Extracto
Antecedentes
La terapia fotodinámica (PDT) utiliza la combinación de fármacos fotosensibilizantes y luz inofensiva para causar daño selectivo a las células tumorales. Por lo tanto, la TFD es una opción para la terapia focal de la enfermedad localizada o para tumores no resecables lo contrario. Además, cada vez hay más pruebas de que la PDT puede inducir inmunidad antitumoral sistémica, el apoyo de control de las células tumorales, que no fueron eliminadas por el tratamiento primario. Sin embargo, el efecto de la TFD no letal sobre el comportamiento y el potencial maligno de las células tumorales supervivientes PDT es molecularmente no está bien definido.
Metodología /Principales conclusiones
A continuación, los cambios que hemos evaluado en el transcriptoma de glioblastoma humano (U87, U373) y humano (PC-3, DU145) y las células de cáncer de próstata murino (TRAMP-C1, C2-TRAMP) después de no letal PDT
in vitro
y
in vivo
usando análisis de microarrays de oligonucleótidos. Se encontró que la respuesta global fue similar entre las diferentes líneas celulares y fotosensibilizadores tanto
in vitro
y
in vivo
. Los genes más prominente upregulated codifican proteínas que pertenecen a vías activadas por el estrés celular o están involucrados en la detención del ciclo celular. Esta respuesta fue similar a la respuesta de rescate de las células tumorales después de altas dosis de PDT. En contraste, se encontró que las células tumorales se ocupan de no letal PDT para regular al alza significativamente una serie de genes inmunes, que incluía los genes de quimioquinas
CXCL2
,
CXCL3
y
IL8 /CXCL8
, así como los genes de la IL-6 y su receptor IL6R, que pueden estimular reacciones proinflamatorias, mientras que IL-6 y IL6R también pueden mejorar el crecimiento del tumor.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que la TFD pueden apoyar las respuestas inmunes anti-tumorales y es, por lo tanto, una terapia racional, incluso si las células tumorales no pueden ser eliminados completamente por mecanismos fototóxicas primarias solo. Sin embargo, no letal PDT también puede estimular el crecimiento del tumor de promoción de bucles autocrinos, como se ve por la regulación al alza de IL6 y su receptor. Por lo tanto la eficacia de la PDT para tratar tumores se puede mejorar mediante el control de las vías de crecimiento-estimuladoras no deseados y potencialmente nocivos
Visto:. Kammerer R, Buchner A, Palluch P, Pongratz T, Oboukhovskij K, Beyer W, et al . (2011) La inducción de mediadores inmunes en el glioma y cáncer de próstata Las células mediante terapia fotodinámica no letal. PLoS ONE 6 (6): e21834. doi: 10.1371 /journal.pone.0021834
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: December 11, 2010; Aceptado el 13 de junio de 2011; Publicado: 30 de junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Kammerer y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Krebshilfe (107.320; http://www.krebshilfe.de/deutsche-krebshilfe.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la terapia fotodinámica (TFD) en oncología se basa en la acumulación selectiva de un fotosensibilizador (PS) en las células cancerosas, seguido de su activación por la luz de penetración del tejido de baja energía. En presencia de oxígeno, la excitado PS produce especies reactivas del oxígeno (ROS) tales como el oxígeno singlete, que son tóxicos para las células vivas [1].
Varios PS existir, que todos tienen sus ventajas y sus limitaciones. 5-amino-levulínico ácido (5-ALA) es un precursor natural de hemo en células de mamífero. Las células metabolizan 5-ALA a hemo, la producción de la protoporfirina IX (PpIX) como producto intermedio en sus mitocondrias. Debido a que la conversión de PpIX en heme es un paso limitante de la velocidad, PpIX se acumula en las células cancerosas como resultado de la captación preferencial y la retención de 5-ALA. PpIX se localiza intracelularmente a las mitocondrias y al citoplasma [2]. Photofrin®, por otro lado, es un fotosensibilizador exógeno que también se acumula en las células cancerosas, pero se encuentra en varias membranas celulares [3]. En general, la activación de PS que se dirigen a las mitocondrias conducir a la apoptosis de células de cáncer, mientras que PS que se asocian con las membranas celulares predominantemente inducir necrosis celular [2].
Originalmente, el objetivo de la PDT en oncología era eliminar completamente los tumores localizados . Sin embargo, la aplicación clínica de la TFD en el tratamiento del cáncer ha comenzado a cambiar. Recientemente, los regímenes de tratamiento se han aplicado los cuales buscan obtener vasculares-Targeting o antitumorales efectos inmunes [4] - [7]. Esto indica que la TFD también podría ser una opción de tratamiento racional para tumores no superficiales, como el cáncer de próstata y glioblastoma.
El cáncer de próstata es la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer para los hombres de América del Norte [8]. El tratamiento primario del cáncer de próstata incluye prostatectomía radical, la terapia de privación de andrógenos, la radioterapia y la braquiterapia transperineal. Todos estos tratamientos tienen una serie de efectos adversos que tienen un impacto considerable en los pacientes [9]. Debido a las mejoras en los tratamientos focales diagnóstico del cáncer de próstata temprano, como la crioterapia, ultrasonido focalizado de alta intensidad y el PDT se perfilan como nuevas opciones terapéuticas [10], [11]. El principal inconveniente de la terapia focal es la incertidumbre de la erradicación de células tumorales completo, sobre todo porque se sabe poco acerca de la respuesta de las células tumorales que se escapan de la terapia focal. Un escenario no deseado es que estas células tumorales ganancia aumentaron malignidad o comienzan a factores secretos que apoyan la proliferación o la infiltración de células cancerosas residuales de una manera paracrina.
glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más común y más agresivo de tumores cerebrales primarios en los seres humanos. El tiempo medio de supervivencia de los pacientes con GBM es de 14,6 meses [12]. Uno de los rasgos característicos de glioblastomas es su naturaleza infiltrante difuso [13]. Recientemente se ha observado que la resección guiada por fluorescencia y PDT repetitiva pueden prolongar significativamente la supervivencia media de los pacientes con GBM [14], [15]. Por otra parte, se informó que la supervivencia a largo plazo de los pacientes con GBM después de la TFD con sede en PpIX de otros estudios clínicos [16], [17]. A pesar de estas observaciones prometedoras diversas cuestiones tienen que abordarse para optimizar la TFD como una opción terapéutica para GBM. Por ejemplo, la respuesta de las células tumorales que sobreviven PDT debido a su infiltración avanzado en el tejido cerebral normal no está bien definido, pero podría ser un objetivo para una terapia adyuvante.
Hemos informado anteriormente de cómo el transcriptoma de el cáncer de próstata línea celular PC-3 responde a PDT basada en 5-ALA [18]. Sorprendentemente células PC-3 upregulated no sólo los genes de reparación del ADN y el estrés, sino también genes que codifican para proteínas que están implicadas en la regulación de la respuesta inmune, incluyendo ciertas citocinas y quimiocinas. Por lo tanto, queríamos saber si esta observación es válida para los otros PS, para otras líneas celulares de cáncer de próstata, para las células tumorales de otro origen tisular y para los tumores
in vivo
. Con este fin se analizaron comparativamente el genoma en toda la transcripción cambios después de bajo nivel, la TFD no letal en dos líneas celulares de próstata y glioblastoma humano cada una, en comparación con el transcriptoma de la línea de cáncer de próstata humano PC-3 después de 5-ALA y Photofrin basado en PDT y se analizaron los cambios en la transcripción de las células de cáncer de próstata murino por vía subcutánea trasplantado en ratones albinos C57BL /6 al PDT. Hemos observado, independiente del origen del tejido y el tipo de sensibilizador, una marcada estimulación de la transcripción de genes que codifican citoquinas proinflamatorias, que estimulan y atraen leucocitos predominantemente mieloides y, al mismo tiempo, la activación de genes que codifican proteínas implicadas en la detención del ciclo celular. En su conjunto, la destrucción incompleta inevitable de tejido tumoral con TFD en los ajustes clínicos incluso podría apoyar las respuestas inmunitarias antitumorales.
Resultados
Sensibilización e irradiación condiciones para no letal
in vitro
PDT
a fin de ser capaz de cargar de forma reproducible las células tumorales con fotosensibilizador se determinó la cinética y 5-ALA dependencia de la concentración de la formación de PpIX en las líneas de células tumorales utilizadas. Se seleccionaron dos de próstata humano (PC-3, DU145) y dos líneas celulares de glioblastoma (U87, U373), así como líneas celulares de carcinoma de próstata murino TRAMP-C1 y TRAMP-C2 que se derivan de los tumores de la línea de ratón transgénico "modelo transgénico de cáncer de próstata "(TRAMP) [19], [20]. La acumulación de fotosensibilizador se cuantificó por citometría de flujo (Figura 1E). Hemos observado grandes diferencias específicos de la línea de células en los niveles de formación de PpIX después de la incubación con el precursor de PpIX 5-ALA (Figura 1A-C, E). Esto podría ser debido a diferencias en los niveles de la unión a ATP ABCG2 casete transportador que se sabe que es responsable de la exportación de PpIX a partir de células [21]. De hecho, la presencia de ABCG2 ARNm en las diferentes líneas celulares correlacionados con bajos niveles de PpIX tras la incubación con 5-ALA con las mayores cantidades de ABCG2 mRNA se observó para TRAMP-C1 y las células que presentaban los niveles más bajos de PpIX TRAMP-C2 ( Figura S1; Figura 1). Además, la acumulación de PpIX se redujo 2-3 veces cuando la incubación con 5-ALA se realizó en presencia de suero en los medios (Figura 1B, C). Esto era probablemente debido a la unión de PpIX a la albúmina sérica, una vez transportado fuera de la célula, cambiando así los niveles de estado estacionario de PpIX [22], [23]. Basándose en estos datos, se eligió un período de incubación de 16 h con 50 mg /ml 5-ALA en presencia o ausencia de% de suero de 5 para la próstata humano (PC-3, DU145) y el glioblastoma humano y líneas celulares de cáncer de próstata murino (U87, U373; TRAMP-C1, C2-TRAMP), respectivamente. Se seleccionó una concentración más baja, pero de manera eficiente la sensibilización de Photofrin (5 mg /ml) para evitar la posible citotoxicidad en ausencia de luz (Figura 1D).
se incubaron células tumorales con 50 g /ml (A, E) o con las concentraciones indicadas de 5-ALA (B, C) o Photofrin (D) en presencia (PC-3, U373; A, D, e y líneas rojas en B, C) o ausencia de suero al 5% (TRAMP C1, C2-TRAMP; A y líneas azules en B, C). A menos que se indique lo contrario, el contenido de PpIX de las células se cuantificó después de 16 h usando citometría de flujo en el canal de fluorescencia 3 (valores medios ± desviación estándar). histogramas representativos para líneas de células tumorales humanas tratadas con 5-ALA se muestran en células no tratadas E. fueron utilizadas como control; una muestra de control sin representante 5-ALA incubación se muestra (rojo lleno-en curva). Los fotosensibilizadores se detectó la acumulación saturable en función del tiempo de incubación y la concentración. Suero en el medio de cultivo reduce fuertemente la formación de PpIX basada en ALA. Las condiciones para la carga sensibilizador utilizados para los análisis del transcriptoma se indican mediante líneas de puntos verticales. AU, unidades arbitrarias.
A continuación, las dosis de luz para la irradiación de las células sensibilizadas fueron definidos que permitan la supervivencia celular por un período de 24 ha 48 h durante el cual daña las células podría activar genes. Se encontró que las condiciones de PDT que causaron una reducción de la actividad en el ensayo de viabilidad celular en un 30% 24 h después de la TFD en comparación con un cultivo de células no irradiado y no dieron lugar a la detención del crecimiento con poca o ninguna pérdida de células dentro de un período de 48 h (Figura 2E). Para determinar la dosis de luz que induce una reducción del 30% de la viabilidad celular mediante la medición de la actividad mitocondrial, se sensibilizaron células como se describió anteriormente y se irradiaron con dosis crecientes de luz láser. La pérdida de la viabilidad celular aumentó con el tiempo después de la dosis de irradiación y la luz y diferente entre líneas celulares. Por ejemplo, un 4 veces se necesita mayor dosis de luz para inducir una reducción del 30% de viabilidad celular 24 horas después de la TFD en las células DU145 en comparación con las células U373 o TRAMP-C1 (Figura 2A-D; Tabla S1). Esta sensibilidad diferencial de las diversas líneas de células no se correlacionó con su capacidad para acumular PpIX en presencia de 5-ALA. Curiosamente, las dosis de luz que conducen a la misma pérdida de 30% de la viabilidad celular inducida por un nivel diferente de la apoptosis en las líneas celulares humanas analizadas como se mide por la activación de la caspasa 3 y caspasa 7. Considerando que no se observó o un nivel marginal de la apoptosis en las líneas celulares de cáncer de próstata DU145 y PC-3, respectivamente, se observó apoptosis máxima en las líneas celulares de glioblastoma en las mismas condiciones (Figura 2F).
(, B, DF a) o células tumorales humanas murinos ( C) se sensibilizaron por incubación con 50 mg /ml de 5-ALA (DU145: 100 g /ml) o con las concentraciones indicadas de Photofrin durante 16 h en presencia (A, D, E; F, PC-3, DU145 ) o ausencia de% de suero de 5 (B, C; F, U87, U373). Las células fueron irradiadas con luz láser (635 nm) la entrega de las dosis de luz indicadas. Después de los tiempos indicados, la viabilidad celular y la activación caspase3 /7 se determinaron y se muestran ya sea como% de control para cada punto de tiempo (A-D, F) o en unidades de fluorescencia relativa (RFU; E, F). Tenga en cuenta el diferente propensión de las células de la próstata y de glioma a sufrir apoptosis a dosis bajas de PDT.
La transcripción de un subconjunto de quimioquinas y citoquinas genes está altamente regulada positivamente en las células tumorales después de no letal
in vitro
PDT
Para determinar los genes que están liberalizados 4 hy 24 h después de la TFD no letal se realizó el análisis del transcriptoma de las células tumorales murinos y humanos irradiados y no irradiados sensibilizados por incubación con 5 delta -ALA (condiciones se resumen en la Tabla S1). Una gran fracción de sistemas /upregulated genes después de la TFD se comparte entre líneas de células, incluso entre las líneas celulares derivadas de tumores de diversos tejidos de origen de la sonda (por ejemplo, ~30-60% 24 h después de la TFD; Tabla S2, S3 Tabla). Pathway análisis utilizando el programa conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) reveló que 24 h después de la irradiación, de un total de 3479 conjuntos de genes, 208 conjuntos de genes se upregulated significativamente en células de glioblastoma, 156 conjuntos de genes en el cáncer de próstata, y 508 conjuntos de genes en las muestras combinadas (P & lt; 0,01) (Tabla S4). Los conjuntos de genes más prominente regulados positivamente en todas las líneas celulares pertenecen a vías activadas por el estrés celular, incluyendo los procesos iniciados por el daño a través de la luz ultravioleta, la hipoxia y la radiación, así como conjuntos de genes ionizantes, las proteínas codificadas que impiden la proliferación ( "regulación negativa de la célula ciclo "," detención del ciclo celular "y" apoptosis "; Tabla 1). Más significativamente, una serie de vías inmunes se transcripcionalmente activa por no letal PDT, tales vías incluyen "genes proinflamatorios", "vía del interferón-β" y "la activación de neutrófilos en la cicatrización de heridas" (Tabla 1; la Figura 3). El gen ontología de genes conjuntos regulado por disminución más significativa en todas las líneas celulares analizadas resultaron ser asociada con las vías mitocondriales (3 de cada 5), que está de acuerdo con las mitocondrias ser el sitio de producción de PpIX y daño primario por ROS (Tabla S4) .
el análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA) reveló la activación de un conjunto de genes de 24 horas después de la TFD no letal de todas las líneas celulares de glioblastoma y 4 de la próstata (los datos se muestran para PC-3) que también se encuentra a ser característica para la activación de neutrófilos durante la cicatrización de la herida [55]. La regulación positiva se ilustra por la concentración de las líneas negras verticales (que representan posiciones miembros conjunto de genes dentro de la lista de genes clasificados) en el lado izquierdo de la lista de genes ( "cruce por cero"; véase "diagrama de cascada" en la parte inferior del gráfico) . Esta distribución conduce a una puntuación alta y significativa de enriquecimiento (desviación máxima de la línea verde de cero; P & lt; 0,001 y la tasa de falso descubrimiento (FDR) & lt; 0,001).
Cuatro horas después no letal PDT, transcripciones de los "genes de respuesta temprana" fueron algunos de los genes más fuertemente inducidos y lo más altamente expresado en las células tumorales humanas y murinas (Figura 4, Tabla S2, S3 Tabla, Figura S2A-C). Este grupo de genes codifica factores de transcripción como FBJ osteosarcoma murino oncogén viral homólogo (FOS), junio, factor activador de la transcripción 3 (ATF3), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1) y el daño de ADN-inducible transcripción 3 (DDIT3). La regulación positiva de estos genes, a su vez conduce a la transcripción de los genes típicos del estrés, como la proteína de choque térmico (HSP) genes y puede iniciar la detención de G1 y la apoptosis (DDIT3) [24], [25]. De hecho, los miembros inducible de la familia de genes HSP, a saber choque térmico de 70 kDa proteína 6 (
HSPA6
) seguido de rango por
HSPA1A
y
HSPA1B
fueron los inducidos más dominantemente genes 4 h después de la TFD en las líneas de células tumorales humanas (Figura 4A-D). En las murino TRAMP-C1 y C2-TRAMP células transcripciones de los ortólogos de los dos últimos miembros eran prevalentes 4 h después de la TFD (Figura S2 B, C). El predominio de las transcripciones de factor de transcripción de respuesta temprana y los genes HSP se perdió 24 h después de la TFD, que fue acompañado por una mayor actividad de los dos grandes grupos de genes implicados en la oposición a los procesos celulares. Una estimularon fuertemente y con alto nivel de grupo de genes expresados codifica proteínas que muestran funciones anti-proliferativas, pro-apoptóticos y anti-invasivos inducible por estrés genotóxico como ROS (detención del crecimiento y beta daño de ADN-inducible (GADD45B), de doble especificidad fosfatasa 1 (dusp1), ADAM metalopeptidasa con el tipo de trombospondina 1 motivo 1 (ADAMTS1), homocisteína inducible, miembro de retículo endoplasmático inducible por estrés ubiquitina-como el dominio 1 (Herpud1) [26], zinc proteína de dedos 36 (ZFP36); diferenciación del crecimiento factor de 15 /NSAI activada por el gen 1 (GDF15 /NAG-1 [27], espermidina /espermina N1-acetil-1 (SAT-1) [28]). El segundo grupo de códigos de genes para proteínas que se sabe o se supone que deben mejorar la supervivencia celular después de estrés celular mediante la inhibición de la apoptosis y la detención del ciclo celular (
cerebro expresó ligada al cromosoma X 2 gratis (
BEX2
) [25]) o mediante el apoyo a la desintoxicación de compuestos nocivos generados por ROS (
aldo-ceto reductasa 1C1
/
1C2 gratis (
AKR1C1
/
AKR1C2
)) (Figura 4A-D).
tumor células se sometieron a no letal PDT después de la sensibilización con 5-ALA (a, C-F) o Photofrin (B). ARN total fue aislado 4 y 24 h después de la TFD y se analizó por hibridación con micromatrices de oligonucleótidos. Después de la normalización, se calculó el cambio veces de la expresión de genes entre las correspondientes muestras irradiadas y no irridiated y se representó frente al nivel de expresión después de la TFD. Sólo los genes ( "sonda fija") se muestran los cuales fueron arriba y hacia abajo reguladas ≥3 veces y para el que se ha registrado un "presente convocatoria" para todas las muestras irradiadas y no irradiadas, respectivamente. La mayor fuerza hacia arriba o hacia abajo, genes -regulated y más altamente expresado en las muestras se identifican mediante los símbolos de genes. representación múltiple de los símbolos de genes resultan de la presencia de múltiples conjuntos de sonda para genes individuales. los genes que codifican proteínas inmunomoduladoras son, además, marcados con círculos pequeños. Tenga en cuenta que los últimos genes son algunos de los genes más fuertemente upregulated. se utilizó un código de color para discriminar grupos de genes que codifican proteínas relacionadas funcionalmente (véase la leyenda figura en caja). para todas las muestras los valores medios de expresión de los duplicados se utilizaron. FU, unidades de fluorescencia.
Curiosamente, entre los genes altamente upregulated por las células tumorales después de la TFD había un número de genes de respuesta inmune, en particular de quimioquinas y genes de citoquinas, así como genes de quimioquinas y receptores de citocinas (Figura 4, Figura 5). Expresión de una fracción sustancial de estos genes se upregulated significativamente 24 h después de la TFD a menudo en ambas líneas celulares de próstata y glioblastoma (P & lt; 0,05; prueba-ANOVA de dos vías). Entre los genes regulados positivamente fueron más consistentemente los genes de quimioquinas
CXCL2
,
CXCL3
y
interleucina-8 gratis (
IL8
) /
CXCL8
así como el gen de citocina
IL6
(Figura 5A-C, H). La regulación positiva de la
CXCL2
,
CXCL3
genes se observó ya 4 h después de la TFD en la mayoría de las líneas celulares (datos no mostrados). Análisis de la expresión de la red de productos de genes que interactúan con IL6 reveló un posible bucle autostimulatory en células PC-3 que implican IL6 y sus subunidades del receptor de IL6R /IL6RA y IL6ST /IL6RB (Figura 6). Es de destacar que la expresión de
CCAAT /potenciador de la proteína de unión β gratis (
CEBPB
) que codifica un factor de transcripción que se sabe están involucrados en la regulación de la expresión de
IL6
, fue 3 -fold y 4,2 veces inducida 4 h y 24 h después de la TFD, respectivamente (no mostrado). Por otra parte, los genes que codifican reguladores negativos y positivos de IL-6 señalización saber supresor de la señalización 3 (SOCS3) de citoquinas y Janus quinasa 1 (JAK1) /JAK2, respectivamente, se upregulated. Para el
IL6
gen Hemos demostrado anteriormente que la regulación positiva de la transcripción también se traduce en elevación de la secreción de la proteína codificada por las células PC-3 después de la TFD basada en 5-ALA [18]. Estadísticamente no se observó una activación significativa para algunos genes de quimioquinas y citoquinas (por ejemplo,
CXCL1 gratis (P = 0,25),
CCL26 gratis (P = 0,24; datos no presentados);
IL18
, la Figura 5J);
fue encontrado CXCL14
ser downregulated significativamente (Figura 5E). Para validar los datos de expresión obtenidos por los experimentos de microarrays de oligonucleótidos se analizaron los niveles de mRNA de un conjunto seleccionado de los genes (IL6, CXCL8 y CXCL14) en el ARN total a partir de la TFD-células tratadas y de control 24 h después de la irradiación. Hemos encontrado una buena concordancia entre los dos conjuntos de valores de expresión determinados por los dos métodos de cuantificación diferentes (Figura S3, Figura 5). Esto se refleja en los coeficientes de determinación R
2 cerca de 1,0 (0,947 ± 0,072) y un similares ascendente estadísticamente significativa (IL6, CXCL8) y la baja regulación (CXCL14) que se encuentran utilizando el conjunto de datos de microarrays de oligonucleótidos.
Las células tumorales fueron sometidos a la TFD no letal después se analizó después de 24 h de recuperación de la TPD por hibridación de microarrays de ADN de la sensibilización con 5-ALA o Photofrin y ARN como se describe en la leyenda de la Figura 4. valores de expresión en la fluorescencia relativa media se muestran unidades (RFU) y sus desviaciones para la interleucina y de quimioquinas expresados y genes de interleucina y de los receptores de quimioquinas. Para el
CXCL8
y
se utilizaron CXCL14
genes del 202859_x_at y 222484_s_at sonda fija, respectivamente. Para PC-3 y muestras U87 valores medios de expresión de duplicados, para los DU145 y muestras U373 se utilizaron mediciones individuales. Los niveles de significación (P) se calcularon utilizando ANOVA de dos vías.
Los cambios en la expresión génica 4 hy 24 h después de la TFD medidos por análisis de microarrays de oligonucleótidos se representan como factor de cambio (fluorescencia de irradiado /no muestra -irradiated). La magnitud del cambio veces se indica mediante diferentes colores (& lt; 1,2 veces, blanco; ≥1.2 veces, y lt; 2 veces, naranja; ≥2 veces, rojo). Se observó la regulación al alza más fuerte de expresión para la
IL6
gen (12,3 veces) que podría parte de un bucle autostimulatory con las subunidades del receptor de IL6 también upregulated (IL6R y IL6ST). El tamaño de los óvalos indica el nivel de expresión absoluta después de la TFD (& lt; 100 FU, pequeño símbolo; ≥100, & lt; 1000, símbolo del medio; ≥1000, símbolo grande). Las líneas entre los óvalos simbolizan varios tipos de interacción entre las proteínas o genes.
Sin embargo, también hay una fracción de los genes (~ 25%) que se upregulated preferentemente (≥4 veces) en PC-3 o células U87 y por lo tanto podrían exhibir la estimulación del tejido-de-origen específico. Los genes más diferencialmente estimulado o bien ya están relativamente altamente expresado en la línea celular no responde (por ejemplo,
EGR1
,
IL11
,
AKR1C1-3 Hoteles en U87; CD55 en PC -3) o probablemente no pertenecen al repertorio de genes expresables en la línea celular respectiva (
subfamilia de receptores nucleares 4 Un grupo de usuarios 1 gratis (
NR4A1
),
factor de necrosis tumoral -α-inducida por la proteína 6 gratis (
TNFAIP6
),
deshidrogenasa /reductasa (DEG familia) miembro de 9 gratis (
DHRS9
),
dependiente de ciclina quinasa inhibidor 1A gratis (
Kip2
) en U87) (cuadro S5)
en comparación, sólo unos pocos genes /sonda fija se downregulated & gt;. 3 veces después de PDT (Figura 4E , F y los datos no presentados). Los genes más fuertemente expresado que fueron regulados a la baja el crecimiento celular y proteínas codificadas menudo promotora de la supervivencia.
ROS genes inducibles están regulados por incremento más eficiente mediante PDT basada en 5-ALA que por Photofrin mediada PDT
Curiosamente, a pesar de producción endógena de PpIX y el Photofrin porfirina oligómero sintético se cree que actuar en diferentes compartimentos celulares [3], un conjunto similar de genes que se upregulated tanto a las 4 h y 24 h después no letal TFD en células PC-3 (Figura 4A, B). Sin embargo, a pesar de un nivel similar de inhibición de la viabilidad de las células después de 4 h no letal PDT (5-ALA 15 ± 3%; Photofrin 17,5 ± 0,5%, Tabla 1) 14% (28/204) de los conjuntos de genes /sonda, que eran más de 3 veces upregulated después de PDT basados en 5-ALA, exhibió una ≥4 veces mayor activación transcripcional en comparación con la observada después de la TFD mediada por Photofrin (Tabla S6). Los genes regulados positivamente preferentemente que fueron expresadas en un alto nivel integrada, entre otros genes, los genes de respuesta temprana (
FOS
), los genes HSP (
HSPD1, HSPA6
), genes de supervivencia celular (grupo de histona 1 genes), así como genes de respuesta inmune (
IL1A
,
CCL26
). Por el contrario, hay un gen fuertemente expresado después de la TFD (& gt; 1.000 RFU). Fue estimulado por selectivamente a base de Photofrin PDT (Tabla S6)
transcripcional regulación positiva de genes proinflamatorios en tumores TRAMP-C2 después no letal PDT
Dado que la expresión de quimioquinas y citoquinas genes se upregulated consistente en líneas celulares después de la TFD basada en 5-ALA
in vitro
, se examinó si PDT basada en 5-ALA también podría inducir la expresión de genes proinflamatorios en los tumores, lo que podría apoyar las reacciones inmunes anti-tumorales. Se utilizó como un modelo de células tumorales murinas TRAMP C2-tumorales de próstata cultivadas por vía subcutánea en ratones C57BL /6 albinos, lo que permitió la irradiación transdérmica del tumor con luz visible. En primer lugar hemos optimizado las condiciones de sensibilización mediante la medición de la acumulación de PpIX en la piel sobre el tumor después de la inyección i.p. la inyección de 5-ALA como una aproximación para la formación de PpIX en el tejido tumoral. En la mayoría de los ratones, se alcanzaron niveles máximos de PpIX en la piel después de 2 a 3 h (Figura 7A). Una cinética similar de acumulación de PpIX se observó mediante determinación espectrofotométrica de PpIX en extractos tumorales (Figura 7B).
La cinética de acumulación de PpIX en los tejidos de ratón después de administración i.p. la inyección de 5-ALA se determinó ya sea por medición directa de la fluorescencia de PpIX en la piel que cubre el tumor (A) o por la determinación espectroscópica de la fluorescencia de PpIX en los extractos tumorales de un solo ratón cada uno, que fue sacrificado en el momento indicado (B). la acumulación de PpIX en diferentes tejidos con respecto a TRAMP-C2 tumores 3,5 h después de la inyección se muestra 5-ALA en (C). En (A), se muestra una cinética típica de la acumulación de PpIX en la piel. máxima acumulación de PpIX en la piel y el tejido tumoral se observó ~ 180 minutos después de la inyección de 5-ALA. Los tumores fueron sometidos a la TFD (75 J /cm
2) después de la sensibilización con 5-ALA durante 180 minutos. Tenga en cuenta, que el 5-ALA-mediada PDT después de la sensibilización máxima sólo tenía un marginal (D) o el efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral transitorio (E), incluso después de la aplicación duplicado una semana de diferencia. Para el análisis del transcriptoma, tumores sensibilizado a partir de un solo ratón cada uno fueron tratados o no con luz láser (635 nm; 75 J /cm
2), escindido 4, 14 o 24 h después de la irradiación. Se aisló el ARN y se analizó por hibridación con micromatrices de oligonucleótidos. Después de la normalización, se calculó el cambio veces de la expresión génica entre las muestras irradiadas y no irridiated y se representó frente al nivel de expresión después de la TFD (F). Sólo los genes ( "sonda fija") se muestran los cuales fueron upregulated ≥3 veces y para el que se ha registrado una "llamada actual" en la muestra irradiada. Los genes más fuertemente upregulated y más altamente expresado en las muestras se identifican mediante los símbolos de genes. representación múltiple de los símbolos de genes resultan de la presencia de múltiples conjuntos de sonda para genes individuales. Los genes que codifican las proteínas inmunomoduladoras, además, están marcados con círculos pequeños. AFU; unidades arbitrarias de fluorescencia; n: número de ratones ensayados.
En comparación con los tumores TRAMP-C2, se encontraron altos niveles relativos de PpIX en extractos de hígado, vesícula seminal y la piel (Figura 7C). Esto podría ser debido a la fuerte expresión de la PPIX transportador de eflujo gen
Abcg2
en tumores C2 y de la línea C2 de células tumorales (Figura S1) y podría explicar los efectos secundarios limitantes de la dosis observados en los ratones después de la TFD. En consecuencia, las dosis de luz que podrían aplicarse condujeron a un control ineficiente de crecimiento del tumor (Figura 7D, E). Transcriptome análisis utilizando ARN aislado de toda irradiado y no irradiado tumores 14 h y 24 h después de la TFD reveló que la fracción de los genes altamente transcripcionalmente activados después de no letal PDT compone principalmente los genes que codifican factores proinflamatorios (Figura 7F; Figura S2). Como se observa para las líneas celulares de tumores tratados con TFD,
CXCL2
,
CXCL3
y
IL6
estaban entre los genes más fuertemente upregulated, aunque no podemos descartar que se expresaron estas citoquinas por las células del estroma en el microambiente del tumor o las células inmunes tumor-asociados. Curiosamente,
Sprr2h gratis (
pequeña proteína rica en prolina 2
) un gen que se sabe están regulados por IL6 /STAT3 señalización [29] es el segundo más fuertemente inducida gen 14 h después de la TFD (Figura 7F). Cuatro horas después de la TFD,
Hsp1a
y
Hsp1b
pertenecía al grupo de los genes más fuertemente activadas y más altamente expresados (Figura 7F).
Discusión
existen varias razones por las que la TFD no letal se aplica a menudo a las células tumorales inintencionadamente
in vivo
. Una de estas razones es que las células dentro de un tumor a menudo son heterogéneos y pueden diferir en su capacidad de acumular PS, así como en su susceptibilidad al estrés oxidativo. De hecho, se observó una notable variabilidad de la acumulación de PpIX entre las diferentes líneas de células tumorales utilizadas. Esto no se limita a las células tumorales
in vitro
, sino que también se observó en las células del tumor
in vivo
[30], [31]. En el presente estudio hemos identificado los genes que están regulados al alza en las células de cáncer que no letal PDT
in vitro
y los compararon con los genes que se vieron afectados dentro del tumor tejidos
in vivo
. Es importante destacar que se encontró que las células de cáncer independientes de su origen tisular (próstata y cerebro) por sí mismos upregulate genes relacionados con la inmunidad como una respuesta al estrés celular inducida por PDT. Esto indica que el estrés oxidativo induce respuestas similares en diferentes tipos de células, todas destinadas a limitar la sensibilidad de las células a ROS, para reparar los defectos de células infligidas y para coordinar las respuestas inmunes destinados a limpiar el tejido dañado irreversiblemente a partir del organismo.