Extracto
Antecedentes
La chaperona molecular Hsp90 es una nueva diana prometedora en la terapia del cáncer y los inhibidores selectivos de Hsp90 están actualmente en ensayos clínicos. Anteriormente estos inhibidores se han reportado para inducir o bien la detención del ciclo celular o la muerte celular en las células cancerosas. Si la detención del ciclo celular es reversible o irreversible en general no ha sido evaluado. Aquí hemos examinado en detalle la detención y muerte celular respuestas del ciclo celular de líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas humanos a la inhibición de Hsp90.
Metodología /Principales conclusiones
En ensayos de MTT, el cáncer de pulmón de células pequeñas células mostraron una respuesta bifásica a los inhibidores de Hsp90 geldanamicina y radicicol, con concentraciones más bajas produciendo detener la proliferación y altas concentraciones que causan la muerte celular. Evaluación de la actividad intracelular de Hsp90 utilizando la pérdida de expresión de la proteína cliente mostró que las concentraciones de geldanamicina que inhibieron Hsp90 correlacionan estrechamente con los que causan detener la proliferación, pero no la muerte celular. La detención proliferación inducida por bajas concentraciones de geldanamicina no se revirtió durante un período de más de treinta días después de la eliminación del fármaco y las características de senescencia mostró. poblaciones raras de células de cáncer de pulmón de células pequeñas variantes podrían ser aislados que tenía alteraciones genéticas adicionales y ya no se sometió a detener la proliferación irreversible en respuesta a los inhibidores de Hsp90
Conclusiones /Importancia
Llegamos a la conclusión de que:. ( 1) la inhibición Hsp90 induce principalmente la senescencia prematura, en lugar de la muerte celular, en células de cáncer de pulmón de células pequeñas; (2) Las células de cáncer de pulmón de células pequeñas pueden pasar por alto esta senescencia mediante nuevas alteraciones genéticas; (3) Hsp90 inducida por inhibidores de la muerte celular en células de cáncer de pulmón de células pequeñas es debido a la inhibición de un objetivo que no sea citosólica Hsp90. Estos resultados tienen implicaciones con respecto a la forma en que estos inhibidores se comportarán en ensayos clínicos y para el diseño de inhibidores de futuros en esta clase
Visto:. Restall IJ, Lorimer UIM (2010) La inducción de la senescencia prematura por Hsp90 inhibición en cáncer de pulmón microcítico. PLoS ONE 5 (6): e11076. doi: 10.1371 /journal.pone.0011076
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 7 de Diciembre, 2009; Aceptado el 17 mayo del 2010; Publicado: 11 Junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Restall et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas a IL de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (number62797 subvención) (http://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) y la Sociedad canadiense del cáncer (número de concesión 020121) (http :? //www.cancer.ca/canada-wide.aspx sc_lang = es). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción funciones
Hsp90 como acompañante en las células normales, promoviendo el plegamiento correcto de las proteínas y las proteínas recién sintetizadas que han sido desnaturalizadas parcialmente debido al estrés [1]. Parece ser principalmente involucrados en las últimas etapas de plegado, probablemente mediante el reconocimiento de superficies hidrofóbicas expuestas en proteínas parcialmente plegadas. El mecanismo básico de plegamiento de la proteína inducida por Hsp90 implica conmutación conformacional entre conformaciones abierta y cerrada que es regulado por la hidrólisis de ATP [2]. Las tasas de hidrólisis de ATP Hsp90 son controlados a su vez por su asociación con diversos cochaperones.
A pesar de que el número de proteínas conocidas para requerir Hsp90 para el plegamiento correcto sigue aumentando, la Hsp90 es claramente selectiva para un subconjunto de proteínas celulares. Estos incluyen un número de proteínas con actividad oncogénica conocidos, incluyendo Her2, Raf1 y Cdk4 [3]. En algunos casos Hsp90 muestra asociación preferencial con el mutante de formas oncogénicas de las proteínas; esto se ha demostrado tanto para la quinasa Src y el receptor EGF [4] - [6]. Hsp90 también muestra una mayor asociación con cochaperones y la actividad ATPasa mayor en las células cancerosas, tanto
in vitro
y
in vivo
[7]. Por estas razones existe un interés considerable en Hsp90 como un objetivo para la terapia del cáncer.
geldanamicina y radicicol son dos productos naturales no relacionados estructuralmente que se unen al sitio de unión de ATP de Hsp90, el bloqueo de la bicicleta conformacional que es necesaria para su actividad chaperona. Estos compuestos muestran buena selectividad para Hsp90, a pesar de que también se unen a la Hsp90 retículo endoplasmático paralog Grp94 y la Trap1 paralog mitocondrial Hsp90 en concentraciones más altas [8] - [10]. Aunque estos compuestos establecen en principio que Hsp90 es un objetivo "druggable" desde la perspectiva de la farmacología, la pobre solubilidad y toxicidades no específicas hacen inadecuados para uso en humanos. versiones derivatizadas de geldanamicina han sido producidos que han mejorado las propiedades farmacológicas, aunque todavía tienen algunas de las limitaciones del compuesto original [11]. A pesar de esto, hay evidencia de algunos ensayos que la inhibición Hsp90 es alcanzable, basado en el análisis de biomarcadores en los linfocitos de los pacientes [12], [13] y las muestras tumorales [14]. También hay alguna evidencia de la actividad contra el cáncer [15]. Recientemente Hsp90 inhibidores novedosos han sido desarrollados que no tienen las limitaciones de los compuestos anteriores, y éstas entran ahora en ensayos clínicos [11]. Con estos avances en la farmacología de la inhibición de la Hsp90, una nueva área crítica de la investigación será la identificación de subgrupos de pacientes con cáncer que tienen más probabilidades de beneficiarse de la inhibición de Hsp90.
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. Alrededor del 15% de los cánceres de pulmón son de un subtipo conocido como cáncer de pulmón de células pequeñas. Este tipo de cáncer por lo general se presenta como enfermedad metastásica y por lo general no se trata con cirugía. Este tipo de cáncer generalmente responde muy bien a la radioterapia y la quimioterapia inicialmente, pero la mayoría de los pacientes con recidiva de la enfermedad resistentes y mueren dentro de dos años [16]. La mayoría de los cánceres de pulmón de células neuroendocrinas tienen propiedades y secretan hormonas polipeptídicas activa [17]. Estas hormonas secretadas causan una variedad de síndromes paraneoplásicos que son complicaciones comunes de cáncer de pulmón de células pequeñas.
Aquí hemos investigado la respuesta de las células de cáncer de pulmón de células pequeñas a la inhibición de Hsp90. Un estudio anterior había demostrado que los inhibidores de Hsp90 inducir la muerte celular en las células pequeñas de cáncer de pulmón de células a través de la activación de la vía intrínseca de la apoptosis [18]. Nuestros resultados son consistentes con esto, pero se observó que la muerte celular sólo se produce a concentraciones mucho más altas que las requeridas para la inhibición de Hsp90 citosólico. Observamos que el tratamiento de pequeñas células de cáncer de pulmón de células con inhibidores de Hsp90 en concentraciones que son suficientes para inhibir citosólica Hsp90 induce senescencia prematura en lugar de muerte celular.
Resultados
respuesta del cáncer de pulmón de células pequeñas humano líneas celulares a la inhibición Hsp90
La línea humana de células pequeñas de pulmón de células de cáncer H69 mostró una respuesta bifásica con el tratamiento con un intervalo de concentraciones de geldanamicina (Figura 1A). En un ensayo de MTT, una exposición de 48 h de las células a 0,1 mM geldanamicina disminuyó el número de células viables en aproximadamente un 40%. El aumento de la concentración de geldanamicina de hasta 3 M no causó una mayor disminución en el número de células viables. Con concentraciones de geldanamicina & gt; 4 M, el número de células viables se redujeron a H69 esencialmente cero. Radicicol, un segundo inhibidor de Hsp90 que es estructuralmente no relacionados con geldanamicina, también dio una curva de respuesta a la dosis bifásica con H69 células, aunque con una fase de meseta menos distintas (Figura 1B). Otras dos líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas (H187 y H889) muestran también una respuesta bifásica a geldanamicina (figura 1C y D); sin embargo, la línea de células de glioblastoma U87MG mostró sólo la primera fase de esta respuesta (
es decir
. la fase visto a bajas concentraciones geldanamicina) (Figura 1E).
A, ensayo MTT de las células tratadas H69 con geldanamicina durante 48 h; B, ensayo de MTT de las células tratadas con H69 radicicol durante 48 h; C, el ensayo de MTT de las células de cáncer de pulmón de células pequeñas H187 con geldanamicina para el 12, 36 y 60 h; D, ensayo de MTT de las células H889 tratadas con geldanamicina durante 48 h; E, ensayo de MTT de las células de glioblastoma U87MG tratados con geldanamicina durante 48 h; F, las células H69 tratadas con geldanamicina durante 48 h y se ensayaron para (•) de células viables (○) y recuentos totales usando un analizador de la viabilidad celular XR-célula Vi. Las barras de error muestran la media ± SE de tres repeticiones.
A medida que la primera fase podría ser potencialmente ya sea debido a la inhibición de la proliferación celular o la muerte selectiva de un subconjunto de células de SCLC, se realizaron ensayos adicionales para distinguir entre estas posibilidades. La respuesta de las células H69 con el tratamiento con un intervalo de concentraciones de geldanamicina se ensayó mediante recuento de células, usando exclusión de azul de tripano para distinguir células vivas de las células muertas (Figura 1f). Los recuentos de células vivas también mostraron una respuesta bifásica cuando se ensayó por este método. recuentos de células totales fueron similares a vivir los recuentos de células en la primera fase de la curva de respuesta bifásica pero divergieron en la segunda fase. Estos datos muestran que geldanamicina induce principalmente detener la proliferación en células H69 a bajas concentraciones, pero induce la muerte celular a altas concentraciones. Los datos de la Figura 1C, que muestran ensayos de MTT en células H187 tratadas durante diferentes períodos de tiempo (12, 36 y 60 h) con geldanamicina, son consistentes con esta conclusión, ya que la primera fase sólo es evidente con los tratamientos más largos cuando hay tiempo para la proliferación celular significativa a tener lugar en el control. Esto también demuestra que la muerte de las células en concentraciones altas geldanamicina sucede con relativa rapidez (
es decir
en menos de 12 h).
Respuesta de células H69 después de la retirada de la Hsp90 inhibición
detener la proliferación inducida por las drogas puede ser reversible o irreversible (
es decir
senescencia similar). Para distinguir entre estas posibilidades, H69 células se trataron con diferentes concentraciones de geldanamicina durante dos días. A continuación se retiró de drogas y se monitorizaron los recuentos de células viables. La proliferación celular se recuperó de tratamiento con concentraciones de geldanamicina de 50 nM o menos. Sin embargo, después del tratamiento con 100 nM geldanamicina, una población de células viables se mantuvo que no aumentó durante un periodo de tiempo superior a treinta días después de la retirada del fármaco (Figura 2A). Se obtuvieron resultados similares con las pequeñas líneas celulares de cáncer H187 y H889 de pulmón de células (Figura 2B y la Figura S1A) y en H69 células tratadas con la Hsp90 clínicamente relevante inhibidor de 17-AAG (Figura 2C). células H69 requiere un mínimo de 24 h de exposición a la geldanamicina para inducir la detención irreversible la proliferación (Figura 2D) y la inducción de la detención irreversible la proliferación no se vio afectada por la inhibición de caspasas (Figura 2E). Para la comparación el mismo experimento se realizó en la línea celular de glioblastoma humano U87MG (Figura 2F). Estas células se recuperan de crecimiento después del tratamiento con 100 nM geldanamicina y también se recuperan de un tratamiento con una concentración diez veces más alta de geldanamicina. La detención proliferación sostenida inducida por geldanamicina, por tanto, no es una respuesta universal de las células cancerosas, sino más bien es el cáncer de tipo por células específica.
células fueron tratadas durante 48 h con la concentración indicada de inhibidor, que fue retirado a continuación. el recuento de células viables se determinaron luego en los tiempos indicados después de la eliminación del inhibidor. A, las células H69 tratadas con geldanamicina; B, las células H187 tratadas con geldanamicina; C, las células H69 tratadas con 17-AAG. D, las células H69 se trató con 100 nM geldanamicina de 4, 12 o 24 h. E, células H69 se trataron durante 48 h con 100 nM geldanamicina en ausencia o presencia de 100 mM Z-VAD-FMK, un inhibidor general de caspasa. tratamiento Z-VAD-FMK se inició 1 h antes de la adición de geldanamicina. F, células U87MG tratado con geldanamicina.
Para confirmar la detención del crecimiento sostenido por un segundo método, también se evaluó la incorporación de BrdU en células H69 que habían sido expuestos a 100 nM geldanamicina. De acuerdo con el recuento de células viables, este ensayo mostró que las células H69 no se recuperaron su capacidad proliferativa después de la eliminación geldanamicina (Figura 3A).
A. células H69 se trataron durante 48 h con 100 nM geldanamicina. entonces Geldanamicina se eliminó. Seis u ocho días después de la eliminación de drogas, 25.000 células tratadas (GA) por pocillo se sembraron en noventa y seis placas de pocillos junto con el mismo número de células H69 no tratados para la comparación (sin GA). Las células se dejaron a la absorción de BrdU durante 16 h y luego la incorporación de BrdU se ensayó como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados se normalizaron a los valores de las células no tratadas. Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de seis repeticiones. B. Las células fueron tratadas durante 48 h con geldanamicina. Total de lisados de células se recogieron y se analizaron por transferencia Western utilizando anticuerpos para las proteínas indicadas. El panel inferior muestra una transferencia manchado de proteína total con negro amido antes de la incubación del anticuerpo. Igual cantidad de DMSO se añadieron a las células para cada tratamiento, excepto en el carril más a la izquierda, donde se omitió DMSO.
Los cambios en las proteínas Hsp90 cliente y proteínas de choque térmico en respuesta a la inhibición Hsp90
Los efectos de diferentes concentraciones de geldanamicina en clientes Hsp90 conocidos también se evaluaron en células H69 (Figura 3B, la derecha cuatro carriles de blot). agotamiento sustancial de la Hsp90 proteínas cliente Cdk4 y Raf1 se observaron a concentraciones de geldanamicina tan bajas como 50 nM. Una segunda respuesta bien descrito de las células a la inhibición de Hsp90 es la inducción de otras proteínas de choque térmico que se produce por la activación de Hsf1 [19]. Como con las respuestas de proteínas cliente, las concentraciones de geldanamicina tan bajas como 50 nM provocó un aumento en Hsp70, Hsp27 y Hsp90α /β. Estas concentraciones de geldanamicina paralelos a los que causan la detención proliferación, pero son alrededor de 100 veces menos que las concentraciones que causan la muerte celular sustancial.
U87MG y células H69 mostraron sensibilidades muy similares a geldanamicina con respecto a disminuciones de proteínas cliente y de choque térmico aumentos de proteína (Figura 3B). Esto indica que la diferencia de comportamiento entre las células H69 y U87MG después de la eliminación de geldanamicina no es una consecuencia de las diferencias en el metabolismo de fármacos (
por ejemplo
múltiples fármacos transportador de actividad o diaforasa actividad, ambos de los cuales afecta a la actividad geldanamicina [20], [21]). Más bien parece que las diferentes respuestas de estas células después de la retirada de geldanamicina se deben a diferencias que son aguas abajo de la inhibición de Hsp90. Western blot confirmó que carecían de células H69 p53 detectable (Figura 3B), de acuerdo con Smith
et al
., quienes demostraron que existe una mutación de parada en
P53
exón 5 en esta celda línea [22]. p16Ink4a estaba presente en células H69 y sus niveles no se vieron afectados por el tratamiento con geldanamicina durante 48 h (Figura 3B).
marcadores de senescencia en células de cáncer de pulmón de células pequeñas crecimiento detenido
La detención proliferación irreversible inducida por la inhibición de Hsp90 en células de cáncer de pulmón de células pequeñas sugiere que estas células se habían convertido en senescentes. Para evaluar más a fondo, se evaluaron marcadores adicionales de la senescencia. La figura 4A muestra la morfología de cultivos en suspensión de células H69 tratadas ocho días después de la eliminación geldanamicina. Las células tratadas muestran cierta ampliación y el aumento de granularidad citoplásmica, rasgos característicos de las células senescentes. Otra característica común de las células senescentes es la presencia de focos asociada a la senescencia heterocromatina (SAHF) [23]. Consistente con la inducción de la senescencia, la inhibición de Hsp90 con geldanamicina condujo a la formación de SAHF en células H69 como se demuestra por tinción con DAPI (Figura 4B). SAHF se mantuvieron después de la eliminación de geldanamicina, como se esperaba para un marcador de senescencia y fueron enriquecidos en la histona H3 en la lisina 9 trimetilada, consistente con estudios anteriores (Figura S1B) [24]. La activación de una respuesta al daño del ADN es una característica importante de ambos senescencia replicativa y prematura que contribuye al fenotipo detención del crecimiento de las células senescentes [25]. Una característica central de la respuesta al daño del ADN es la generación de fosforilados histona H2AX (γH2AX) en los sitios adyacentes al daño del ADN. Ambos tratamientos geldanamicina y radicicol aumento de los niveles de γH2AX en células H69 (Figura s1c). γH2AX niveles permanecieron elevados durante un máximo de seis días después de la eliminación geldanamicina, el punto de tiempo más largo evaluado (Figura 4C). Esto es consistente con informes de que las células senescentes mantienen una respuesta al daño de ADN activado durante un período prolongado después de la inducción de la senescencia [25], [26].
A. células H69 se trataron con DMSO solo o 100 nM geldanamicina para 48 h. entonces Geldanamicina se eliminó. Ocho días más tarde se les permitió células que conformarse en cubreobjetos de poli-L-lisina, se fijaron con paraformaldehído y se fotografiaron bajo contraste de fase usando una lente objetivo 63X. B. Formación de SAHF después del tratamiento de las células con inhibidores de Hsp90. células H69 se trataron con DMSO o 100 nM geldanamicina para 48 h. Las células fueron fijadas, teñidas con DAPI y examinadas por microscopía de fluorescencia. células C. H69 fueron tratadas con DMSO (control) o 100 nM geldanamicina. DMSO y geldnamycin se retiraron a continuación en el día 0. lisados de células totales se recogieron en los días indicados después de la eliminación geldanamicina y se analizaron para γH2AX y H2AX niveles por transferencia Western. La densitometría muestra el gráfico para el análisis de Western blot de tres réplicas biológicas. Los datos se normalizaron a las células de control tratadas con vehículo y se muestran como la media ± SE.
El aislamiento de la variante de células H69 que omiten geldanamicina la senescencia inducida por
Mientras que las células H69 mantuvo una estado de proliferación a ser detenido por más de treinta días después de la eliminación de geldanamicina, después de aproximadamente cuarenta días a la población de células empezó a proliferar en un experimento. Hemos denominado a esta población como H69 /41d células. H69 /41d células tienen una morfología distinta: mientras H69 células son células no adherentes que forman agregados irregulares, las células variantes, mientras que también no adherente, formar esferas apretados que recuerdan a los observados con poblaciones de células madre (Figura 5A). Tras la repetición de pruebas, estas células todavía se sometieron a arresto proliferación en respuesta a 100 nM geldanamicina, pero fueron capaces de recuperar la capacidad proliferativa tras la retirada del fármaco, similar a lo que hemos observado en las células de glioblastoma (Figura 5B). H69 /41d células también fueron capaces de recuperar la capacidad proliferativa después del tratamiento con el inhibidor de radicicol Hsp90 (Figura 5C). En comparación con la línea de células H69 padre, H69 /41d células mostraron respuestas similares a la inhibición de Hsp90 con respecto a la inhibición de la proliferación en presencia de fármaco, aunque la muerte celular tendió a ocurrir a concentraciones ligeramente más bajos que los observados con H69 células (Figura 5D). La degradación de proteínas cliente y la inducción de otras proteínas de choque térmico también fue similar en las dos líneas celulares (Figura 6A). Como anteriormente, esto excluye diferencias en el procesamiento de drogas entre las dos poblaciones de células, y se indica que las diferencias se deben a eventos aguas abajo de la inhibición de Hsp90 que afectan específicamente si las células se someten a detener la proliferación reversible o irreversible. formación SAHF también fue afectada en H69 /41d células (Figura 6B). En H69 células, SAHF se detectaron máximo en aproximadamente el 35% de las células (Figura 6C). En contraste, el tratamiento geldanamicina sólo causó un modesto aumento en SAHF en H69 /41d células y SAHF se detectaron en 4,5% de las células máximamente (Figura 6C).
A. Las fotografías de H69 y H69 /41d células bajo un microscopio de fase, al (paneles superiores) y bajas (paneles inferiores) de gran aumento; B. H69 y H69 /41d células fueron tratadas con 100 nM geldanamicina para 48 h. a continuación, geldanamicina se retiró y las células viables se evaluaron en los tiempos indicados después de la eliminación del fármaco. C. H69 y H69 /41d células fueron tratadas con radicicol 5 M durante 48 h. a continuación, radicicol se retiró y las células viables se evaluaron en los tiempos indicados después de la eliminación del fármaco. ensayo D. MTT de H69 /41d células tratadas durante 48 h con geldanamicina.
H69 y se trataron 41d células /H69 para 48 h con geldanamicina o DMSO como control del vehículo. A. Total de lisados de células se recogieron después del tratamiento 48 h y se analizaron por transferencia de Western como en la Figura 3. Las células tratadas con DMSO B. se tiñeron para SAHF 2 días después de retirar el DMSO. células geldanamicina tratados se tiñeron para SAHF 2, 4 y 6 días después de la eliminación del fármaco. Imágenes de microscopía de fluorescencia representativos de H69 y H69 /41d núcleos celulares, seis días después de la eliminación de geldanamicina, se muestran. C. SAHF en H69 (gris claro) y H69 /41d células (gris oscuro) se contaron en los tiempos indicados después de la eliminación del fármaco. Los datos se expresan como el porcentaje de núcleos que son SAHF positivo. Las barras muestran el porcentaje medio ± SE. extractos de células totales de D. H69 H69 células sin tratar y /41d se analizaron para la expresión de la proteína p21 mediante transferencia Western.
Para evaluar directamente la relación genética de las células H69 con H69 /41d células, el ADN era aislado de las dos líneas celulares y analizados utilizando Affymetrix SNP en todo el genoma humano de matriz 6,0 chips, que contienen sondas de 900.000 polimorfismo de nucleótido único y un número similar de sondas para evaluar la variación del número de copias. Figura S2 muestra cariotipos de las dos líneas celulares reconstruidas a partir de estos datos (cada uno se compara con un cariotipo referencia Affymetrix). células H69 muestran extensas aberraciones cromosómicas como se esperaba para las células cancerosas. Estas pérdidas, las ganancias y las regiones de la variación del número de amplificación /copia son muy similares entre H69 y H69 /células 41d, muestran inequívocamente que son clonal relacionada. Algunas diferencias fueron evidentes entre las dos líneas celulares. Estos incluyen una deleción de 4,8 Mbps en la copia única del cromosoma 2 que contiene aproximadamente mil genes y un 9,6 Mbp eliminación de una copia del cromosoma 11 que contiene aproximadamente 83 genes. También hay una ganancia del brazo largo del cromosoma 3 y una pérdida de un brazo largo del cromosoma 15. parcial Sin embargo, el análisis del número de SNP /copia no apuntaba a un solo locus genético definido que podría explicar por qué H69 /41d son células capaz de evadir Hsp90 senescencia inducida por inhibidor. Como segundo enfoque para determinar el mecanismo por el cual estas células evaden Hsp90 senescencia inducida por inhibidores de, se seleccionaron las células para un número de proteínas que han demostrado tener papeles importantes en la senescencia. p21 (CDKN1A, p21Waf1 /Cip1) es un tal proteína que es de particular interés ya que se ha demostrado que induce la senectud en las células cancerosas que carecen de p53 [27]. p21 se expresa en células H69, pero es indetectable en H69 /41d células (Figura 6D). Dada su conocido papel en la inducción y mantenimiento de la senescencia [26], la pérdida de expresión de p21 proporciona una explicación plausible para el fracaso de H69 /41d células a someterse a la senescencia en respuesta a los inhibidores de Hsp90.
Discusión
En estudios anteriores, la respuesta más comúnmente descrita de las células cancerosas a la inhibición Hsp90 ha sido la detención del ciclo celular. Esta detención del ciclo celular en general, se ha supuesto que ser reversible en la naturaleza, aunque la mayoría de los estudios no abordan directamente. La detención del crecimiento puede ocurrir ya sea en el G1 /S o G2 /M transición [28], [29] y es probable que sea consecuencia de la dependencia de Hsp90 de las proteínas tales como CDK4, cdc2 y polo-como quinasa [30] - [ ,,,0],32]. En un subgrupo de tipos de células de cáncer, los inhibidores de Hsp90 se han demostrado inducir apoptosis. Estos incluyen pequeñas células de cáncer de pulmón de células y células de mieloma múltiple [18], [33].
Aparte de la detención del ciclo celular y la muerte celular transitoria, tercera destino celular para las células del cáncer es la senescencia. Para las células de cáncer, esto se refiere a veces como "prematuro" o "acelerada" senescencia celular para distinguirla de la senescencia replicativa que las células normales se someten al alcanzar su límite de Hayflick [34], [35]. La senescencia en el cáncer se ha estudiado en dos contextos: la primera de ellas es la senescencia visto en respuesta a la activación de oncogén, en las que puede desempeñar un papel en la protección de organismos de desarrollar cáncer; la segunda de ellas es como una respuesta a la terapéutica del cáncer [36]. Los agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN parecen inducir la senescencia a un grado mucho mayor que los agentes que se dirigen a los microtúbulos [37]. Esto es más probable que ocurra con la exposición a dosis más bajas de drogas, con dosis más altas causan apoptosis. la senescencia inducida por la quimioterapia se ha observado tanto en cultivos celulares y en modelos animales [38].
La clave, características definitorias de las células senescentes son que permanecen metabólicamente activo, pero se someten a una retirada sostenida del ciclo celular que es no se invierte por estímulos mitogénicos estándar. Después de la exposición transitoria a bajas concentraciones de geldanamicina, las pequeñas células de cáncer de pulmón de células permanecieron vivos y metabólicamente activa (como se indica por exclusión de azul de tripano y ensayos de MTT). Sin embargo, estas células se sometieron a una detención proliferación que se mantuvo durante más de treinta días, a pesar de la adición regular de medio fresco que contenía suero de ternera fetal, una rica fuente de mitógenos. La detención fue evidente la proliferación tanto de los recuentos de células vivas y de ensayos de incorporación de BrdU
.
Además de detener la proliferación permanente, otros marcadores de senescencia se han desarrollado, aunque ninguna de ellas se considera actualmente como un marcador definitivo de el estado senescente [39]. Un conjunto característico de cambios morfológicos se han descrito para las células senescentes que incluyen la ampliación celular y un aumento de la granularidad del citoplasma [40]. Estas características fueron evidentes en las células de cáncer de pulmón de células pequeñas H69 en el que detener la proliferación había sido inducida por los inhibidores de Hsp90 sostenida. (No muestran el aplanamiento se describe para las células adherentes, como los pequeños células de cáncer de pulmón de células utilizadas en este estudio crecer en suspensión.) SAHF son otro marcador que se observa comúnmente en células senescentes y que se piensa que tienen un papel en el mantenimiento de la fenotipo senescente. SAHF estaban presentes en pequeñas células de cáncer de pulmón de células en las que la detención había sido la proliferación inducida por los inhibidores de Hsp90 sostenido. La expresión de SAHF se mantuvo durante hasta seis días después de la eliminación del inhibidor de Hsp90 (el punto de tiempo más largo examinada) y la evolución en el tiempo de su aparición fue similar a los estudios anteriores sobre la inducción de la senescencia prematura por diversos agentes [41], [42] . La activación de la respuesta al daño de ADN también se observa con frecuencia en la senescencia, donde tiene un papel tanto en la iniciación y mantenimiento del fenotipo senescente [25], [26]. inhibidores de Hsp90 (tanto geldanamicina y radicicol) activan una respuesta al daño del ADN que se mantuvo después de la eliminación de inhibidores. Este hallazgo también es consistente con un fenotipo de senescencia y proporciona un mecanismo por el que estos inhibidores activan la senescencia.
daño en el ADN, ya sea telomérica o no telomérica, es el inductor más ampliamente caracterizada de la senescencia. Además de ser un marcador de senescencia, la activación de la respuesta al daño de ADN por los inhibidores de Hsp90 también proporciona un mecanismo por el que inducen la senescencia en células de cáncer de pulmón de células pequeñas. Estudios anteriores también han señalado una relación entre la Hsp90 y daños en el ADN:. tanto la telomerasa y la vía de respuesta al daño del ADN anemia de Fanconi dependen de Hsp90 por su actividad [43], [44]
β- asociada a la senescencia galactosidasa (SAβgal) también ha sido ampliamente utilizado como un marcador de senescencia [35]. actividad SAβgal se detecta, como consecuencia de la expansión del compartimento lisosomal en las células senescentes, pero no se requiere para la inducción de la senescencia o mantenimiento [45]. Las pequeñas células de cáncer de pulmón de células tratadas con inhibidores de Hsp90 no fueron positivos para SAβgal. También adriamicina no indujo SAβgal en células de cáncer de pulmón de células pequeñas cuando se usa en concentraciones que indujeron este marcador en otros tipos de células cancerosas. Esto sugiere que SAβgal puede no ser un marcador útil de la senescencia en el cáncer de pulmón de células pequeñas. Una posible explicación es que estas células tienen escaso citoplasma y son células secretoras especializadas que pueden tener un relativamente pequeño compartimento lisosomal
Tomados en conjunto., Los datos anteriores muestran que los inhibidores de Hsp90 inducen un paro proliferación sostenida que tiene características consistentes con senescencia prematura. Este senescencia prematura se produjo a concentraciones de geldanamicina que se correlacionaron estrechamente con las concentraciones requeridas para inducir la degradación de proteínas Hsp90 cliente bien establecidos y para inducir la expresión de otras proteínas de choque térmico (un marcador ampliamente utilizado de la inhibición de Hsp90). senescencia prematura también fue inducida por 17-AAG (tanespimycin; 17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina), un derivado de geldanamicina que ha sido probado en ensayos clínicos [46]. 17-AAG inducía la senescencia en una concentración que es similar a las concentraciones alcanzadas en el plasma de los pacientes tratados con la dosis máxima tolerada de este compuesto [12], lo que sugiere que esta respuesta es clínicamente relevante. la inducción de la senescencia por los inhibidores de Hsp90 no requiere ni de p53 ni Rb, ya que ambos de estos supresores de tumores son conocidos por estar mutado en la línea celular H69 utilizado en este estudio.
En algunos experimentos, las poblaciones de células empezó a crecer después de cultivo a largo plazo de las células senescentes H69. Una de estas poblaciones de células, designado H69 /41d, se caracterizó en detalle. el análisis de SNP y el número de copias de estas células muestra que mientras que se derivan claramente de células H69 tienen un conjunto distinto de cambios genéticos. Estas células muestran respuestas similares a la inhibición de Hsp90 como el padre H69 células con respecto a la inhibición de la proliferación en presencia de fármaco y la inducción de la muerte celular a altas concentraciones de geldanamicina. Sin embargo se someten a un arresto proliferación reversible, en lugar de irreversible en respuesta a la inhibición de Hsp90. H69 /41d células también muestran respuestas idénticas a la línea celular progenitora con respecto a la degradación de proteínas cliente de Hsp90 y la inducción de otras proteínas de choque térmico. Por lo tanto esta forma de "resistencia" a la inhibición Hsp90 es claramente distinta de la descrita en estudios previos, en los que la resistencia era debido a alteraciones en las enzimas que metabolizan el fármaco y se reflejó en un requisito para las dosis más altas para ver los efectos celulares [47]. El aislamiento de estas células demuestra que, en principio, las pequeñas células de cáncer de pulmón de células con alteraciones genéticas adicionales pueden evadir la senescencia prematura inducida por Hsp90. p21 (CDKN1A) ha sido previamente demostrado ser un importante regulador de la senescencia, una propiedad que parece ser independiente de su actividad inhibidora contra quinasas dependientes de ciclina [48]. p21 es regulado por ambos mecanismos de p53 y p53 independiente y puede inducir sensescence en las células que carecen de p53 (como es el caso de las células H69) [27].