Extracto
Antecedentes
Este estudio fue diseñado para explorar el potencial terapéutico de la supresión de la MAP cinasa y PI3K /Akt y la histona deacetilasa (HDAC) para inducir la expresión de sodio /yoduro de cotransportador (NIS) y la absorción de yodo radiactivo en las células cancerosas no tiroideas.
Métodos
Hemos probado los efectos de la RDEA119 inhibidor de MEK, el perifosine inhibidor de Akt, y el inhibidor de HDAC SAHA en la expresión de NIS trece líneas celulares de cáncer humano derivado de melanoma, carcinoma hepático, carcinoma gástrico, carcinoma de colon, carcinoma de mama, y cáncer del cerebro. También se examinó la absorción de yodo radiactivo y la acetilación de histonas en el promotor de NIS en células seleccionadas.
Resultados
En general, los tres inhibidores podría inducir la expresión de NIS, en diversos grados, en el melanoma y el carcinoma epitelial todo células -derivado pero no en células de cáncer derivado de cerebro. SAHA era más eficaz y su efecto se podría mejorar de manera significativa por RDEA119 y perifosine. La expresión de NIS, tanto a nivel de mRNA y proteína, era más robusto en el de células de melanoma M14, hepática de células de carcinoma HepG2, y la célula de carcinoma gástrico MKN-7 de células. captación de yodo radioactivo se indujo de manera correspondiente, acompañado de sólido aumento de la acetilación de histonas en el promotor de NIS, en estas células cuando se tratan con los tres inhibidores.
Conclusiones
Esta es la primera demostración de que al mismo tiempo la supresión de la MAP cinasa y PI3K /Akt y HDAC podrían inducir la expresión de NIS robusto y captación de yodo radioactivo en ciertas células cancerosas humanas no tiroideas, proporcionando nuevos implicaciones terapéuticas para el tratamiento con yodo radioactivo adjunto de estos tipos de cáncer
Visto:. Liu Z, Xing M (2012) La inducción de la expresión de sodio /yoduro Symporter (NIS) y yodo radiactivo La captación por las células del cáncer de tiroides no. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10.1371 /journal.pone.0031729
Editor: Marian Ludgate, la Universidad de Cardiff, Reino Unido
Recibido: 12 de septiembre de 2011; Aceptado: January 12, 2012; Publicado: 16 Febrero, 2012
Derechos de Autor © 2012 Liu, Xing. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud R01 CA134225 subvención al Dr. Xing. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Como una glicoproteína transmembrana expresa principalmente en las células tiroideas foliculares epiteliales, symporter yoduro de sodio (NIS) desempeña un papel fundamental en el transporte de yoduro desde el espacio extracelular en la célula tiroidea para la síntesis de las hormonas tiroideas en la glándula tiroides [1] - [4]. Esta es la base biológica para la aplicación clínica de yodo radiactivo en el diagnóstico y tratamiento de una variedad de enfermedades benignas y malignas de la tiroides. Un ejemplo típico de la utilización de esta función de NIS es la ablación con yodo radiactivo aplicado ampliamente para el tratamiento de cáncer de tiroides [5], [6]. tratamiento con yodo radiactivo suele ser eficaz en pacientes con cáncer de tiroides, pero se vuelve ineficaz cuando las células del cáncer de tiroides han perdido la expresión de NIS y ya no pueden ocupar con yodo radiactivo tal como se observa típicamente en los cánceres de tiroides pobremente diferenciadas y no diferenciadas [7] - [10]. Estudios previos han demostrado que los inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC) podrían inducir la expresión de NIS en células de cáncer de tiroides [11], [12]. Recientemente hemos demostrado que la combinación del inhibidor de HDAC SAHA con inhibidores de la MAP quinasa y PI3K /Akt podría inducir la expresión robusta y sinérgica de NIS y la captación de radioyodo en células de cáncer de tiroides [13]. Esto abrió la posibilidad de que un nuevo tratamiento eficaz de cáncer de tiroides usando yodo radiactivo que de otro modo no ávida de este radioisótopo.
Dada la función única de NIS para el transporte de yoduro en las células de la tiroides y el éxito clínico del uso de yodo radiactivo por la tiroides ablación de tratamiento del cáncer, hace tiempo que se ha propuesto y probado la expresión de NIS que exógenamente inducida mediante la transferencia génica dirigida puede conferir las células cancerosas no tiroideas avidez de yodo radiactivo para el tratamiento con yodo radiactivo ablación [2] - [4], [14]. Este tipo de estudios son prometedores, pero aún no han dado lugar a aplicaciones clínicas fiables. Todavía se necesita gran esfuerzo para mejorar varios aspectos clave de este enfoque, incluyendo la eficacia terapéutica, la especificidad, la seguridad, y la complejidad técnica. NIS puede expresarse en diferentes tejidos no normales de la tiroides, aunque a un nivel bajo, incluyendo, por ejemplo, salivales, lagrimales, mama, estómago, intestino, tejidos de pulmón, de riñón y [15] - [19]. la expresión de bajo nivel de NIS también se detectó en algunos tipos de cáncer no tiroideas, como el carcinoma de mama [20]. Recientemente hemos demostrado que la supresión de la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt podría inducir la expresión de NIS y la captación de radioyodo en células de melanoma [21]. Dada la sinergia en la inducción de robustamente la expresión del gen de la tiroides y la captación de radioyodo en células de cáncer de tiroides inhibiendo simultáneamente HDAC y la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt [13], en el presente estudio hemos probado el potencial de esta nueva estrategia terapéutica para inducir la expresión de NIS para la captación de yodo radioactivo en un grupo ampliado de las células cancerosas no tiroideas.
resultados
la inducción de la expresión del gen NIS en células de cáncer no tiroideas mediante la supresión de la MAP quinasa vías y /AKT PI3K y HDAC
Hemos probado los efectos de la RDEA119 inhibidor de MEK, el perifosine inhibidor de Akt, y el inhibidor de HDAC SAHA en la expresión de la
NIS
gen en 13 células de cáncer humano (Tabla 1). Estas células de melanoma incluidos y células de carcinoma epiteliales derivadas de hepatocarcinoma, carcinoma gástrico, carcinoma de colon, y cáncer de mama, así como de células de glioblastoma T98G y celular astrocitoma SNB-78. Para demostrar los efectos de los medicamentos selectivos de los tres inhibidores de estas células, primero a prueba sus efectos en sus moléculas diana en las vías de señalización. Como se muestra en la Fig. 1, después de 30 horas de tratamiento, RDEA119 en 0.5 M y perifosine a 5 micras podrían inhibir significativamente la fosforilación de ERK (p-ERK) y la fosforilación de AKT (p-AKT), respectivamente, en prácticamente todas las células excepto para el células SNB-78. SAHA a 0,5 M durante 30 hrs podría mejorar drásticamente la acetilación de la histona H3 en estas células a excepción de algunas células, tales como T98G y SNB78, en los que no había ninguna o sólo un pequeño aumento de la acetilación de histonas. Estos resultados, en general, demostraron los efectos esperados objetivo de estos inhibidores.
El RDEA119 inhibidor de MEK, el perifosine inhibidor de Akt, y el inhibidor de HDAC SAHA se utiliza para apuntar, respectivamente, estas vías o moléculas de señalización. Las células fueron tratadas durante 30 horas con 0,5 M RDEA119, perifosine 5 M o 0,5 M SAHA como se indica. DMSO o PBS se usó en paralelo como el control del vehículo. Las células se lisaron para el Western Blot después de los tratamientos para revelar los niveles de ERK fosforilada (p-ERK), Akt fosforilada (p-Akt), y la histona acetilada (Ac-His) con anticuerpos específicos. "+", El tratamiento con el inhibidor indicado; "-"., El tratamiento con vehículo
posteriormente Hemos probado los efectos de los tres inhibidores a estas concentraciones, individualmente o en combinaciones, en la expresión de la
NIS
gen en las 13 células usando cuantitativa en tiempo real PCR. Como se muestra en la Tabla 1,
NIS
expresión se incrementó en diversos grados en todas las células, excepto por las dos células de cáncer no epiteliales T98G y SNB78 que no tienen ninguna respuesta a estos tratamientos farmacológicos. El
NIS
expresión inducida era más robusto en el celular de melanoma M14, la célula hepatocarcinoma HepG2, y la célula de carcinoma gástrico MKN-7, que fueron utilizados para estudios posteriores como se presenta en las siguientes secciones. Individualmente, RDEA119 y perifosine cada uno tenía un efecto menor y SAHA muestran los efectos más pronunciados en la expresión de
NIS
. Un efecto sinérgico se observó cuando el inhibidor de MEK o el inhibidor de Akt se cada combinan con SAHA y los efectos sinérgicos fueron aún más robusta cuando se combinaron los tres fármacos, con una excepción que en las células HepG2 perifosine no aumentar aún más el efecto robusto de SAHA .
Después de la demostración de la expresión del ARNm de NIS por cuantitativa en tiempo real PCR en células de melanoma y carcinoma epitelial, el próximo tratado para examinar la expresión de NIS a nivel de proteínas en estas células, utilizando el celular de melanoma M14 , HepG2 hepatocarcinoma celular, y de células de carcinoma gástrico MKN-7 como representantes que muestra la expresión más robusta de NIS (Tabla 1). Como se muestra en la Fig. 2, el tratamiento de combinación de estas células con RDEA119, perifosine y SAHA aumentó significativamente la expresión de proteínas NIS tal como se detecta mediante inmunotransferencia de tipo Western. En comparación con las células M14 y HepG2, las células MKN-7 muestran un modesto aumento en la expresión de la proteína NIS en respuesta a la combinación de tratamiento con los tres inhibidores, que era similar al patrón de expresión NIS mRNA en estas células en estas condiciones de tratamiento de drogas (Tabla 1). Por lo tanto, la supresión de la MAP quinasa y PI3K /Akt y HDAC podría inducir la expresión robusta de NIS en estas células, tanto en los niveles de transcripción y traducción.
Las células fueron tratadas durante 30 horas con uso combinación de RDEA119, perifosine, y SAHA a las concentraciones descritas en la Fig. 1, seguido por análisis de transferencia Western estándar de los lisados celulares utilizando el anticuerpo primario específico contra NIS. El nivel de expresión de ß-actina se analizó en paralelo para el control de calidad. "Control", el tratamiento de las células con vehículo; "R + P + S", el tratamiento de las células con el uso combinado de RDEA119, perifosine y SAHA.
absorción de yodo radioactivo celular inducida por la supresión de la MAP cinasa y PI3K /Akt y HDAC
con la demostración de la expresión de NIS robusta en células de cáncer no tiroideas mediante la supresión de la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt y HDAC, se utilizó M14, HepG2 y células MKN-7 para probar la relevancia funcional final de este hallazgo mediante el examen de la capacidad de estas células para captar radio yoduro después de la inducción de NIS. Como se muestra en la Fig. 3, la captación de radio yoduro se indujo claramente en estas células por el tratamiento de combinación con RDEA119, perifosine y SAHA. Entre las tres células, marcada absorción de radio yoduro fue visto particularmente en la célula M14, consistente con el hallazgo de que la expresión de NIS, tanto a nivel de ARNm y de la proteína era más robusto en esta celda.
Las células se trataron con RDEA119, perifosine y SAHA como se describe en la Fig. 2, seguido por incubación con Na
125I de 1 hr. células paralelos se trataron adicionalmente con el NIS bloqueador de NaClO
4 para obtener la absorción de yodo radiactivo no específica /unión con las células. Después, las células se lavaron, se lisaron, y se midieron para determinar la radiactividad. captación de yodo radioactivo celular se presenta como cpm /10
6 células (en el eje Y de la figura) después de la corrección para el yodo radiactivo unión no específica. procedimientos experimentales detallados son como se describen en los Materiales y Métodos. "Control", el tratamiento de las células con vehículo; "R + P + S", el tratamiento de las células con el uso de la combinación RDEA119, perifosine y SAHA. ** En comparación con el control, p. & Lt; 0,01
Mejora de la acetilación de histonas del promotor de NIS mediante la supresión de la MAP cinasa y PI3K /Akt y HDAC
acetilación de histonas en el región del promotor promueve la expresión de genes [22]. Para explorar si esto era un mecanismo implicado en la expresión de NIS inducida por los tratamientos con fármacos en las células cancerosas no tiroideas en el presente estudio, se realizó un análisis próximo chip de acetilación de histonas en el promotor de NIS. Se examinaron tres regiones diferentes del promotor de NIS para las histonas H3 y H4 acetilación en M14, HepG2 y células MKN-7. Estas regiones representan el promotor esencial mínimo NIS [23]. Se encontró que la acetilación de histonas en estas regiones del promotor de NIS se aumentó a diversos niveles mediante el tratamiento con SAHA en estas células (Fig. 4a-c). El tratamiento combinado con el MAP cinasa y PI3K /Akt y los inhibidores de HDAC aumentó aún más la acetilación de histonas en el promotor de NIS. En general, este acetilación de histonas se observó tanto en H3 y H4 en las tres celdas a excepción de MKN-7 células en las que no hay cambio acetilación significativa se observó en H3 (Fig. 4c). Todas las tres regiones del promotor de NIS esencial mínimo muestran acetilación de histonas excepción de la región P1 en células M14 que no mostró cambios en la acetilación de H3 después de los tratamientos con fármacos (Fig. 4a). Hasta unos 50 pliegues de aumento de la acetilación de la histona H4 en la región P2 del promotor de NIS en células M14 (Fig. 4a) y cerca de 20 pliegues de aumento de la acetilación de la histona H4 en la región P1 en las células HepG2 (Fig. 4b) eran observado. Estos datos sugieren que la acetilación de histonas es un mecanismo implicado en la expresión de NIS inducida por la supresión de la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt y HDAC en estas células de cáncer no tiroideas. células M14 mostraron la más robusta acetilación de histonas en el promotor de NIS y el segundo mayor en las células HepG2. MKN-7 células muestran una relativamente modesta acetilación de histonas en el promotor de NIS. Es interesante observar que este modelo de la extensión de la acetilación de histonas en las tres celdas eco así los patrones de la medida de la expresión de NIS (Tabla 1, Fig. 2) y la absorción de yodo radiactivo (Fig. 3) en estas células, más el apoyo un importante papel de la acetilación de histonas en la expresión de NIS inducida por la orientación de la MAP cinasa y PI3K /Akt y HDAC. Esto no parece aplicarse a la celda T98G que mostró algunos acetilación de histonas en el marco del tratamiento con SAHA (Fig. 1), mientras que no hubo aumento en la expresión de NIS en esta célula (Tabla 1). Sin embargo, este nivel de acetilación de histona fue mínimo en comparación con la de muchas otras células (Fig. 1). Por lo tanto, la correlación de la expresión de NIS con la acetilación de histonas fue general clara en diversas células ensayadas.
Las células se trataron con SAHA solo o en combinación con SAHA RDEA119 y perifosine como se describe en la Fig. 2. Niveles de acetilación de histonas en las tres regiones (P1, P2, y P3) que comprenden el promotor esencial mínimo del gen
NIS
fueron analizados por análisis de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) como se describe en Materiales y Métodos. estado de acetilación de la histona H3 tanto y H4 se examinó usando anticuerpos específicos para el chip. anticuerpos IgG no específicas se utilizaron como control. Los resultados para M14, HepG2 y células MKN-7 se presentan en las Figs. 4a, 4b y 4c, respectivamente. Para cada celda, el panel superior muestra los resultados reales de PCR sobre los fragmentos de ADN obtenidos por chip usando anticuerpo IgG de control no específica, anti-acetilado H3 (Anti Ac-H3) o anti-acetilado anticuerpo H4 (Anti Ac-H4) . cantidades idénticas de pre-inmunoprecipitación de lisados celulares de diferentes condiciones de tratamiento se utilizaron para iniciar la inmunoprecipitación. Una alícuota de lisado de células pre-inmunoprecipitación se utilizó directamente para aislar el ADN como el control "de entrada". Los resultados de la PCR reflejan los niveles de acetilación de histonas. Presenta en el panel inferior de cada celda es un gráfico de barras que muestra cuantitativamente los niveles de acetilación de H3 y H4 en las tres regiones de
NIS
promotor basado en las mediciones de densitometría del panel superior. Los resultados se normalizaron dividiendo las señales de entrada correspondientes y se presentan como la relación entre el tratamiento indicado sobre el control. "Control", el tratamiento de las células con vehículo; "SAHA", el tratamiento de las células con SAHA solo; "R + P + S", el tratamiento de las células con el uso combinado de RDEA119, perifosine y SAHA.
Discusión
El yodo radiactivo ablación y la terapia adyuvante son los tratamientos tradicionales y estándar para el cáncer de tiroides , que se aprovecha de la función de yoduro-transporte única de NIS en la membrana celular de la tiroides. Teniendo en cuenta el hecho de que NIS también se expresa normalmente, en diversos grados, en varios tejidos no tiroideas, en el presente estudio hemos probado
NIS
absorción de expresión y yodo radioactivo en células de cáncer derivadas de tejidos no tiroideas suprimiendo simultáneamente la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt y HDAC. Aunque el papel de MAP cinasa y PI3K /Akt en la expresión de NIS se investigó en melanoma en nuestros estudios anteriores [21], el papel de la HDAC y acetilación de histonas en la expresión de
NIS
en melanoma no ha han investigado. Por lo tanto, también se incluyeron las células del melanoma en el presente estudio.
Hemos sido capaces de inducir la expresión de NIS, en diversos grados, en células de melanoma y hepático, gástrico, de colon y de células de carcinoma de mama, pero no en no epiteliales células del cerebro derivado de un tumor, lo que sugiere que esta expresión inducible NIS puede estar restringida a las células de cáncer de piel y células cancerosas de origen de células epiteliales. Esto es interesante consistente con el patrón de distribución de la absorción fisiológica de yodo radioactivo en los tejidos de la piel (fase de recuperación de quemadura), hígado, estómago, colon, y de mama (fase de lactancia) en la exploración corporal de pacientes con cáncer de tiroides después del tratamiento con yodo radioactivo [24 ] - [27]. Sorprendentemente, también demostró captación de yodo radioactivo después de la expresión inducida de NIS, en consonancia con la funcionalidad de NIS en estas células cancerosas no tiroideas. Nuestros datos también por primera vez mostraron que el aumento de la acetilación de histonas en el
NIS
promotor era un importante mecanismo implicado en la expresión de NIS en estas células cancerosas no tiroideas.
inducida por inhibidor de HDAC NIS expresión se ha demostrado previamente en células HeLa y, como en el mismo estudio, en células HepG2 [28]. Para dar un paso más, hemos demostrado recientemente un efecto sinérgico de la SAHA inhibidor de HDAC en la expresión de NIS inducida por la supresión de la MAP cinasa y PI3K /Akt en células de cáncer de tiroides, aunque, en este estudio, la acetilación de histonas no fue examinado [13]. En el presente estudio, por primera vez demostrado directamente que la supresión de la MAP quinasa y PI3K /Akt mejorada acetilación de histonas en el
NIS
promotor como un mecanismo para la expresión de NIS inducida por la orientación de forma simultánea los dos vías y HDAC en células cancerosas humanas.
demostración de la expresión de NIS, tanto a nivel de ARNm y proteínas, así como la captación de yodo radioactivo en estas células establecidas el significado funcional de la expresión inducible del gen
NIS en estas células de cáncer no tiroideas. El nivel de expresión de NIS inducida varió entre las células de la prueba, con células de melanoma M14, hepática de células de carcinoma HepG2 y gástrica de células de carcinoma MKN-7 que muestra la expresión más robusto de NIS, lo que sugiere que la expresión de NIS y la absorción de yodo radioactivo pueden ser inducidas preferentemente en cierta casos específicos de estos tipos de cáncer, por razones poco claras. probablemente existen factores adicionales que determinan la capacidad de inducción de la expresión de NIS en estas células cancerosas, como lo demuestra el estado del receptor de estrógeno que determina la capacidad de inducción de la expresión de NIS por el ácido trans-retinoico en células de cáncer de mama [29]. Los resultados del presente estudio tienen importantes implicaciones clínicas. El melanoma, carcinoma hepático, carcinoma gástrico y son cánceres humanos comunes, todas con altas tasas de mortalidad, particularmente en metastásico y casos avanzados. Como estos últimos casos son generalmente quirúrgicamente inoperables, se necesitan con urgencia Actualmente novedosos tratamientos médicos eficaces. Con la capacidad de inducción de la expresión de NIS y la captación de radioyodo en estas células de cáncer demostrado en el presente estudio, puede ser posible para el tratamiento de estos cánceres utilizando yodo radioactivo adjunto como en el tratamiento para el cáncer de tiroides. El hecho de que indujo la expresión de NIS era particularmente robusto en algunas líneas celulares pero no en otros derivados de estos tipos de cáncer sugiere que este tratamiento con yodo radiactivo puede ser eficaz en un subgrupo de pacientes con estos cánceres.
Los agentes terapéuticos destinados a importantes vías de señalización, tales como inhibidores de MEK y BRAF para la vía de la MAP quinasa y los inhibidores de Akt y mTOR para la vía PI3K /Akt, así como inhibidores de HDAC, se está desarrollando actualmente activa clínicamente [30] - [33]. Muchos de ellos han mostrado un fuerte potencial terapéutico en diversos cánceres humanos y algunos han sido aprobados para uso clínico. Por tanto, es clínicamente posible usar estos inhibidores para orientar la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt y algunos de ellos en combinación para suprimir dualmente las dos vías para inducir la expresión de NIS. El inhibidor de HDAC SAHA, que también ha sido aprobado para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer [34], puede ser incluido en esta terapia de combinación de drogas para mejorar la expresión de NIS para tratamiento con yodo radioactivo de cánceres. Como estos fármacos son en sí mismos terapéutico inhibiendo directamente el crecimiento de células de cáncer, su uso en conjunción con el uso de yodo radiactivo para matar más células cancerosas podría hacer que el tratamiento de una quimioterapia aún más eficaz. Esto puede llegar a ser una nueva y estrategia terapéutica particularmente eficaz para el melanoma y carcinomas del sistema hepático y gastrointestinal. Esta técnicamente fácil estrategia de utilización de los medicamentos probados clínicamente para inducir la expresión de NIS y la captación de yodo radiactivo en las células cancerosas no tiroideas, si se confirma para ser eficaz en estudios futuros, podría llegar a ser superior a la expresión de NIS alcanzado por la transferencia de genes enfoques, ya que puede evitar cierta la seguridad, la especificidad, eficacia y problemas de complejidad técnicas relacionadas con la transferencia de genes ampliamente investigado por plásmidos o virus mediada por órgano-específica NIS [4], [14].
Curiosamente, los estudios previos demostraron una expresión basal de genes en células de la piel de la tiroides y las células de melanoma [35], [36]. Esto proporciona una base para la expresión de los genes inducidos robusta tiroides y captación de yodo radioactivo en células de melanoma por la orientación de la MAP cinasa y PI3K /Akt y HDAC en nuestros estudios actuales y anteriores [21]. También es posible, pero aún no se ha investigado que un estado de baja expresión basal de los genes de la tiroides existe de manera similar en los carcinomas hepáticos y gástricos y otros tipos de cáncer examinados en el presente estudio que se hace robusta activo tras la supresión de las principales vías de señalización.
en resumen, el presente estudio, por primera vez demuestra la expresión de NIS robusto y captación de yodo radioactivo en varias células cancerosas no tiroideas por la orientación al mismo tiempo la MAP quinasa y de las vías PI3K /Akt y HDAC usando sus inhibidores. Como muchos de estos inhibidores han sido ya demostrado ser clínicamente factible y prometedor en la inhibición de diversos tipos de cáncer, su uso para inducir también la expresión de NIS para el tratamiento adyuvante con yodo radioactivo, además de su inhibición directa de las células cancerosas puede llegar a ser una nueva y estrategia terapéutica eficaz para los cánceres de tiroides no seleccionados.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer humano
Trece líneas celulares de cáncer humano se utilizaron en este estudio, incluyendo las células de melanoma M14, UACC- 62 y A375; células de carcinoma hepático HepG2 y SK-Hep-1; células de carcinoma gástrico MKN-7 y NUGC-4; células de carcinoma de colon HT-29 y RKO; células de carcinoma de mama BT-20 y MDA-MB-231; celular de glioblastoma T98G; y astrocitoma de células SNB-78. Estas células eran de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y NCI-Frederick cáncer DCTD línea tumoral /célula repositorio (Frederick, MD). M14, UACC-62, MKN-7, NUGC-4 y SNB-78 células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) con suero bovino fetal 10% (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, BT-20, MDA-MB-231, HepG2, células SK-Hep-1, y T98G se cultivaron en Eagle medio esencial mínimo (ATCC, Manassas, VA) con suero bovino fetal 10%. Las células HT-29 se cultivaron en medio 5A de McCoy (ATCC, Manassas, VA) con suero bovino fetal 10%. Las células A375 se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (ATCC, Manassas, VA) con suero bovino fetal 10%. Todas las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2.
Bajo estas condiciones de cultivo, se trataron las células, donde se indica, con el RDEA119 inhibidor de MEK, el perifosine inhibidor de Akt, y la HDAC inhibidor de SAHA individualmente o en combinaciones. DMSO y PBS se utilizaron en paralelo, como el control del vehículo.
Western Blot
Las células se lisaron en tampón RIPA con inhibidores de proteasa estándar (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y Western Blot estándar los análisis se realizaron como se describe anteriormente [37] utilizando anticuerpos primarios, incluyendo anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-Akt, anti-Ac-histona H3, o anti-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-histona H4-Ac (Señalización Celular, Danvers, MA); o anticuerpos anti-NIS (Millipore Corp., Billerica, MA).
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
Después de un tratamiento de 30 h de células con inhibidores de la indicada, el ARN total se aisló usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tres g ARN total fue inverso-transcrito utilizando cebadores oligo-dT y superíndice III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Cuantitativa en tiempo real PCR se preformados para analizar la expresión de la
NIS
génica utilizando SYBR Green Supermix iTaq con ROX (Bio-Rad, Hercules, CA) en un sistema ABI 7900HT PCR (Applied Biosystems, Foster City, CALIFORNIA). ß-actina se realizó en paralelo para estandarizar el cDNA de entrada. Los cebadores diseñados para
NIS Opiniones y
genes beta-actina y los métodos utilizados para calcular los niveles de expresión relativa de
NIS
eran como se describe anteriormente [13].
captación de yoduro radiactivo ensayo
El ensayo de captación de yoduro radiactivo se realizó tal como se describe anteriormente [13]. En pocas palabras, después de un tratamiento de 30 h con los inhibidores indicados, las células se incubaron con 1 Ci Na
125I y 5 mM no radiactivo NaI en 2 ml de medio en placas de 6 pocillos a 37 ° C durante 1 hr. Para determinar la absorción de NIS-específica, las células paralelas tratados de manera similar con los inhibidores se trataron adicionalmente con 200 M NaClO
4 durante 30 min antes de la Na tratamiento
125I. El medio se aspiró y las células se lavaron rápidamente tres veces con solución salina equilibrada de Hank (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las células fueron tripsinizadas y se lisaron con 1 ml de NaOH 0,33 M. Se utilizaron placas paralelas de células tratadas de manera idéntica con los inhibidores pero sin incubación con yodo radioactivo para determinar el número de células al final del experimento. La radiactividad asociada con las células se contó con un contador gamma y se presenta como cpm /10
6 células después de la corrección para la unión no específica radio yoduro de las células en presencia de NaClO
4.
inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP) ensayo de
chip de ensayo se realizó utilizando el EZ-Magna chip Un kit (Millipore Corp., Billerica, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En pocas palabras, después de los tratamientos con fármacos, 1 × 10
7 células fueron reticulado con 37% de formaldehído durante 10 min, seguido de incubación con la solución de glicina proporcionado en el kit de 5 min. Después de 2 lavados con PBS, las células se lisaron y se sonicaron 12 veces durante 10 segundos a una potencia del pulso de 20% usando el Cell Disruptor Sonifier Modelo Micros-150D (Branson, Danbury, CT). La proteína /ADN reticulado se incubó posteriormente durante la noche con anti-acetilada de la histona H3, anticuerpos de anti-histona H4 acetilado o controlar IgG no específica, y se purifica usando perlas de proteína A. Después de lavar con las memorias intermedias en el kit en el orden según el protocolo, cuentas proporcionadas de proteína A con la proteína /complejos de ADN se incubaron con proteinasa K a 62 ° C durante 2 horas con agitación. Los fragmentos de ADN se separaron posteriormente mediante centrifugación y se purificaron usando columnas de centrifugación. Tres pares de cebadores que abarcan el área mínima promotor esencial del gen NIS se utilizaron en el análisis como se describe anteriormente [23]. Estándar de punto final PCR se realizó como sigue: después de 3 min de desnaturalización a 95 ° C, la mezcla de reacción se realizó durante 32 ciclos a 94 ° C, 60 ° C, y 72C ° cada uno durante 30 segundos, seguido por un alargamiento a la 72 ° C durante 8 minutos (para los tres pares de cebadores).
Análisis estadístico
Los datos presentados aquí son representantes de al menos dos experimentos similares realizados por duplicado o triplicado. Las diferencias entre grupos fueron analizadas por
t
prueba y un
P
valor inferior a 0,05 fue considerado significativo.