definidos Tallo (CSC) se considera que son responsables del mal pronóstico de los pacientes con cáncer. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares que subyacen a la adquisición y el mantenimiento de las propiedades de CSC en células de cáncer debido a su rareza en muestras clínicas. En esta revisión se induce propiedades de CSC en las células cancerosas utilizando factores definidos. Nos retroviral introducido un conjunto de factores definidos (
OCT3 /4
,
Sox2
y
KLF4
) en células de cáncer de colon humano, seguido de cultivo con medio que contiene suero convencional , medio de células madre embrionarias no humanas. A continuación, evaluaron las propiedades de CSC en las células. Las células de cáncer de colon transducidas con los tres factores mostraron una mayor significativamente las propiedades de CSC en términos de la expresión del gen marcador, la formación esfera, quimiorresistencia y tumorigenicidad. Designamos las células con propiedades CSC inducida por los factores, un subconjunto de las células transducidas, como CSC inducidas (ICSC). Por otra parte, se estableció una nueva tecnología para aislar y recoger los FISQ en base a las diferencias en el grado de mejora de la actividad de tinte effluxing. Los xenoinjertos derivados de nuestras FISQ no eran los teratomas. Cabe destacar que, en contraste con los tumores de las células de cáncer de los padres, los tumores basados en CAPI imitaban tejidos reales de cáncer de colon humano en términos de sus resultados inmunohistoquímico, que mostraban la diferenciación del linaje de colon. Además, se confirmó que los fenotipos de nuestras FISQ fueron reproducibles en experimentos de trasplante de serie. Mediante la introducción de factores definidos, generamos FISQ con especificidad de linaje directamente de las células cancerosas, no
a través de
un estado de células madre pluripotentes inducidas. El nuevo método permite obtener materiales abundantes de células madre cancerosas que no sólo han mejorado la tumorigenicidad, sino también la capacidad de diferenciarse para recapitular un tipo específico de cáncer de los tejidos. Nuestro método puede ser de gran valor para entender completamente las CSC y desarrollar nuevas terapias dirigidas a los CAC
Visto:. Oshima N, Yamada Y, Nagayama S, Kawada K, S Hasegawa, Okabe H, et al. (2014) La inducción de cáncer propiedades de células madre en células de cáncer de colon por factores definidos. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10.1371 /journal.pone.0101735
Editor: Shree Ram Singh, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Febrero 2014; Aceptado: June 10, 2014; Publicado: 9 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Oshima et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio había sido posible gracias al Premio Balzan a Shinya Yamanaka (http://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), y con el apoyo de los Fondos de Ayuda de investigación de la Asociación general de Shinryokukai Incorporated (https: //www.shinryokukai.com/) (TA) que es un no para alumnos de lucro asociación de Kobe University School of Medicine, y subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP; http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (en NO), y no era becarios de investigación JSP. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito, y esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales
.
Compitiendo intereses: NA y TA son miembros sin sueldo de Shinryoku-Kai Asociación general, Incorporated, que es un no para alumnos de lucro asociación de la escuela de la Universidad de Kobe de la medicina. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Las células madre del cáncer (CSC) se han sugerido para ser responsables del mal pronóstico de los pacientes con varios tipos de cáncer debido a sus características y comportamiento, como las tasas más altas de resistencia a la terapéutica y la recurrencia [1] - [3]. Por lo tanto, los CSC son considerados como una posible diana terapéutica. Para establecer nuevos tratamientos dirigidos Los CCC, es importante para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la adquisición de troncalidad en células madre cancerosas. Sin embargo, éstos aún no están claros, porque los CSC son una rara población de células en el tejido de cáncer, y la rareza de la células madre cancerosas hace que sea difícil de identificar y recogerlos.
Por lo tanto la generación de células madre cancerosas
in vitro
a partir de células de cáncer y la investigación de sus características se considera que es un método útil para la superación de este problema. Varios estudios [4] - [6] informó de que las células con algunas propiedades tales como CSC tumorigenicidad mejorada eran inducible. Sin embargo, no se refieren a si las células tienen la capacidad de diferenciación de recapitular tipos específicos de cáncer de los tejidos. Por lo tanto, todavía no está claro si es posible generar células madre cancerosas que corresponden precisamente a las células madre del cáncer primario.
En cuanto a la adquisición de troncalidad, en la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), se constató que la expresión ectópica de sólo tres o cuatro factores de transcripción (
OCT3 /4
,
Sox2
y
KLF4
con o sin
C-MYC) puede inducir propiedades de células madre embrionarias en células somáticas cuando se usan condiciones de cultivo ESC [7], [8]. Estos genes también pueden inducir directamente las propiedades de células madre neurales (NSC) en células somáticas usando condiciones de cultivo neuro-esfera [9]. Por lo tanto, estos genes tienen la capacidad de inducir diversos tipos de stemness en las células somáticas, en función de las condiciones de cultivo. Por lo tanto, la hipótesis de que estos genes también pueden inducir propiedades CSC en las células cancerosas.
En el estudio actual, transduced
OCT3 /4
,
Sox2
y
KLF4
en células de cáncer de colon humano en las condiciones de cultivo de células parentales y analizó las células transducidas en términos de sus propiedades CSC
in vitro
y
in vivo
. En consecuencia, el conjunto de tres genes podría inducir propiedades CSC en un subconjunto de células de cáncer de colon, y hemos sido capaces de recoger las células con propiedades CSC inducida en función de su diferencia en la actividad de flujo de salida de tinte. Las células recogidas del colon mostraron especificidad de linaje
in vitro
y
in vivo
. Las células madre cancerosas inducidas generadas mediante este método pueden ayudar a investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la adquisición y el mantenimiento de las propiedades de CSC en las células cancerosas y para desarrollar la terapia de CSC-orientación.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares y el cultivo celular
líneas celulares de cáncer colorrectal humano (SW480 y DLD-1) fueron suministrados desde el teléfono del Centro de recursos para la Investigación Biomédica, la Universidad de Tohoku. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Life Technologies, Carlsbad CA, EE.UU.) y penicilina (100 Unidades /ml) y estreptomicina (100 g /ml) (Life Technologies), y se utiliza en el pase temprano para los experimentos.
el aislamiento de ARN y cuantitativa la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa
el ARN total fue aislado utilizando RNeasy Mini Kit Plus ( QIAGEN, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una alícuota de 1 g de ARN total se transcribió inversamente usando un kit de Transcriptor de alta fidelidad de síntesis de cDNA (Roche, Basilea, Suiza), de acuerdo con los protocolos del fabricante. reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR) se realizó con el FastStart universal SYBR Green Master Mix (Roche) y se analizó con el sistema de PCR en tiempo real Paso-One (Life Technologies). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S1
Citometría de Flujo
Una suspensión de células individuales a partir de células cultivadas se immunostained con un anticuerpo de ratón anti-CD133 humano (Clon:. AC133, Miltenyi Biotec, Auburn CA , EE.UU.), anticuerpo CD44 anti-humano de ratón (clon: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, EE.UU.) o anticuerpo anti-ABCG2 humano de ratón (clon: 5D3, BioLegend, San Diego CA, ESTADOS UNIDOS). Después de ser lavado, las células se resuspendieron con PBS que contenía 2% de FBS, y las células muertas fueron etiquetados por 2 mg /ml de yoduro de propidio (PI, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, EE.UU.). suspensiones de células individuales a partir de células con paraformaldehído fijo se permeabilizaron con 0,2% Triton-X (Sigma), y se inmunotiñeron con un anticuerpo de ratón anti-humano CD26 (Clone: M-A261, BD) y el conejo LGR5 anti-humano (Clon: EPR3065Y , Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). En todos los experimentos de citometría de flujo (FCM), los anticuerpos de isotipo correspondientes a cada anticuerpo se utilizaron como controles. Las muestras fueron analizadas por un instrumento FACS Aria II (BD).
Western Blot
Las células se lisaron con la proteína de mamífero M-PER reactivo de extracción (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, EE.UU. ). Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Después de la transferencia electroforética de las proteínas, inmunotransferencia con un anticuerpo anti-ALDH humano de ratón (Clon: 44 /ALDH, BD), seguido por un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, se llevó a cabo. Con el fin de determinar la quimioluminiscencia, el sistema LAS 4000 (película Fuji, Tokio, Japón) se utilizó.
Cell Análisis de Ciclo de
Las células se fijaron con etanol al 70% en PBS a 4 ° C durante la noche. Las células fueron tratadas con ribonucleasa para digerir el ARN y se tiñeron con 50 g /ml de PI. Las células fueron analizadas por citometría de flujo (FACS Aria II).
5-FU-quimio-resistencia análisis
La viabilidad de las células después de 5-fluorouracilo (5-FU, Kyowa KIRIN, Tokio, Japón) la exposición se midió por el ensayo colorimétrico WST-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japón). Un total de 5 × 10
3 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos en el día 10, y el medio fue reemplazado con DMEM que contiene 1 ó 50 mg /ml de 5-FU 24 hr después de la siembra. Después de incubación durante 48 horas, la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de placas de microtitulación. La viabilidad celular se calcula como la relación de los valores de absorbancia para la misma muestra se incuba en DMEM sin 5-FU durante 48 horas.
Esfera Formación Ensayo
se transfirieron las células a placas Ultra Low adjuntos (Corning Incorporated, Corning, Nueva York, EE.UU.) en DMEM libre de suero que contiene 10 ng /ml de bFGF (Wako, Osaka, Japón), 10 g /insulina humana ml (CSTI, Miyagi, Japón), 100 g /transferrina humana ml (Roche) y 100 mg /ml de BSA (Nacalai Tesque), y se incubaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora durante 10 días.
tinte eflujo Análisis de la actividad
Un análisis de la actividad de flujo de salida de colorante se realizó de acuerdo a los métodos descritos anteriormente [10] - [12] con algunas modificaciones. Las células se recogieron en DMEM que contenía 2% de FBS y 1 mM HEPES (Sigma-Aldrich). Las células se incubaron en DMEM que contenía FBS al 2% y HEPES 1 mM con Hoechst33342 (Life Technologies) a 5 mg /ml con o sin la co-administración de verapamil (Sigma-Aldrich) en 50 o 250 mM durante 90 minutos a 37 ° C, y se invierte suavemente cada 30 minutos. Después de la incubación, las células se resuspendieron en PBS que contenía 2% de FBS y HEPES 1 mM (Sigma-Aldrich). Las células se contratiñeron con 2 g PI /ml para marcar las células muertas, y se pasaron a través de un filtro de malla de 35 micras, manteniéndolos en hielo durante la citometría de flujo y clasificación. Las células fueron analizadas y clasificadas por un FACS Aria II. El colorante Hoechst se entusiasma con un láser UV (355 nm), y la fluorescencia se midió tanto con un filtro de 670/50 (Hoechst rojo) y un filtro de 450/50 (Hoechst azul).
En Vivo tumorigenicidad estudio
Un total de 1 × 10
6, 3 × 10
5 o 1 × 10
se inyectaron 5 células en 100 l de suero libre de PBS por vía subcutánea en ambos flancos dorsales de un ratón desnudo inmunodeficientes (KSN /Slc ratón, SLC, Shizuoka, Japón). El volumen del tumor se calculó mediante la fórmula de 0,5 x L x W
2 (L: longitud, W: anchura). Los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética e Investigación Animal de la Universidad de Kyoto (Número de Permiso: 11537, 12237, 13217), y realizada de conformidad con las directrices institucionales. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Trasplante de serie
Para los experimentos de trasplante de serie, células clasificadas se cultivaron durante nueve-16 días (primer cultivo) después de la clasificación, a continuación, un total de 3 x 10
6 células se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos inmunodeficientes. Los tumores (primeros tumores) fueron extirpados cuando alcanzaron un diámetro de más de 10 mm y se analizaron patológicamente. Los tumores extirpados también se disociaron enzimáticamente en suspensiones de células individuales por un Disociador gentleMACS y Tumor Humano disociación Kit (Miltenyi Biotec), según los protocolos del fabricante. Las células disociadas se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos después de ser cultivadas durante seis a diez días (segundo cultivo), y se analizaron mediante FCM en función de su actividad de eflujo de colorante en día seis a doce después de la disociación. El procedimiento se repitió tres veces hasta que se obtuvieron las células cultivadas cuarto de la disociación del tercer juego de tumores.
La inmunohistoquímica
, secciones incluidas en parafina fijadas con formalina derivados de los xenoinjertos se tiñeron con citoqueratina 20 anticuerpo anti-humano (CK20) monoclonal de ratón (Clon: Ks20.8, dilución 1:25, Dako, Glostrup, Dinamarca), citoqueratina anticuerpo monoclonal anti-humano 7 (CK7) de conejo (Clon: SP52, la concentración; 0,536 g /ml, Roche) o anti-humana de tipo homeobox caudal 2 () anticuerpo monoclonal de ratón CDX2 (Clon: AMT28, dilución 1:500, Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) por el método de inmunoperoxidasa avidina-biotina. Se llevó a cabo la recuperación de antígenos microondas. Para la inmunocitoquímica, las células cultivadas, las cuales fueron fijadas con paraformaldehído al 4%, se tiñeron con anticuerpos anti-CK20 (Clon: Ks20.8, la dilución 1:100) o anticuerpo anti-CDX2 (Clon: CDX2-88, prediluido, Abcam) y contrastados con Hoechst33342 (Life Technologies) para identificar todos los núcleos.
resultados
la transducción de
OCT3 /4
,
Sox2
y
KLF4
en una línea celular de cáncer de colon
transducidas
OCT3 /4, Sox2, Klf4
, o una mezcla de los tres (en lo sucesivo, OSK) en la célula de cáncer de colon humano SW480 línea usando retrovirus vectores [7] (ver Métodos S1), y también se utilizó un vector Mock (vector vacío) como control. Estas células se denominan O-SW480, S-SW480, K-SW480, SW480 y OSK-M-SW480, respectivamente. Las células de los padres también se denominan WT-SW480. En este estudio, las células se cultivaron en DMEM que contenía 10% de FBS y se evaluaron en el día 10 después de la transducción (Fig. S1A). Se confirmó la transducción retroviral y la expresión de mRNA de los genes transducidos (Fig. S1B y s1c). En las células M-SW480,
KLF4
se expresó de manera endógena, mientras que
OCT3 /4
y
Sox2
no fueron detectados. cambios morfológicos distinguibles se observaron en cada una de las líneas que se atribuyeron a su gen (s) transducidas (Fig. S1D).
Expresión de marcadores previamente notificados relacionados con células madre cancerosas de colon y células madre intestinales en transducidas-SW480 células
Para evaluar el estado de células madre de las células transducidas, se evaluaron los niveles de expresión de los genes marcadores candidato previamente notificados, aunque la controversia [13], [14], de las CSC de colon y células madre intestinales, tales como
CD133
[15], [16],
CD44
[17], [18],
CD26
[19],
ALDH1
[ ,,,0],20],
ABCG2
[21] y
LGR5
[22] por QRT-PCR (Fig. 1A). Entre las líneas de células, sólo las células OSK-SW480 habían aumentado significativamente los niveles de expresión de ARNm de todos los genes en comparación con las células M-SW480 (n = 3).
(A) QRT-PCR de marcadores previamente reportados relacionados a las CSC de colon y células madre intestinales en las células SW480 transducidas. Todos los marcadores se upregulated en las células OSK-SW480. Los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a los de
GAPDH
. Se muestran los niveles relativos de expresión en comparación con los de M-SW480. (B) la proteína niveles de expresión de marcadores de CSC en las células SW480 transducidas según lo determinado por una citometría de flujo (FCM) análisis. Los datos de tres experimentos independientes demostraron que el número de CD133-, CD44-alta, CD26- y células ABCG2-positivos fueron significativamente superiores en las células OSK-SW480. Los gráficos de puntos representativos de cada marcador se muestran en la Figura S2. (C) La expresión de la proteína de ALDH1 en las células SW480 transducidas determinados por un análisis de transferencia Western. El panel muestra los datos representativos de tres experimentos independientes. (D) La proliferación de las células
in vitro
. Un total de 3 × 10
5 células se sembraron en placas de seis pocillos en el día siete y se contaron en el día 11. El número de células OSK-SW480 fue menor que la de las células M-SW480 (n = 3). (E) Las células en la fase 0 /G1 se detectaron mediante un análisis FCM en día 11. El porcentaje de células en la fase 0 /G1 aumentado significativamente en las células O-, K y OSK-SW480 (n = 3) . (F) Análisis de 5-FU-chemoresitance. La viabilidad de las células OSK-SW480 en presencia de 5-FU fue significativamente mayor que la de las células M-SW480, tanto a 50 g concentraciones 1 y /ml de 5-FU (n = 3). La viabilidad de las células M-SW480 a cada concentración se ajustó a 100%. Las barras de error indican la desviación estándar: SD. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,01, prueba de Dunnett
A continuación, se evaluaron los niveles de expresión de proteínas de los marcadores (Figura 1B, 1C y S2.). El análisis FCM mostró que las células OSK-SW480 habían aumentado significativamente los niveles de expresión de proteínas de CD133, CD26 y ABCG2. La mayoría de las células transducidas expresan CD44, pero se aumentó el número de células que expresan un mayor nivel de CD44 alrededor de dos veces en las células OSK-SW480 comparación con las células M-SW480 (n = 3) (Figs. 1B y S2). Las células OSK-SW480 mostró una tendencia a tener un mayor nivel de expresión de LGR5, pero esto no fue estadísticamente significativa (Figs. 1B y S2) (n = 3). Un análisis de transferencia Western mostró que el nivel de expresión de ALDH1 se incrementó sólo en las células OSK-SW480 (Fig. 1C). Estos resultados sugieren que OSK tiene la capacidad de evocar firmas CSC en un subconjunto de células SW480.
proliferación y el ciclo celular en las células SW480 transducidas
A continuación se evaluó el crecimiento de las células
en
vitro. El número de células OSK-SW480 en 96 horas después de la siembra de 3 x 10
5 células fue significativamente menor que la de las células M-SW480 (P & lt; 0,01, n = 3) (Fig 1D.). La observación más largo también mostró resultados consistentes (Fig. S3). Para examinar si los genes transducidos afectados el ciclo celular, se realizó un análisis del ciclo celular por FCM con tinción de ADN usando yoduro de propidio (Fig. 1E). El porcentaje de células en la fase 0 /G1 era aproximadamente 10% más alto en O-, K- y culturas OSK-SW480 que la de las células M-SW480 (n = 3).
de sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos
para examinar la sensibilidad a los fármacos contra el cáncer de las células, se compararon las tasas de supervivencia de las células después del tratamiento con 1 o 50 mg /ml de 5-FU durante 48 horas por el WST-8 ensayo colorimétrico (fig. 1F). En las células OSK-SW480, la tasa de supervivencia fue de alrededor de 20% mayor que la de las células M-SW480 a ambas concentraciones de 5-FU (n = 3). Este resultado sugiere que las células OSK-SW480 contenían las células adquiridas quimio-resistencia al 5-FU.
Esfera formación de ensayo
Ha sido previamente informado de que las CSC tenía una mayor capacidad para formar esferoides en cultivo en platillos bajos de fijación y medio sin suero [2], [16]. Para examinar la capacidad de formación de esferas de nuestras células transducidas, se realizó un ensayo de formación de esfera (Fig. 2A). En las células M-SW480, que casi no se observó ningún esferoides. En contraste, en la O-, K- y culturas OSK-SW480, se observó un aumento del número obviamente de los esferoides (media de 47, 23 y 50, respectivamente, n = 3), indicando que
OCT3 /4, KLF4 Opiniones y OSK contribuyeron a la formación de esferoides en un subconjunto de células SW480.
el ensayo de formación de esferoides (a). Un total de 1 × 10
4 células se sembraron en placas de fijación bajas en el día 10 y se cultivaron con medio libre de suero durante 10 días. En los cultivos O-, K- y OSK-SW480, el número de esferoides significativamente aumentó en comparación con la de las células M-SW480. Las barras de error indican la SD (n = 3). Barras de escala: 100 m. (B) La tumorigenicidad de las células después de la implantación en las regiones subcutáneas de ratones desnudos inmunodeficientes. Un total de 1 × 10
6 células (panel izquierdo) o 3 × 10
5 células (panel derecho) fueron inyectados por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos inmunodeficientes en día 10. El volumen de los tumores derivados de la células K- y OSK-SW480 fueron obviamente más altos que los de las células en peso, m-, o- y S-SW480 para ambos números de células inyectadas. Las barras rojas indican la mediana del volumen tumoral. ** P & lt; 0,01, NS:. No es significativo, la prueba de Dunnett (a excepción de †: U-test) guía empresas
tumorigenicidad
in vivo
Para examinar la tumorigenicidad de las células transducidas, que por vía subcutánea trasplantado 1 × 10
6 o 3 × 10
5 células en ratones desnudos inmunodeficientes en la zona dorsal en ambos lados, y luego se midió la incidencia y el volumen de los tumores después de cuatro semanas para el 1 × 10
6 células y ocho semanas para el 3 × 10
5 células después del trasplante, respectivamente (Fig. 2B). Un resumen de la incidencia de tumores se muestra en la Tabla 1. Las células K-y OSK-SW480 tumores generados en 100% de los sitios, mientras que las otras líneas generadas tumores en 75% y 25% de los casos por el número de células de 1 x 10
6 y 3 × 10
5 células, respectivamente. Hemos observado un volumen significativamente mayor de los tumores en los ratones inyectados con células K- y OSK-SW480 en comparación con los inyectados con otras líneas, tanto en cantidades de células, a saber, 1 × 10
6 y 3 × 10
5 células (Fig. 2B).
en conjunto, estos datos indican que OSK inducida suficientemente todas las propiedades ya se ha informado CSC hemos examinado
in vitro
y
in vivo
, mientras que no solo gen era suficiente para inducir todas estas propiedades. Designamos las células con las propiedades de CSC en las culturas OSK-SW480 como células madre cancerosas inducidas (ICSC).
actividad de eflujo de Hoechst33342
En los informes anteriores [2], [10], [12 ], [23], [24], FCM usando etiquetado Hoechst33342 con verapamil (VM), que es un Cassette (ABC) inhibidor del transportador de unión a ATP, era una forma eficaz para enriquecer varios tipos de células madre similares, incluyendo las células cancerosas . En este ensayo, se consideró que las células madre similares (los denominados células lateral población) no fueron etiquetados por Hoechst33342 sin VM, pero se marcaron mediante Hoechst33342 con la administración de VM.
Se confirmó la existencia de 5 g /ml de células Hoechst33342-effluxing, que desaparecieron con la co-administración de 50 M de VM en la cultura M-SW480 (Fig. 3A). Hemos establecido una puerta en la que se incluyó la población, y ha dado en llamar las células en la puerta en ausencia de VM como "V0" células (Fig. 3A, panel izquierdo), seguido de un análisis de otras líneas. El número de células V0 aumentó significativamente en los cultivos OSK-SW480 (3,9% y 5,0%, respectivamente) en comparación con la cultura M-SW480 (2.6%) (Fig. 3A, panel derecho) O- y. En particular, las células únicas, que fueron sin marcar por Hoechst33342 incluso con la presencia de 50 mM de VM, eran evidentes en los cultivos OSK-SW480. Hemos denominado estas células como "V50-células" (Fig. 3A, panel izquierdo). El tratamiento con 250 mM de VM dio lugar a la desaparición de las células dentro de la puerta, lo que indica que las células V50 fueron sensibles a 250 M de VM (Fig. 3B, panel izquierdo). Tomados en conjunto, estos datos indican que se obtuvo una nueva población de células de colección:.-Células V50 con una actividad de flujo de salida de tinte altamente potente inducida en las culturas OSK-SW480
(A) Las células OSK-SW480 incluyen una población de células no marcadas por 5 g /ml de Hoechst33342 con la co-administración de 50 M de verapamil (VM). Designamos las células no marcadas por Hoechst33342 sin VM y con 50 M de VM como V0-V50 células y células, respectivamente. El panel izquierdo muestra gráficos de puntos representativos de las células etiqueta y etiqueta en el día 10 después de la transducción. El panel derecho muestra los resultados de tres experimentos independientes. La subpoblación V0 se incrementó en el O- y células OSK-SW480. Las células V50 fueron obviamente ven en las culturas OSK-SW480. Las barras de error indican la SD (n = 3). * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, prueba de Dunnett. (B) Teñir la actividad de flujo de salida en el día 10 (panel izquierdo) y el día 28 (panel derecho) después de la transducción. Las células V50 desaparecido bajo el tratamiento con el co-administración de 250 M de VM incluso en las células OSK-SW480. La proporción de las células OSK-V50 disminuyó con el tiempo.
Confirmación con otra línea celular de cáncer de colon
Para confirmar los resultados actuales, examinamos otra línea celular de cáncer de colon, DLD- 1, en algunos experimentos, incluyendo la evaluación de la tasa de crecimiento celular
in vitro
, tumorigenicidad
in vivo
y las propiedades effluxing Hoechst33342 (Fig. S4). En las células DLD-1, la tasa de crecimiento de las células OSK-DLD-1 fue menor que la del peso (parental) y las células Mock-DLD-1 (p & lt; 0,01, n = 3) (Fig S4A). . La tumorigenicidad de 1 × 10
5 células era mayor en las células OSK-DLD-1 en comparación con el peso y las células DLD-1-Mock (Fig. S4B, el cuadro S2). También se observaron células V50 en el OSK-DLD-1, pero no en el Mock-DLD-1, culturas (Fig. S4C).
El cobro de las FISQ de OSK-SW480
para examinar si las propiedades CSC inducida en cultivos OSK-SW480 eran atribuibles a las células V50, nos lo solucionaron y se analizaron las células V50 y los no-V50 células en presencia de 50 mM de VM en las células OSK-SW480, y V0 las células y las células no-V0 en ausencia de VM y los no-células V50 en presencia de 50 mM de VM en los cultivos M-SW480. Estas células se denominan OSK-V50, OSK-nonV50, M-V0, M-nonV0 y M-nonV50, respectivamente.
Después de la clasificación por un separador de células activadas por fluorescencia (FACS) en el día 10, todo el líneas eran posteriormente se cultivaron durante 10 días en DMEM que contenía 10% de FBS. Las células OSK-V50 mostraron morfología similar a la observada en las células distintivamente OSK-SW480 en día 10 (Fig. 4A, Fig. S1D). En contraste, las células OSK-nonV50 exhiben morfología similar a la de la M-V0, M-nonV0 y las células M-nonV50 (Fig. 4A). La tasa de crecimiento celular de las células OSK-V50 fue significativamente menor que la de las otras líneas (P & lt; 0,01, n = 3) (Fig 4B.), Lo que resulta en proporción disminuido (~ 0,1%) de las células V-50 en 28 días después de la transducción con la condición de la cultura actual (Fig. 3B, panel derecho).
las células V50 en las células OSK-SW480 (OSK-V50) fueron ordenados por FACS. Non-V0, V0 y no-V50-células en las células M-SW480 (M-nonV0, M-V0 y M-nonV50, respectivamente) y no las células-V50 en las células OSK-SW480 (OSK-nonV50 ) también fueron ordenados y se utilizan como controles. Estas células se cultivaron toda posteriormente. (A) la morfología de las células cultivadas durante 10 días después de la clasificación. La morfología de las células OSK-V50 fue similar a la observada en las células distintivamente OSK-SW480 (Fig. S1D, círculo rayado). Por el contrario, la morfología de las células OSK-nonV50 fue similar a la de las células M-V0, M-nonV0 y M-nonV50. Barras de escala: 100 m. (B) La proliferación de las células
in vitro
. Un total de 3 × 10
5 células cultivadas durante 14 a 18 días después de la clasificación fueron cabeza de serie, y contó 96 horas más tarde. El número de células fue significativamente menor en las células OSK-V50 de que en todas las otras líneas. Las barras de error indican la SD (n = 3). ** P & lt; 0,01, prueba de Scheff. (C) tumorigenicidad de las células en ratones inmunodeficientes. Un total de 3 × 10
5 o 1 × 10
5 células se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos inmunodeficientes en día 18 después de la clasificación. El volumen del tumor y la incidencia se midieron ocho semanas después de la inyección. Sólo las células OSK-V50 generaron tumores obvias para ambos el número de células inyectadas, mientras que no hay tumores se obtuvieron de la M-nonV0, M-V0, M-nonV50 y células OSK-nonV50. La incidencia de la formación de tumores por células OSK-V50 era 4/4 tanto para el número de células inyectadas. Las barras rojas indican el volumen del tumor mediano.
La tumorigenicidad de las células OSK-V50 en los ratones inmunodeficientes fue obviamente mayor en términos del tamaño y la incidencia de tumores que la de las otras líneas celulares, incluyendo las células OSK-nonV50 (Fig. 4C).
en conjunto, estos datos indican que las células OSK-V50 expuestas propiedades CSC, pero que las células OSK-nonV50 hicieron no, lo que indica que las propiedades inducidas en CSC células OSK-SW480 eran atribuibles a la población de células V50.
colónica linaje diferenciación de las células OSK-V50
in vitro
células OSK-V50, así como M- células V0 fueron positivos para CDX2, un regulador maestro de la diferenciación del epitelio intestinal [25], y CK20, una diferenciación marcador de colon [26], por inmunotinción (Fig. 5A). Por lo tanto las células OSK-V50 mantienen fenotipo linaje de colon y capacidad de diferenciación
in vitro gratis (Fig. 5A).
(A) La inmunocitoquímica para CDX2 y la proteína CK20. células OSK-V50 fueron positivos para CDX2 y CK20, así como las células M-V0. Las células se contratiñeron con Hoechst33342. Barras de escala: 100 m. (B) La diversidad fenotípica en la morfología y la movilidad de los derivados de células OSK-V50. Las fotografías son imágenes con lapso de tiempo de células OSK-V50 M-V0 y. Las células clasificadas se cultivaron posteriormente durante cinco días y luego observaron cada seis horas durante 42 horas. Time-lapse reveló que hubo una mayor diversidad, tanto en la morfología y la movilidad en las células OSK-V50 (panel inferior) en comparación con las células M-V0 (panel superior). Aumento original, × 20. Películas de células OSK-V50 M-V0 y se muestran en vídeo S1 y S2 de vídeo, respectivamente.
diversidad fenotípica en derivados de OSK-V50
La generación de heterogeneidad en los tejidos de cáncer es una de las notables propiedades de CSC [1] - [3]. Para examinar esta propiedad en nuestras células aisladas, se analizaron posteriormente 23 días después de su clasificación (Fig. S5). Las células OSK-V50, en contraste con todas las otras células, podría producir V50-células y así como diversos subconjuntos diferentes de células en términos de la función de grado de Hoechst-effluxing (Fig. S5).
a continuación realizó
in vitro
de lapso de tiempo de formación de imágenes en la M-V0 y OSK-V50 células de 42 horas (Fig. 5B, Métodos S1). Las células M-V0 consistían en pequeñas colonias redondas y células en forma de huso, y formadas consisten en células con bordes claros. Las células OSK-V50 consistieron en células con diversas morfologías, tales como polygonal-, redonda, cuboidal-, de huso y células con forma plana, que alteraron sus morfologías con el tiempo, y formaron colonias montados en planos que consiste en células con bordes poco claros . Además, las células OSK-V50 mostraron mayor movilidad de células que las células M-V0 (Fig. 5B, Videos S1 y S2). Estos resultados sugieren que las células OSK-V50 pueden producir una mayor diversidad en términos de morfología y movilidad en comparación con las células M-V0.
colónica linaje diferenciación de las células OSK-V50
in vivo
próximo evaluó histológicamente los tumores derivados de la M-SW480 y células OSK-V50 en ratones inmunodeficientes (Fig. 6).