas de la matriz utilizando el programa Quantity One mediante la función Chemi Doc XRS. Para cuantificar las matrices, se utilizó el software Image J. Todas las matrices se midieron tres veces y se presentan con desviaciones estándar
Señalización Intracelular matrices
PathScan Kit matriz de señalización intracelular fue adquirido de Señalización Cell Technology (Tecnología de Señalización Celular, Beverly, MA;. Catálogo#7323). Para HT-29 y DLD-1, IL-6 fue pre-tratadas y se prepararon lisados celulares. lisados de proteínas enteras se han preparado utilizando tampón de lisis que fue proporcionado en el kit. 100 l de cada uno de los lisados se colocaron en la ventana de membrana de la matriz de anticuerpo-deslizante. El portaobjetos tratados lisado se incubó durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital. El portaobjetos se lavó con 100 l de tampón 1X array de lavado y se incubó en el agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente. Este procedimiento se repitió tres veces más. se añadieron 75 l de 1X de detección de anticuerpos de cóctel a cada uno de los 16 pocillos y se cubrieron con una cinta de sellado proporcionada en el kit. Se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, se realizaron tres veces de lavados y el portaobjetos se incubó durante 30 minutos con estreptavidina unido a HRP 75 l 1X. El portaobjetos se lavó y se trató con Lumi Glo y peróxido. Se utilizó el sistema de documentación de gel Bio-Rad para tomar imágenes detalladas de la matriz mediante el software Quantity One usando la función XRS ChemiDoc.
Se activa los receptores tirosina quinasa matrices
Las células cancerosas se lavaron con PBS que contiene 100 mmol /L de Na
3Vo
4 y solubilizado en tampón de lisis. 300 g de proteína total se incubaron con matrices Humanos fosfo-RTK (R & amp; D Systems, número de catálogo ARY001B, y Minneapolis, MN, USA). Brevemente, las matrices se incubaron con lisados de células completas durante la noche a 4 ° C con agitación y se lavaron con el tampón de lavado suministrado. Las matrices fueron incubadas con anticuerpos anti-fosfotirosina-HRP durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador de plataforma oscilante antes de la incubación con un reactivo quimioluminiscente y exposición de la película. Las matrices fueron escaneados con el sistema Bio-Rad Molecular Imager Gel Doc XR.
análisis Western blot
Los cultivos monocapa de líneas celulares respectivas en una confluencia del 80-90% se lisaron usando 100 l de tampón RIPA (Thomas Scientific). Tris-glicina (Bio-Rad) geles se cargaron con 50 a 100 g de lisados. Después de ejecutar la electroforesis en gel, el gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa durante 2 horas. La membrana se bloqueó durante 1 hora en 5% de BSA o 5% de leche desnatada a 4 ° C. La membrana se lavó 3 veces con 1xTTBS y incubó durante la noche con el anticuerpo primario a 4 ° C. Los anticuerpos primarios de factor de coagulación III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF-A, la endotelina I, CXCL16, TIMP-1, anfirregulina, endostatina, angiogenina y GM-CSF se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos primarios para STAT3, pSTAT3, E-cadherina, vimentina, Oct-4, VEGF y β-actina fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Después de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP), las bandas de proteínas se desarrollaron con los reactivos de quimioluminiscencia. Las imágenes se tomaron blot utilizando el sistema de doc XR gel de imágenes molecular Bio-rad. blot densidad banda de proteína occidental se midió mediante el software Image J y presentó después normalizado por el mantenimiento de la casa de proteína β-actina. FHC normal (CRL-1831) línea de células de colon se utilizó como referencia para la comparación expresión de la proteína mediante la medición de la intensidad de banda como 1.0.
Resultados
proteínas de la firma de la angiogénesis específico están regulados a la baja en el CCR metastásico líneas celulares de SW620 y T84
En primer lugar, se optó por dos líneas celulares de cáncer de colon SW480 y SW620 isogénica y la línea celular HT29 primario y metastásico línea celular T84 para examinar los perfiles de expresión de proteínas angiogénesis. Como control, línea de células de colon normal FHC (CRL-1831) el perfil se analizó en paralelo. Hemos utilizado el kit matriz angiogénesis humana (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y monitoreado los perfiles de expresión de proteínas relacionadas con la angiogénesis. Los lisados celulares se prepararon a partir de las células de cáncer de colon y células de colon normales, respectivamente. Cada lisado se coloca sobre la membrana de matriz, se incubaron durante la noche y detectado por los niveles de expresión de 55 proteínas asociadas con la angiogénesis humana. La coordenada de 55 proteínas de la matriz de la angiogénesis fue presentado en la Tabla S1. Los niveles de expresión de proteína se midieron por el software Image J y presentados como la densidad media pixel normalizado por los controles positivos. Encontramos seis proteínas de la angiogénesis se downregulated específicamente tanto en las células SW620 y T84 metastásicos: factor de coagulación III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF-AA /AB, endotelina I y CXCL16 (Tabla 1 y Fig S1). Por el contrario, el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) expresión fue claramente upregulated en SW620 (14 pliegues) y T84 (36 pliegues), respectivamente. Además, se encontró que TIMP-1, anfirregulina, endostatina se upregulated en SW620, mientras que en downregulated T84. Angiogenina se downregulated en T84 y GM-CSF se downregulated en SW620. Las funciones celulares de estas proteínas relacionadas con la angiogénesis se presentan en la tabla 2. En conjunto, nuestros datos sugieren que hay un gen firma angiogénesis establecer específica a las células de cáncer de colon metastásico.
arrays de la angiogénesis se realizaron con FHC, SW480, SW620, HT29 y líneas de células T84. manchas de matriz se tomaron y se analizaron mediante el software Image J. Los niveles de expresión se presentaron como una densidad media de píxeles normalizado por las referencias puntuales positivas.
existe la angiogénesis Común firma genética en el CCR metastásico líneas celulares SW620 y T84
Para identificar los genes de la angiogénesis comunes específicas para CCR metastásico, que se han alineado los arrays de anticuerpos a partir de SW480 y SW620 primario y metastásico T84 juntos. Pensamos que si hay una firma metástasis universal en la angiogénesis, se debe mostrar el mismo patrón de expresión incluso de las diferentes líneas celulares de CRC metastásicos. SW480 primaria isogénica fue seleccionada como una línea celular de referencia. SW480 y dos líneas de células metastásicas SW620 y la comparación de matrices T84 revelaron las diferencias de expresión de proteínas de la angiogénesis. Nos encontramos CXCL16, GM-CSF, endostatina, endotelina-1, IGFBP-3 y PDGF /AB, BB niveles de expresión estaban claramente reducida en las células SW620 y T84 metastásicos.
análisis de Western blot confirmó la matriz de datos angiogénesis
Para verificar los datos de la matriz de la angiogénesis, se realizó transferencias de Western de la identificadas las proteínas y se midieron los niveles de expresión en las células normales y cancerosas colorrectales. De acuerdo con la matriz de datos, el factor de coagulación III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF-A, endotelina I y CXCL16 se downregulated específicamente en tanto SW620 y T84 (Fig 1). línea de células de colon normal FHC fue utilizado como una celda de referencia y mide como un pliegue 1.0. Encontramos las seis proteínas se upregulated en líneas celulares primarias SW480 y HT29 en comparación con FHC, entonces downregulated en líneas de células metastásicas de SW620 y T84. Otro conjunto de proteínas de la angiogénesis, TIMP-1, anfirregulina, endostatina se upregulated en SW620 mientras que en downregulated T84 (Figura 2). Esto podría reflejar que las proteínas funcionan en la especificidad de órganos como SW620 metástasis en los ganglios linfáticos, mientras que T84 metástasis en pulmón. Angiogenina se reguló en HT29 y downregulated en T84. Por último, GM-CSF se reguló en SW480 mientras que en downregulated SW620. Nuestros resultados indican que estos genes de firma angiogénesis representan la metástasis CRC y se pueden utilizar como nuevo factor de pronóstico, así como dianas celulares para la terapia de CRC.
análisis Western se realizaron con la línea celular normal y cáncer colorrectal primario y metastásico líneas celulares. proteínas de la angiogénesis identificados a partir de la matriz de estudio, factor de coagulación III, IGFBP-3, DPP IV, PDGF-A, endotelina I y CXCL16 se corrieron en el gel y se analizaron. Las bandas de proteínas se midieron para la intensidad y cuantificaron utilizando células colon normal FHC como referencia.
Immunoblotting se realizó para el VEGF upregulated específicamente en el cáncer de colon metastásico y TIMP-1, anfirregulina, endostatina, angiogenina y GM -CSF. los niveles de expresión de proteínas se midieron y normalizado por la expresión normal de células de colon FHC.
citocinas IL-6 inducida por el tratamiento transición epitelio-mesenquimal Octubre-4 y la expresión de las líneas celulares de CRC primarios humanos
Desde la firma se determinó la angiogénesis para las células metastásicas CRC establecidos, continuación desea encontrar los cambios de respuesta celular a tratamiento con IL-6. IL-6 se considera como un tumor importante factor promotor en diversos tipos de cáncer incluyendo el linfoma, melanoma, así como cáncer de mama, de ovario, de páncreas, de próstata y colorrectal. Más importante aún, estudios recientes informaron de que los tumores humanos se hicieron más invasivo y metastásico tanto autocrina y paracrina IL-6 de señalización [26]. Pusimos a prueba la hipótesis de que el tratamiento con IL-6 puede inducir a las líneas celulares de CRC primarias más invasiva y agresiva a través del proceso de transición (EMT) epitelio-mesenquimal. líneas celulares de CRC primarios HT-29 y DLD-1 fueron tratadas con IL-6 en un gradiente de 1 ~ 10 unidades /ml durante 72 horas. Los lisados celulares se prepararon y se aplicaron a análisis de Western blot para monitorear los niveles de expresión de biomarcadores EMT. También determinó la activación de STAT3 simultáneamente ya que se sabe STAT3 ser fosforilados por JAK (Janus quinasa) que se activa por IL-6 desencadenado de transducción de señales [27]. Por último, hemos examinado la expresión de marcadores de células madre embrionarias Oct-4. Oct-4 es uno de los factores de transcripción más críticos para la tumorigénesis. Oct-4 expresión también se asocia con rasgos de células madre de cáncer, así como la invasividad tumoral.
STAT3 se fosforiló en el tratamiento de IL-6 de una manera dependiente de la dosis en ambas líneas HT-29 y células DLD-1 ( Fig 3). pSTAT3 expresión se mejoró con el tratamiento de IL-6 de 1 unidad /ml condición mientras que el total de los niveles de expresión de STAT3 sigue siendo el mismo. Esto es consistente con la IL-6 activa JAK mediada vía de la fosforilación de STAT3. Para EMT fenotipo, la expresión EMT biomarcador E-cadherina estándar se redujo, mientras que la expresión del marcador mesenquimal vimentina se elevó tras el tratamiento de IL-6 (Fig 3A y 3B). Finalmente, Oct-4 expresión se indujo en células HT-29 y DLD-1 con la IL-6 (5U /ml) e IL-6 (10 u /ml) tratamientos, respectivamente. Estos resultados confirman que la IL-6 provoca proceso de EMT en células CRC humanos. Por otra parte, la expresión simultánea de Octubre-4 y pSTAT3 con datos de tratamiento de IL-6 sugiere existen los ejes IL6-JAK-STAT3-Oct-4 de señalización en las células CRC y contribuye a la metástasis tumoral y la invasión. De acuerdo con nuestro estudio, Chang y colaboradores han demostrado recientemente el aumento de los niveles de IL-6 en el borde delantero de los tumores de mama humanos invasivos [28]. Encontraron el aumento de los niveles de IL-6 en el tumor del borde de ataque y se correlacionó positivamente con la fase avanzada, lo que sugiere una relación mecánica entre la producción de células tumorales de la IL-6 y la invasión.
Para investigar la EMT y STAT3 activación de humana células de CRC, de citoquinas IL-6 se trató en un nivel de gradiente de 0, 1, 5 y 10 u /ml. A: HT-29 se trató con un gradiente de IL-6, a continuación, se observó la fosforilación de STAT3 y fenotipo EMT. Otra importante marcador de células madre Oct-4 expresión también se controló. B:. LDN-1 células fueron tratadas con IL-6 y se sometieron a los análisis occidentales
línea celular SW620 CCR metastásico e IL-6 tratamiento de HT-29 y DLD-1 mostraron la misma intracelular señalización de patrón de activación
Desde fenotipo EMT inducida por el tratamiento con IL-6, la activación de STAT3 y la activación de Oct-4, el próximo querido determinar que las vías de señalización intracelulares se activan tras el tratamiento de IL-6. Con este fin, se utilizó el kit de señalización intracelular PathScan Array (Cell Signaling Technology, número de catálogo 7323) y se realizó el análisis de matriz como se describe en Métodos. Las coordenadas de la matriz de la señalización intracelular también se presentó (S2 Tabla). En primer lugar, hemos investigado las dos líneas de células SW480 y SW620 isogénicas y comparó la activación de la señalización. Los lisados celulares se prepararon y se incubaron durante la noche a la membrana matriz de señalización intracelular. El día siguiente, la membrana anticuerpo se incubó con estreptavidina unido a HRP 1X y se visualizó con Lumi Glo y peróxido. Las imágenes fueron tomadas usando el Bio-rad sistema de documentación de geles. Como se muestra en la figura 4, los niveles de fosforilación de STAT3, Akt, AMPKα y malas fueron elevados en comparación con SW620 SW480 primaria (figura 4A). Las mismas proteínas fueron fosforilados en niveles muy modestos en SW480. Nuestros resultados sugieren que STAT3, Akt, AMPKα y vías de señalización BAD se han mejorado en líneas celulares de CCR metastásico.
Para controlar la señalización intracelular, se observó la activación de componentes de señalización importante el uso de arrays de anticuerpos. A: Dos líneas isogénicas celulares de CRC, SW480 y SW620, se analizaron para la activación de señalización. los niveles de fosforilación de STAT3, Akt, AMPKα y proteínas BAD fueron elevados en comparación con SW620 SW480 células. B: HT-29 se trató con IL-6 y se sometió a estudio intracelular matriz de señalización. Curiosamente, el mismo conjunto de proteínas de STAT3, Akt, AMPKα y los niveles de fosforilación de BAD fueron todos aumentó tras el tratamiento de IL-6. C: células DLD-1 fueron tratadas con IL-6 y se observaron para la activación de componentes de señalización. DLD-1 también mostró la STAT3, Akt, AMPKα y mejora de la fosforilación de BAD sobre la estimulación de IL-6.
continuación desea saber si los mismos componentes de señalización se activaron tras el tratamiento con IL-6 en la primaria CRC líneas celulares. Por lo tanto, se trataron HT-29 y DLD-1 con IL-6 a la dosis 10 u /ml y examinamos las vías de señalización intracelular utilizando las mismas matrices de anticuerpos. Curiosamente, IL-6 tratados HT-29 y DLD-1 también mostraron STAT3, Akt, AMPKα y la activación de la señalización de BAD en las matrices de anticuerpos (Fig 4B y 4C). Nuestros datos sugieren que existe común de activación en las células de CRC humanos señalización firma, y la firma puede ser utilizado como un biomarcador pronóstico o objetivos para la terapia de CRC en un entorno clínico.
tirosina quinasa del receptor de matriz reveló niveles de fosforilación de EGFR, HER2, insulina R y IGF1R se redujeron al tratamiento con IL-6 de HT-29
respuesta celular de cáncer de mayor investigación para el tratamiento con IL-6. Dado que hemos examinado la señalización intracelular y encontramos la activación de la firma, hemos ampliado nuestro estudio para la activación de la tirosina quinasa del receptor. Con este fin, hemos utilizado la matriz humana de fósforo-tirosina quinasa (R & amp; D Systems, número de catálogo ARY001B) Kit y analizado IL-6 efectos sobre las células humanas CRC. células HT-29 fueron tratadas con IL-6 (10 u /ml) y se lisaron con tampón de lisis proporcionado. ~ 300 g de proteínas totales se colocaron en la membrana matriz de fósforo-RTK humana y se incubó durante la noche. La membrana de anticuerpo se incubó con anticuerpo secundario y las manchas de proteínas positivas se detectaron por quimioluminiscencia. Las coordenadas de esta matriz de fósforo-RTK humano también se presentó (S3 Tabla). Se encontró que el EGFR y receptores HER2 estábamos simultáneamente fosforilada en el TC-29 (Figura 5A). receptor de la insulina y el receptor de IGF 1R también se fosforilaron en HT-29. Sin embargo, tras el tratamiento con IL-6, los niveles de fosforilación de EGFR, receptor HER2, la insulina y los receptores de IGF R 1R se redujeron claramente (Fig 5B). Nuestros datos sugieren que la IL-6 proceso EMT inducida está asociada con la regulación negativa de varios receptores de tirosina quinasa fosforilados.
Hemos investigado la tirosina quinasa del receptor de la fosforilación con tratamiento con IL-6 en HT-29. A: Control sin tratar serie HT-29 mostró el EGFR fosforilado, HER2, Insulina R y receptores de IGF-1R. B:. Cuando tratamos HT-29 con IL-6, la fosforilación de EGFR, HER2, Insulina R e IGF-1R se abolió
También investigaron SW480 células sin tratar y tratados con IL-6 , SW620 y las células T84 para los perfiles de RTK (Fig 6). Sin embargo, en esas líneas de células, los receptores tirosina quinasas no se activaron. Esto es probablemente debido a la línea de especificidad de células de cáncer colorrectal. Los análisis de las líneas celulares de cáncer más todavía están por verse.
Se investigó la fosforilación de la tirosina quinasa del receptor con el tratamiento con IL-6 en SW480. Si no se trata SW480 control y arrays SW480 IL-6 tratados mostraron ninguna activación RTK. Por otra parte, la línea celular de cáncer metastásico SW620 y T84 no mostraron la activación de RTK, tampoco.
Discusión
La principal causa de muerte por cáncer colorrectal (CCR) es de la metástasis tumoral. Casi el 50% de los pacientes con CRC en última instancia, desarrolló la enfermedad recurrente y metástasis que conduce a la muerte dentro de los 5 años del diagnóstico. La metástasis se produce en una fase de progresión tumoral por las células metastásicas variantes que poseen actividades invasivas que se caracterizan por el aumento de la migración celular, invasión de tejidos, y la colonización de órganos.
En nuestro estudio, la hipótesis de que puede haber un conjunto de genes firma que se activa selectivamente (o inactiva) en el cáncer colorrectal metastásico. Pusimos a prueba esta hipótesis mediante la investigación de líneas de células metastásicas y primaria CRC para sus patrones específicos de expresión de proteínas de la angiogénesis. Nuestro estudio ha identificado un nuevo gen subconjunto específico de las células con CCR metastásico. Inicialmente se analizaron las líneas celulares de CRC establecidos, seguido de tratamiento con la citocina IL-6 para inducir fenotipo metastásico en células CRC humanos. IL-6 provocó la activación de STAT3 concurrente y expresiones de biomarcadores de la EMT. La investigación de la señalización y los receptores de tirosina quinasa intracelular arrays reveló más nuevo gen de la activación de la firma en estas células de CRC. En general, nuestro estudio identifica nuevos biomarcadores para CCR metastásico que pueden ser utilizados no sólo como un factor pronóstico (s), sino también como objetivos novedosos para los CRC metastásico.
La linfa metástasis es una de las principales preocupaciones en el CCR. Elegimos dos líneas isogénicas células SW480 y SW620 CRC, y descubiertas las proteínas-angiogénesis específica que están regulados al alza y regulados a la baja en las células SW620 metastásicos ganglios. Curiosamente, cuando examinamos de pulmón metastásico CRC T84 línea celular, encontramos ciertas proteínas de la angiogénesis fueron regulados a la baja tanto en SW620 y T84, mientras que otras proteínas se downregulated específicamente al uso de SW620 o T84. proteínas comúnmente regulación a la baja; CXCL16, GM-CSF, la endotelina-1, endostatina, IGFBP-3 y PDGF-AB /BB pueden constituir una firma metástasis universal en CRC. Mientras tanto, la proteína específica SW620, por ejemplo factor de coagulación III, puede ser un factor de angiogénesis de los ganglios linfáticos se indica. Del mismo modo, las proteínas específicas T84, por ejemplo, angiogenina y anfirregulina, probablemente las proteínas de la angiogénesis metastásicos pulmonares-específico. Nuestros resultados indican que en las células de cáncer de colon primarios, PDGF se expresan mientras que en las células de cáncer de colon metastásico, la expresión de PDGF puede ser downregulated. Sin embargo, la señalización de PDGF del estroma de células cancerosas metastásicas puede sobreexpresa en pacientes con cáncer de colon. Queda por ver si este es el caso en muestras clínicas de los tumores colorrectales.
epitelio-mesenquimal transición (EMT), un proceso de transdiferenciación caracterizado por una disminución de los marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y el aumento de los marcadores mesenquimales como vimentina se han implicado a desempeñar un papel en la que las células epiteliales transformadas adquieren la capacidad de invadir, resistir la apoptosis y metástasis [29]. En particular, el proceso de EMT a menudo resulta en la expresión de rasgos de células madre del cáncer [30]. Hemos tratado a células de CRC con citocina IL-6 e inducida fenotipo EMT simultáneamente con pSTAT3 y Oct-4 expresión. Tanto autocrina y paracrina de señalización de IL-6 inducida por la agresividad del tumor. Nuestros datos son consistentes con los datos clínicos en los que la IL-6 juega un papel en la tumorigénesis y la metástasis (28). Por otra parte, hemos demostrado los componentes de señalización intracelular específicas que son activadas por IL-6, STAT3, Akt, AMPKα y malo. Por último, hemos descubierto que (EGFR, HER2) actividades específicas de la tirosina quinasa del receptor están regulados a la baja por la IL-6 en células HT-29 CRC humanos. Otros estudios están orientados hacia el desarrollo de inhibidores de cócteles para estos nuevos biomarcadores de CRC en una aplicación clínica. En resumen, nuestro estudio ha identificado una vía potencial para la terapia dirigida para el CRC utilizando los nuevos biomarcadores para el CCR metastásico.
Apoyo a la Información
S1 Fig. relacionados con la angiogénesis perfiles de expresión de proteínas de FHC, SW480, SW620, HT-29 y T84.
líneas celulares de cáncer colorrectal primario y metastásico SW480, SW620, HT29 y T84 fueron analizadas para determinar los perfiles de expresión de proteínas angiogénesis. SW480 expresó factor de coagulación III, CXCL16, GM-CSF, la endotelina 1, endostatina, IGFBP-3, PDGF-AB /BB claramente mientras que no expresan VEGF. SW620 expresó VEGF mientras que el factor de coagulación downregulated III, CXCL16, GM-CSF, la endotelina 1, endostatina, IGFBP-3, expresiones PDGF-AB /BB. En paralelo, las líneas celulares de cáncer colorrectal HT-29 y T84 se analizaron para los perfiles de expresión de proteínas de la angiogénesis. En HT-29. DPP IV, TIMP-1, angiogenina, endotelina, anfirregulina y PDGF /AB, BB proteínas se expresaron mientras que VEGF no se expresa en HT-29. En T84, el VEGF se expresó mientras DPP IV, TIMP-1, angiogenina, endotelina, anfirregulina y PDGF /AB, BB se redujeron los niveles de expresión
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134948.s001 gratis (JPG)
S2 Fig. alineación matriz angiogénesis humana para la firma metástasis.
a identificar las proteínas comunes que se upregulated o downregulated selectivamente en líneas celulares de CCR metastásico, dos líneas de células metastásicas CRC, SW620 y T84, sus matrices angiogénesis se alinea con la línea celular SW480 primaria. línea celular SW480 CRC primaria se utilizó como una línea celular de referencia, se presentó conjunto de células SW620 linfáticos metastásicos. En paralelo, serie T84 de pulmón metastásico se alineó. VEGF se regula positivamente tanto en las células SW620 y T84. Por el contrario, CXCL16, GM-CSF, endostatina, endotelina-1, IGFBP-3 y PDGF /AB, BB proteína niveles de expresión se redujeron tanto en las células SW620 y T84
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134948.