Extracto
A medida que el marcador de células madre CD133 pentaspan fue demostrado que se unen el colesterol y para la localización de las protuberancias de la membrana plasmática, se investigó una posible función de CD133 en la endocitosis. El uso de la estrategia de CD133 siRNA desmontables y cáncer de colon humano no diferenciada Caco-2 células que constitutivamente sobre-expresa CD133, nos ofrecen por primera evidencia directa de tiempo para un papel de CD133 en la acumulación intracelular de compuestos extracelulares etiqueta fluorescente. Evaluada usando anticuerpo monoclonal AC133, CD133 desmontables se muestra para mejorar la captación Alexa488-transferrina (Tf) en células Caco-2, pero no tuvo impacto en FITC-dextrano o FITC-cólera-toxina. La ausencia de efecto de la caída de CD133 Tf reciclaje establecido un papel para CD133 en la inhibición de la endocitosis Tf en lugar de en la estimulación de la exocitosis Tf. El uso de inhibidores previamente identificados de vías endocítica conocidos y el impacto positivo de CD133 caída en la captación celular de nanocápsulas lipídicas sintéticas clathrin endocitosis apoyó que el impacto sobre la endocitosis CD133 se atribuye principalmente a la vía de clatrina. Además, la extracción de colesterol con metil-β-ciclodextrina hasta la captación de Tf regulado en mayor intensidad en el CD133
alta situación que en el CD133
bajo situación, lo que sugiere un papel para el colesterol en el efecto inhibidor de CD133 en la endocitosis. Curiosamente, el tratamiento de células con el anticuerpo AC133 regulado por la absorción de Tf, lo que demuestra que extracelular directa la unión a CD133 podría afectar a la endocitosis. Además, la citometría de flujo y microscopía confocal estableció regulación que abajo de CD133 mejoró el acceso a la TfR desde el espacio extracelular, proporcionando un mecanismo por el cual inhibe la absorción de CD133 Tf. Como Tf está involucrado en el suministro de hierro a la célula, se investigaron los efectos de la suplementación de hierro y la privación sobre la expresión de CD133 /AC133. Ambos han demostrado una regulación por disminución dependiente de la dosis aquí discutido a la luz de los efectos transcripcionales y post-transciptional. Tomados en conjunto, estos datos se extienden nuestro conocimiento de la función de CD133 y subrayan el interés de explorar aún más la red CD133-Tf-hierro
Visto:. Bourseau-Guilmain E, Griveau A, JP Benoit, Garcion E ( 2011) la importancia de las células madre marcador Prominin-1 /CD133 en la captación de transferrina y Metabolismo del hierro en el cáncer de colon humano células Caco-2. PLoS ONE 6 (9): e25515. doi: 10.1371 /journal.pone.0025515
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Marzo 22, 2011; Aceptado: 7 Septiembre 2011; Publicado: 26 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Bourseau-Guilmain et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el "Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale", el "Axe Cellules Souches et cáncer" en el "Cancéropôle Gran Oeste" y por "la Liga Contra el cáncer" a través de un "Equipe Labellisée 2007" subvención . Erika Bourseau fue inicialmente un compañero de doctorado con el "Conseil Général de Maine-et-Loire" y luego un compañero de doctorado con el "Comité Departamental de Maine-et-Loire de la liga Contra el Cáncer". Audrey Griveau era un compañero de doctorado con el "Conseil Général de Maine-et-Loire". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Después de la utilización de nuevos anticuerpos monoclonales producidos contra neuroepitelial y las células madre hematopoyéticas, CD133, también conocida en humanos y roedores como Prominin-1, fue aislado por primera vez y se clonó en 1997 [1], [2], [ ,,,0],3]. CD133 es una proteína transmembrana de cinco dominio, compuesta por una cola extracelular N-terminal, dos pequeños bucles citoplásmicos, dos bucles extracelulares grandes que contienen siete sitios potenciales de glicosilación y una cola corta intracelular C-terminal que pueden ser empalmados alternativamente [4] o fosforilada [5].
a pesar de los esfuerzos de investigación constante, sigue siendo desconocida la función biológica de CD133. Entre los fenotipos conocidos, se ha demostrado que un CD133 truncada, que no se transporta a la membrana celular, conduce a la degeneración de la retina humana [6]. Destacando esta importante observación, el análisis de una generación de ratones con deficiencia de CD133 reveló que, mientras que se expresa muy temprano durante el desarrollo de la retina, CD133 actuó como un regulador clave de la morfogénesis de disco y que la pérdida de CD133 causado degeneración de los fotorreceptores y la ceguera [7]. Además, AC133, un epítopo glicosilada de la proteína CD133 inicialmente asociado con las células madre embrionarias [8] y una variedad de células madre somáticas, fue descrito ampliamente como un marcador de células madre de cáncer putativo en la sangre, cerebro, colon, próstata, pulmón, mama , cánceres de hígado y piel [9], [10]. Otras investigaciones revelaron que CD133 se vincula con el metabolismo celular como un gen de respuesta de glucosa en miotubos [11], así como proporcionar evidencia de estrés bioenergético [12] y de no exposición a alta tensión de oxígeno en gliomas (Bourseau-Guilmain et al. presentado).
a nivel subcelular, CD133 se localiza preferentemente en las protuberancias de la membrana plasmática y microvellosidades [13]. A partir de ahí, CD133 puede unirse al colesterol [14] e interactuar con gangliósidos [15]. Como salientes de membrana y microvellosidades facilitar la ampliación de la superficie de la membrana con el fin de aumentar la exposición de células al espacio extracelular, estas observaciones proporcionan pistas importantes para determinar la función molecular de CD133, sobre todo teniendo en cuenta los intercambios celulares con el microambiente. De hecho, CD133 se encuentra en vesículas de membrana distintos de los exosomas que se publicaron a partir de células epiteliales durante la diferenciación [16].
De forma paralela a estas señales de afuera hacia adentro, colesterol y esfingolípidos se segregan en microdominios de membrana de lípidos balsa implicados en el interior la señalización de salida privado y la endocitosis [17], [18]. Teniendo en cuenta la estrecha relación entre CD133 y colesterol, además de su posible relación con los esfingolípidos y la exposición al espacio extracelular, la hipótesis de que CD133 está implicada en la endocitosis: un proceso fundamental por el cual compuestos extracelulares se internalizan y se distribuyen a los compartimentos intracelulares
en el presente estudio, utilizando la estrategia de la interferencia del ARN y el cáncer de colon humano indiferenciado Caco-2 células que constitutivamente sobre-expresado CD133 /AC133, nos ofrecen por primera vez pruebas para un papel de CD133 en la acumulación intracelular de compuestos extracelulares , notablemente ejemplificado por la transferrina (Tf). Además de los datos que establecen un papel para CD133 en la endocitosis, también demuestran que CD133 en sí está regulada por el hierro, lo que apoya la existencia de una red de Tf-CD133-hierro. Estas nuevas observaciones se discuten a la luz del patrón de expresión de CD133 y el conocimiento actual en el campo.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
carcinoma de colon humano indiferenciado Caco- 2 células (American Type Culture Collection: HTB-37 ™) se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2 en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Lonza, Levallois-Perret, Francia), que contiene 4,5 g /l de glucosa y L-glutamina. El medio se añadió con 10% de suero bovino fetal (FBS; Lonza, Verviers, Bélgica), 1% de antibióticos (10 unidades /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina, 25 mg /ml de anfotericina B; Sigma-Aldrich, Saint- Louis, EE.UU., MO) y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA; Lonza, Verviers, Bélgica). Cuando las células alcanzaron 80% de confluencia, que se disocian en 0,5% tripsina porcina y 0,2 g /ml de EDTA (Lonza, Verviers, Bélgica) antes de volver a platear en frascos de plástico no revestidas a 15 × 10
3 células /cm
2. La mitad del medio se reemplazó por medio fresco cada dos días.
siRNA desmontables de CD133
Caco-2 células se sembraron en placas de seis pocillos con 2,3 × 10
5 células por pocillo en 2 ml del medio anteriormente mencionado durante 24 h. El medio se retiró y las células fueron transfectadas con 30 nM de ARN dúplex de oligonucleótidos (Sigma-Aldrich) usando el reactivo de N-TER según las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). N-TER /complejos de siRNA fueron incubadas en células Caco-2 medio durante 48 horas a 37 ° C en una atmósfera que contiene 5% de CO
2. siRNA se retiraron a continuación y se sustituye por medio fresco durante 24 h. Una pelea secuencia se utilizó como control negativo: 5'-GUCCGGAAUUACCAUGAGUdTdT-3 '. La secuencia utilizada para llevar a cabo la inhibición selectiva de la interferencia de ARN CD133 fue 5'-CCCUUAAUGAUAUACCUGAdTdT-3 '.
AC133 immunolabeling
se recogieron las células Caco-2 expuestas a siRNA y disociada utilizando Versene (Lonza) . Las células se incubaron con 5 mg /ml de anticuerpo AC133 (Miltenyi Biotech, París, Francia) o control de isotipo IgG1k (BD-Biosciences, Le Pont-de-Claix, Francia) durante 1 hora a 4 ° C en PBS que contenía FBS al 5% y azida sódica 0,02%. Las células fueron lavadas tres veces en PBS que contenía FBS al 5% y azida sódica al 0,02%, y se incubaron durante 30 minutos a 4 ° C con anticuerpo de cabra conjugado con FITC anti-ratón IgG F (ab ') anticuerpo policlonal 2 fragmento (Dakocytomation, Trappes, Francia) a 20 mg /ml en PBS que contenía FBS al 5% y azida sódica al 0,02%. Después de tres lavados más en PBS que contenía FBS al 5% y azida sódica al 0,02%, las células se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 2% y azida sódica al 0,02%.
La citometría de flujo
Un BD FACSCalibur ™ de flujo activado por fluorescencia del citómetro y el software CellQuest ™ BD (BD-Biosciences) se utilizaron para la citometría de flujo de adquisición. El análisis se llevó a cabo utilizando el software WinMDI 2.9 (Instituto Scripps, La Jolla, CA, EE.UU.).
Síntesis de Nilo nanocápsulas lipídicas-rojos marcados (NR-LNC) guía
50 nm rojo Nilo ( NR) marcado con nanocápsulas lipídicas (LNC) (NR-LNC) que incorpora el compuesto fluorescente se prepararon NR como se describe anteriormente [19] mediante el uso de un proceso de inversión de fase que sigue a la formación de una microemulsión de aceite /agua que contiene triglicéridos (Labrafac® WL 1349, Gattefossé, Saint-Priest, Francia), un agente tensioactivo hidrófilo no iónico (Solutol® HS 15, Gmbh, Ludwigshafen, Alemania) y lecitinas (Lipoïd® S75-3, Gmbh). NR se disolvió en acetona a 1% (w /w), y la solución resultante se NR incorpora en Labrafac® a la 1:10 (w /w). Por lo tanto, 846 mg Solutol®, 75 mg Lipoïd®, 1029 mg Labrafac® que contiene NR, 89 mg de NaCl y 2,975 mg de agua se mezclaron y se calentaron bajo agitación magnética hasta 85 ° C. Tres ciclos de calentamiento progresivo y refrigeración en entre 85 ° C y 60 ° C A continuación, se dieron cuenta. Finalmente fueron seguidos por un shock irreversible inducida por dilución con 12,5 ml de 0 ° C el agua desionizada añadido a la zona de inversión de fase. exclusión por tamaño y cromatografía líquida de alta presión (HPLC) ensayos demostraron una encapsulación completa y la retención de NR como se observó anteriormente [19]. LNC fueron analizados para su distribución de tamaños utilizando un Malvern Zetasizer® Nano Series DTS 1060 (Malvern Instruments SA, Worcestershire, UK).
Internalización de transferrina (Tf), dextrano (Dx), la toxina del cólera subunidad B (CTB ) y nanocápsulas lipídicas (LNC)
El medio de células transfectadas fue removido y reemplazado por DMEM suplementado con 1% de medio de N1 libre de suero (Sigma Aldrich) durante 1 h. Los tres compuestos siguientes, Tf-Alexa 488 a 0,5 y 5 mg /ml (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), Dx-FITC a 0,5 y 5 mg /ml (Sigma Aldrich) y CTB-FITC a 1 y 10 mg /mL (Invitrogen), o en lugar, NR-LNC en 1/1000 de dilución de la suspensión inicial correspondiente así a una concentración de 100 mg /ml, a continuación se añaden al medio de 1 h. Las células fueron disociadas utilizando Versene (Lonza). Para permitir la determinación de la fracción de moléculas o partículas marcadas que se internalizan eficazmente dentro de las células, la fluorescencia extracelular se inactivó con 0,4% de azul de tripano (Sigma Aldrich). Las células fueron lavadas en PBS y se resuspendieron en PBS que contenía 2% de formaldehído y azida sódica al 0,02%. La internalización de la etiqueta fluorescente Tf, Dx, CTB y LNC fue supervisado por citometría de flujo.
se utilizaron análisis de la liberación de Tf a partir de células Caco-2 después de la internalización
siRNA
control y CD133-específicos para generar CD133
pilas de gran y CD133
bajos transfectadas Caco-2, respectivamente. Las células fueron incubadas con Tf-Alexa 488 durante 2 horas a 37 ° C /5% de CO
2 antes de que se retiró el medio extracelular, se lavó y se sustituye por medio fresco libre de Tf-Alexa 488. Después de una incubación adicional a 37 ° C /5% de CO
2 para 1 h, 2 h y 3 h, la restante intracelular Tf-Alexa 488 de fluorescencia, lo que representa la cantidad de Tf-Alexa 488 que no se recicla al compartimento extracelular, se midió por semi- citometría de flujo cuantitativa como se ha descrito anteriormente.
célula de tratamiento con inhibidores químicos de endocitosis y la captación celular de Tf
se utilizaron inhibidores químicos previamente identificados de vías endocítica conocidos como [19], [20 descrito anteriormente ], [21]. Brevemente, transfectadas Caco-2 células fueron pre-tratados con inhibidores durante 1 hora a 37 ° C en medio N1. se utilizó para inhibir mediada por clatrina transporte [22], mientras que filipin (1 g /L; Sigma-Aldrich); clorpromazina (Sigma-Aldrich 10 g /ml) y dimetilamilorida (DMA, 10 mM; Sigma-Aldrich) se utilizaron para inhibir caveolae endocitosis dependiente de [23] y macropinocytosis [24], respectivamente. agotamiento de colesterol se obtuvo por un 2 h de tratamiento previo con metil-β-ciclodextrina (MβCD, 10 mM; Sigma-Aldrich) en presencia de lovastatina (1 mg /ml; Sigma-Aldrich) [25], [26]. Posteriormente, la captación celular de 5 mg /ml Tf-Alexa 488 se controló por citometría de flujo análisis como se describe anteriormente. Para la inhibición de colesterol, 1 mg /ml de lovastatina también se mantuvo en el medio durante el tratamiento con Tf-Alexa 488.
Análisis de la absorción de Tf por las células Caco-2 después del tratamiento con el anticuerpo AC133
Caco-2 células se sembraron a 2,3 x 10
5 en placas de 24 pocillos en 400 l de medio que contenía suero. Después de un 24 h incubación inicial a 37 ° C /5% de CO
2 el medio inicial se reemplazó por medio libre de suero N1 antes de la incubación con cualquiera de 0, 5, o 10 mg /ml del anticuerpo AC133 o de control de isotipo IgG1k . Tf-Alexa 488 y luego se añadió a 5 mg /ml y se incubaron a 37 ° C /5% de CO
2 por 1 h para estudiar el impacto del tratamiento con inmunoglobulina de Tf-Alexa 488 captación. Tf-Alexa 488 captación se cuantificó por citometría de flujo como se describe anteriormente.
reconocimiento de anticuerpos del receptor de Tf en la superficie de la célula Caco-2 en función del nivel de expresión de CD133
células Caco-2 expuestos a CD133 o se recogieron y se disociaron siRNA de control usando Versene (Lonza). Las células se incubaron con anticuerpo 5 mg /ml CD71 monoclonal de ratón que reconoce el receptor de Tf (TfR o antígeno CD71) (clon M-A712, BD-Biosciences) o con 5 mg /ml IgG2a, control de isotipo κ (BD-Biosciences) a proceder para immunolabeling y citometría de flujo como se describe anteriormente para el reconocimiento de la superficie celular AC133.
Immunocytochemisty combinado con microscopía confocal de barrido láser para la identificación de AC133, CD71 y la cadena pesada de clatrina dentro de las células Caco-2
Caco-2 células se sembraron a 4 × 10
3 células por pocillo en ocho pocillos Lab-Tek Cámara diapositivas (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en 300 l DMEM que contenía FCS al 10% durante 24 h. A continuación se expusieron a CD133 o control de siRNA como se describe anteriormente antes de proceder a la inmunocitoquímica. Después, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante 20 minutos a 4 ° C. Después de lavados en PBS, las células fueron expuestas durante 60 minutos a temperatura ambiente a una solución de bloqueo de PBS que contenía 4% de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich) y 10% de suero normal de cabra (Sigma-Aldrich). anticuerpos monoclonales primarios contra CD133 (IgG1k, Miltenyi Biotech), TfR o CD71 (IgG2aκ, BD-Biosciences) o de la cadena pesada de clatrina (CHC) (IgG1, BD-Biosciences) se incubaron a 5 g /ml en PBS /BSA al 4% para la noche a 4 ° C. Tenga en cuenta que para CHC immunolabeling intracelular, Triton® X-100 se añadió a 0,1% durante el procedimiento de bloqueo para la permeación celular. Después de lavados, se aplicó un anticuerpo conjugado con biotina anti-ratón de caballo secundario (Vector, Burlingame, CA) a 1/100 en PBS /BSA al 4% durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavados adicionales, estreptavidina Fluo sonda Alexa 488 (Interchim, Montluçon, Francia), diluido 1/700, fue utilizado. Las células se lavan finalmente y se montaron bajo cubreobjetos en medio de montaje fluorescente (DakoCytomation). imágenes de microscopia confocal se obtuvieron mediante el uso de un láser confocal 300 sistema de imágenes de microscopía de barrido Olympus Fluoview ™ FU (París, Francia).
tratamientos metalúrgicos
Caco-2 células se sembraron en placas de seis pocillos con 2,3 × 10
5 células por pocillo en 2 ml de 24 h. Antes de que comenzara el tratamiento con hierro, que contienen FBS medio fue reemplazado por medio N1 libre de suero durante 24 h más. Las células se trataron entonces con diferentes concentraciones (50 a 800 mM) de ácido nitrilotriacético férrico (Fe-NTA) durante 72 h a 37 ° C /5% de CO
2, como se indica. Fe-NTA (relación molar 01:04) se preparó extemporáneamente como un almacén 20-mM de NTA y hexahidrato de cloruro férrico (Sigma-Aldrich). Las células fueron tratadas alternativamente con FeSO
4 (Sigma-Aldrich), otro de hierro donante [27], [28], ya sea 150 o 300 M durante 24 h.
privación de hierro y el tratamiento con hipoxia agentes miméticos de
Siguiendo un procedimiento similar a la cultura antes del tratamiento de hierro, las células fueron tratadas en lugar durante 24 h con un quelante de hierro, también conocido como un agente de hipoxia-mimético, desferrioxamina (DFO, Sigma-Aldrich) en 100 y 150 M [29], [30]. Como alternativa, se trataron durante 24 horas con un agente de hipoxia-mimética que funciona independientemente de la privación de hierro, dicloruro de cobalto (CoCl
2, Sigma-Aldrich) a 100 y 150 M [31].
Base de datos , bioinformática
para buscar putativo elemento sensible al hierro (IRE) secuencias dentro de la región no traducida 3 'y 5' (UTR) del ARNm de CD133 humano, las secuencias utilizadas en este estudio (entre los que
Homo sapiens
prominin 1 transcripción variante 2, NM_001145847.1) se obtuvieron de NCBI GenBank. Todos los alineamientos de secuencias se realizaron usando el programa de ordenador ClustalW en el Instituto Europeo de Bioinformática EMBL (Heidelberg, Alemania). Los Sires (búsqueda de IRES) del servidor web (http://ccbg.imppc.org/sires/) también fue utilizado para la predicción de hierro elementos de respuesta en ARN [32].
El análisis estadístico
XLSTAT 2006 Versión 2006.3 (Addinsoft París, Francia) fue utilizado para el análisis de datos. La significación estadística de cada experimento se determinó mediante la prueba de Dunnett. Las pruebas se consideraron como significativas con valores de p & lt;. 0.05
Resultados
Impacto de caída siRNA mediada por CD133 en la acumulación intracelular de Tf, Dx y CTB en Caco no diferenciada -2 células
Para determinar la influencia potencial de CD133 en la acumulación intracelular de compuestos extracelulares, no diferenciada de carcinoma de colon humano Caco-2 células, que expresan de forma natural altos niveles de CD133, fueron utilizados. Utilizando cualquiera de siRNA que no conduce a transcripcional baja regulación (control siRNA) o siRNA que no regular por disminución dirigida CD133 ARNm y la expresión de proteínas (CD133 siRNA), se analizaron dos situaciones: las células Caco-2 que expresan altos niveles de CD133, y Caco células -2 expresan niveles bajos de CD133. La Figura 1A muestra que el tratamiento de células Caco-2 con 30 nM de ARNsi CD133 condujo efectivamente a una reducción de 52 ± 11% en la expresión de la proteína CD133, se analizan mediante citometría de flujo de inmunofluorescencia (anticuerpo AC133) en comparación con el control de siRNA. Para analizar las células Caco-2 células la capacidad de pinocitosis en los CD133
altas y CD133
situaciones de baja, entonces se supervisa la acumulación intracelular de marcadores exógenos de las vías de pinocitosis. Aunque las vías de internalización alternativos se han descrito en función de los tipos de células y el estado de diferenciación (para revisión ver [33]), Tf-Alexa 488, se utilizaron Dx-FITC y CTB-FITC como marcadores prototipo de receptor de endocitosis mediada por [34], fase fluida endocitosis [24], [35] y la endocitosis dependiente caveolae [23], [36], respectivamente. La citometría de flujo de medición de la fluorescencia intracelular después de 1 h la exposición de CD133
alta células Caco-2 o bien 0,5 o 5 mg /ml Dx-FITC, 1 o 10 mg /ml CTB-FITC y 0,5 o 5 mg /ml Tf -Alexa 488 permitió la absorción de 100% a medir en comparación con la intensidad de fluorescencia media geométrica basal de vehículo células solas tratados que representan la absorción 0%. Aunque CD133 caída no tuvo impacto en la acumulación intracelular de Dx-FITC (Figura 1B) o en CTB-FITC (Figura 1C), la captación celular de Tf-Alexa 488 se amplificó significativamente en CD133
células de baja-Caco-2 sea cual sea el concentración probada (Figura 1D). Estos datos así establecidos para la primera vez que CD133 actuar como un modulador de la acumulación intracelular de compuestos exógenos.
A) Inmunofluorescencia asociado análisis de citometría de flujo de la expresión de CD133 en células no diferenciadas Caco-2 tratados con 30 nM de control o siRNA-CD133 específico. Los resultados se expresan como un porcentaje del tratamiento de control, que representa los niveles de intensidad de fluorescencia media geométrica obtenidos después de AC133 inmunotinción de las células tratadas con ARNsi irrelevante (CD133
altos células Caco-2); tenga en cuenta la regulación a la baja efectiva de CD133 cuando se utilizó-CD133 siRNA (CD133
bajos células Caco-2). B-D) Análisis de citometría de flujo de la captación intracelular de Dx-FITC (B), CTB-FITC (C) y Tf-Alexa 488 (D) dentro de CD133
altas y CD133
-2 Caco células de baja después de 1 h de incubación a 37 ° C /5% de CO
2. Los resultados se expresan como porcentaje de control, representando así los niveles de intensidad de fluorescencia media geométrica obtenidos para las células tratadas con vehículo solo. Los datos representados media ± s.e.m. obtenido a partir de tres experimentos independientes. la prueba de Dunnett: ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001
Efecto de siRNA mediada desmontables de CD133 en Tf exocitosis
A la vista del hecho de que CD133 parecía ser un inhibidor de la captación celular de Tf mientras que no tiene impacto en Dx y CTB, que más centrado en la relación entre la expresión de CD133 y la acumulación de Tf. por lo tanto, se investigó el efecto potencial de ARNsi mediada desmontables de CD133 en Tf-Alexa 488 exocitosis. Para este propósito, CD133
alta y CD133
Caco-2 células no diferenciadas bajas se incubaron con Tf-Alexa 488 durante 2 horas a 37 ° C /5% de CO
2 antes de que se retiró el medio extracelular , se lavó y se sustituye por medio fresco libre de Tf-Alexa 488. Después de una incubación adicional durante 1, 2 y 3 horas a 37 ° C /5% de CO
2 la cantidad de Tf-Alexa 488 que no se recicla a la extracelular compartimento se midió por citometría de flujo como se describe en Materiales y Métodos. Los datos presentados en la Figura 2 se estableció que los niveles intracelulares de Tf-Alexa 488 disminuyeron con el tiempo de incubación. Después de 1 h de incubación más de 80% de la internalizado Tf-Alexa 488 se mantuvo dentro de las células en tanto CD133
alta y CD133
bajo que expresan las células, mientras que después de un 3 h de incubación, 54 ± 9% y 43 ± 4 % de la internalizado Tf-Alexa 488 se mantuvo dentro de CD133
altas y CD133
bajos células que expresan, respectivamente. Sin embargo, en todos los tiempos estudiados, no se observó diferencia significativa en función de los niveles de expresión CD133 (Figura 2). Estas observaciones hicieron hincapié en que a pesar de Tf de reciclaje se produce tanto CD133
alto y CD133
baja células no diferenciadas Caco-2, las diferencias a corto plazo en la acumulación de Tf intracelular se deben esencialmente al impacto de CD133 en los mecanismos de endocitosis en lugar de exocitosis .
CD133
alta (control de siRNA) y CD133
baja (CD133) siRNA células Caco-2 no diferenciadas se expusieron a Tf-Alexa 488 durante 2 horas a 37 ° C /5% CO
2 antes de que se retiró el medio extracelular, se lavó y sustituido por medio fresco libre de Tf-Alexa 488. las cantidades de Tf-Alexa 488 que no se recicla al compartimiento extracelular se midieron por análisis de citometría de flujo después de una incubación adicional de células en 37 ° C /5% de CO
2 por 1 a 3 h. Los datos se expresan como% de Tf-Alexa 488 inicialmente internalizado. Ellos representan la media ± s.e.m. obtenido a partir de tres experimentos independientes.
Efecto de inhibidores químicos de vías endocítica conocidos en la captación de Tf por las células Caco-2 no diferenciadas en función del nivel de expresión de CD133 ha subrayado la importancia de la vía clatrina
una vez establecido que el nivel de expresión de CD133 tuvo un impacto en la captación de Tf dentro de las células no diferenciadas Caco-2, pero no moduló Tf reciclaje, que se dirigió a la cuestión de si CD133 está implicado en vías de pinocitosis específicos [ ,,,0],33]. Para este propósito, la absorción de Tf-Alexa 488 dentro de CD133
pilas de gran y CD133
bajo que expresan se controló después del tratamiento con inhibidores químicos previamente identificados de vías endocítica conocidos. La clorpromazina se utilizó para inhibir la clatrina transporte mediado por [22], filipin para inhibir la endocitosis dependiente caveolae [23] y DMA para inhibir macropinocytosis [24]. La citometría de flujo establecido que el tratamiento previo de control de CD133
altos-2 Caco células con filipin, clorpromazina y DMA antes de la exposición a 5 mg /ml Tf-Alexa 488, condujeron a un 30%, 90% y la reducción no significativa en la absorción de Tf , respectivamente (Figura 3A). El mayor impacto de la clorpromazina en combinación con el efecto más leve de filipin subrayando de esta manera que la acumulación de Tf dentro de las células no diferenciadas Caco-2 se debió principalmente al transporte mediada por clatrina [37]. El efecto filipin podría explicarse por el hecho de endocitosis de sustratos Protopic para endocitosis mediada por receptor, tales como LDL o Tf, que generalmente ruta al compartimento intracelular a través de la vía de clatrina, podría usar alternativamente la vía caveolae [38], [39] . Por otra parte, como el colesterol se ha demostrado que participan en la formación de vesículas de endocitosis clathrin revestido [26], filipina, que secuestra el colesterol, también puede tener un impacto indirecto sobre la endocitosis de clatrina. Curiosamente, al considerar CD133 desmontables y CD133
baja células Caco-2, datos muy similares se obtuvieron con filipin, clorpromazina y DMA, lo que lleva a 18%, 85% y la reducción no significativa en la absorción de Tf, respectivamente (Figura 3A) . Por lo tanto, los efectos cuantitativos de CD133 en la endocitosis Tf parecen ser principalmente relacionados con la vía dependiente de clatrina. Sorprendentemente, el agotamiento de colesterol, logrado mediante el uso de MβCD combinada con lovastatina [25], [26], que se ha dicho para afectar vías independientes de clatrina y para algunas vías dependientes medida clatrina [26], [40], [41], dio lugar a una mejora importante en Tf-Alexa 488 acumulación dentro CD133
pilas de gran Caco-2 (+ 49%, Figura 3A). Curiosamente, los efectos del agotamiento de colesterol en la Tf-Alexa 488 captación dentro de CD133
Caco-2 células de baja fue menos marcado (+ 21%, Figura 3A). Estos últimos datos apoyan la hipótesis de que la interacción CD133 con el colesterol intracelular también tiene un impacto en la endocitosis Tf. Para corroborar una posible relación entre CD133 y la vía endocitosis dependiente de clatrina, impacto de CD133 caída en la captación de nanopartículas sintéticas (LNC) que se describieron anteriormente para utilizar la vía de clatrina en ruta hacia el espacio intracelular de las células Caco-2 [ ,,,0],21] se investigó. Curiosamente, como para Tf fluorescente, la captación de marcado con fluorescencia LNC (NR-LNC) fue significativamente mayor en CD133
-2 Caco células bajos (ARNsi de control) en comparación con CD133
altos células Caco-2 (CD133 siRNA) (Figura 3B).
a) Consecuencias de la caída CD133-siRNA para la eficacia de los moduladores químicos de vías endocítica conocidos en la modulación de la absorción por las células Tf Caco-2 no diferenciadas. Después del tratamiento con vehículo solo (control), filipina, clorpromazina, DMA o MβCD añaden con lovastatina (MβCD), CD133
altas (control siRNA) y CD133 Caco-2 células no diferenciadas
baja (CD133 siRNA) fueron expuestos a 5 mg /ml Tf-Alexa 488. internalización celular de Tf-Alexa 488 luego se controló por citometría de flujo. Los resultados se expresan como% de Tf-Alexa 488 importes que se internalizan en el control tratado con vehículo. Nótese la ausencia de efecto de CD133-siRNA desmontables en el importante inhibición de la Tf-absorción causada por la clorpromazina. Tenga en cuenta también el efecto regulador reducida de la extracción de colesterol en la situación de baja CD133 (MβCD). Los datos representados media ± s.e.m. de un triplicado obtenido a partir de un experimento representativo que se reprodujo dos veces. Las comparaciones con el control: la prueba de Dunnett, * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001; la comparación entre el control de siRNA y CD133 siRNA: prueba de Dunnett: p & lt; 0,05. B) siRNA mediada desmontables de CD133 dentro no diferenciada células Caco-2 conducido a un aumento en la acumulación intracelular de LNC. Análisis de citometría de flujo de captación intracelular de la NR-LNC dentro CD133
alta (Control de siRNA) y CD133
baja (CD133 siRNA) Caco-2 células después de 1 h de incubación a 37 ° C /5% de CO
2. Los resultados se expresan como porcentaje de control, representando así los niveles de intensidad de fluorescencia media geométrica obtenidos para las células tratadas con vehículo solo. Los datos representados media ± s.e.m. obtenido a partir de tres experimentos independientes. la prueba de Dunnett:. ** p & lt; 0,01
Tratamiento de no disociados 2-Caco células con el anticuerpo AC133 reconocer el dominio extracelular de CD133 como resultado una reducción en la absorción de Tf
una vez establecido que la expresión de CD133 afectada cuantitativamente Tf endocitosis, que entonces se consideraba que una interacción directa entre la proteína CD133 y la maquinaria endocítica Tf habría sido afectada por la unión a CD133 ligando extracelular. Como aún no se ha identificado ligando extracelular de CD133 y ya que los anticuerpos monoclonales ya ha sido utilizado como activador o como función de bloqueo de inmunoglobulinas, por ejemplo, en las interacciones entre integrinas y la matriz extracelular [42], el anticuerpo AC133, que reconoce un glicosilación asociada epítopo extracelular de CD133 [43], a continuación, se ensayaron como ligando CD133 en vivir células Caco-2. Curiosamente, mientras que el tratamiento de la no diferenciadas células Caco-2 con una inmunoglobulina de control de isotipo IgG1k no tuvo efecto en la acumulación intracelular de Tf-Alexa 488 evaluadas por citometría de flujo (Figura 4A), el tratamiento con el anticuerpo AC133 dado lugar a una importante reducción de la absorción de Tf de 38 ± 8% y 75 ± 1% a 5 y 10 mg /ml, respectivamente (Figura 4A). Estos datos establecieron que AC133 puede ejercer de manera efectiva los efectos funcionales en las células vivas que aquí se atribuyen a una interacción entre sí CD133 y la maquinaria endocítica Tf en las células Caco-2 no disociados.
Captación Tf
tratamiento A) anticuerpo AC133 inhibida.