oral
Extracto
La sobreexpresión de peroxiredoxin 1 (Prx1) se ha observado en numerosos tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma oral de células escamosas ( COCE). El mecanismo molecular preciso de regulación de Prx1 en la carcinogénesis, sin embargo, aún es poco conocido. El objetivo de este estudio es investigar la relación entre Prx1 y la hipoxia, y el mecanismo (s) potencial de Prx1 en COCE línea celular SCC15 y el modelo de xenotrasplante. Se han tratado de tipo salvaje y Prx1 caída SCC15 células con hipoxia transitoria seguida de reoxigenación. Hemos detectado la condición de hipoxia, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), y la expresión y /o actividad de Prx1, hemo oxigenasa 1 (HO-1) y el factor nuclear kappa B (NF-kB). Se encontró que la hipoxia induce la acumulación de ROS, hasta regula Prx1, aumenta la translocación de NF-kB y la actividad de unión al ADN, y regula a la baja HO-1
in vitro
. En las células Prx1 desmontables, el nivel de expresión de HO-1 se aumentó, mientras que NFkB translocación y la actividad de unión al ADN se redujeron después de la hipoxia o el tratamiento de hipoxia /reoxigenación. Además, hemos imitado el microambiente tumoral oxigenación dinámica en el modelo de xenoinjerto y evaluaron los índices anteriores en los tumores con el diámetro máximo de 2 mm, 5 mm, 10 mm o 15 mm, respectivamente. Nuestros datos muestran que el tumor condiciones hipóxicas y la expresión de Prx1 se asociaron significativamente con el crecimiento del tumor. La expresión de HO-1 y NF-kappa B, y la actividad de unión a ADN de NF-kappa B fueron significativamente elevados en los tumores de 15 mm, y el nivel de 8-hydroxydeoxyguanosine se incrementó en los tumores de 10 mm y 15 mm, en comparación con los de tamaño de 2 mm. Los resultados de este estudio proporcionan pruebas experimentales de que la sobreexpresión de Prx1 está asociado con la hipoxia, y Prx1 /NF-kB /HO-1 vía de señalización puede estar implicado en la carcinogénesis oral de
Visto:. Zhang M, Hou M, Ge L, Miao C, Zhang J, Jing X, et al. (2014) La inducción de peroxiredoxina 1 por la hipoxia regula la hemoxigenasa-1 a través de NF-kB en el cáncer oral. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10.1371 /journal.pone.0105994
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 20 de mayo de 2014; Aceptado: July 25, 2014; Publicado: 27 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales (81070836), la Fundación de Ciencias Naturales Pekín (7.102.065) y ZYLX201407, Beijing Municipal de Administración Hospital de clave Proyecto de Desarrollo de Medicina. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma oral de células escamosas (COCE) es la cabeza y el cuello cáncer más común en todo el mundo. A pesar de las ventajas de la cirugía, quimioterapia y radioterapia, la tasa de supervivencia a 5 años del COCE no ha mejorado notablemente en los últimos 30 años [1] - [3]. Metástasis y la resistencia quimioterapia /radioterapia siguen siendo las principales preocupaciones en la terapia del cáncer clínico. La hipoxia, una característica común de cáncer, promueve la invasión de células tumorales y la metástasis en microambiente del tumor que conduce a la resistencia de las células tumorales a la quimioterapia y la radioterapia [4], [5]. Se ha informado de que las características patológicas que incluyen la invasividad activo, la metástasis de los ganglios linfáticos y la proliferación vascular están asociados con la hipoxia de tejido tumoral en OSCC [6], [7]. La exposición a la hipoxia hipobárica conduce a un aumento significativo en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en los animales. La acumulación de ROS inducida por la hipoxia puede resultar en el estrés oxidativo y la progresión tumoral [8]. La respuesta mediada por ROS puede ser regulada por los antioxidantes y los sistemas de enzimas antioxidantes, tales como superóxido dismutasa, catalasa y tiorredoxina /peroxiredoxin [9].
Peroxiredoxins (prxs) son una superfamilia de peroxidasas tiorredoxina dependiente de antioxidantes multifuncionales. Peroxirredoxina 1 (Prx1) es un miembro de la familia importante en prxs y actúa como un antioxidante para secuestrar ROS en una amplia gama de organismos. Prx1 está implicado en múltiples condiciones /actividades biológicas incluyendo el estrés oxidativo, la proliferación celular y la apoptosis celular [9]. Prx1 se sobreexpresa en muchos tumores malignos incluyendo esófago, de pulmón, de mama y cánceres de páncreas. Prx1 expresión elevada se asocia con disminución de la supervivencia global y los pobres resultados clínicos [10], [11]. La sobreexpresión de Prx1 También se ha informado en OSCC, pero el mecanismo molecular preciso de Prx1 en la carcinogénesis oral sigue siendo oscura [12]. La expresión del factor nuclear kappa B (NF-kB) y Heme oxygenease-1 (HO-1) se incrementan en OSCC [13], [14]. Numerosos estudios demostraron que las respuestas de NF-kappa B a la hipoxia-reoxigenación
in vitro
[15]. NF-kappa B se puede regular por Prx1, a través de su activación inicial en el citoplasma [16] o mediante la alteración de la concentración de oxidante que conduce a la inactivación oxidativa de NF-kappa B [17]. HO-1, una proteína de choque térmico de 32 kDa, puede catalizar la degradación oxidativa de hemo a biliverdina, que se reduce posteriormente a la bilirrubina. HO-1 puede ser inducida por la hipoxia, de choque térmico y oxidantes citotóxicos [18], [19]. HO-1 es uno de los objetivos de NF-kB en condiciones de estrés [20] - [23]. Aunque el mecanismo de Prx1 en el estrés oxidante no está claro, múltiples evidencias sugieren que puede Prx1 respuesta a la hipoxia y regular NF-kB en cascada vía. En este estudio, se investigó la alteración de Prx1 en respuesta a la hipoxia y evaluamos las posibles correlaciones entre Prx1 y NF-kB /HO-1 utilizando el sistema de células de cáncer oral y modelo de xenoinjerto.
Materiales y Métodos
cultivo de células
células CCCA humano, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en DMEM-F12 suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, EE.UU.) que contiene 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. células SCC15 se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2 y 95% de aire. Para derribar Prx1, SCC15 células fueron transfectadas con Prx1 shRNA plásmido (Santa Cruza Biotecnología) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Control de shRNA plásmido-A (Santa Cruza Biotecnología) se transfectó como control. La eficiencia de Prx1 shRNA desmontables se determinó mediante qRT-PCR y análisis de transferencia Western.
tinción pimonidazole en SCC15 células
Las células se cultivaron en cubreobjetos de 24 h antes del tratamiento hipoxia. Durante el tratamiento de la hipoxia, las células se pusieron en una incubadora con hipoxia gas que contiene 1% de O
2, 5% de CO
2 y el 94% de N
2 a 37 ° C durante diferentes períodos de tiempo. 200 M de pimonidazole se añadió al medio y se incubaron durante 30 min. Después de lavado con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído (3%) a temperatura ambiente durante 10 min y posteriormente se lavaron de nuevo con PBS. Después se bloquearon con BSA, los cubreobjetos se incubaron con hypoxyprobe-1 mAb1 ratón anticuerpo monoclonal (1:100) en el kit de Hypoxyprobe-1 Plus (Chemicon Int., Temecula, CA) durante la noche. Se utilizó un anticuerpo conjugado con FITC anti-ratón secundaria. Los cubreobjetos se montaron y se examinaron células inmuno en un microscopio Olympus IX71 (Tokio, Japón).
ROS detección
La producción de ROS intracelular en las células se midió con 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCF-DA) usando análisis FACS. Se recogieron las células SCC15 y se suspendieron en 500 l diluida DCF-DA. La mezcla se incubó a 37 ° C durante 20 min y después se lavó dos veces con PBS. Las muestras se analizaron por citometría de flujo dentro de 1 h. Los datos se normalizaron a los valores de los controles. La intensidad media de fluorescencia DCF se midió con excitación a 488 nm y emisión a 525 nm. Los experimentos se realizaron por triplicado.
inmunofluorescencia
Las células cultivadas en cubreobjetos se enjuagaron con PBS, se fijaron y se permeabilizaron en acetona a -20 ° C durante 10 min. Después de la incubación con PBS que contiene 5% de BSA durante 1 h, se añadió anticuerpo monoclonal anti-NF-kappa B (Cell Signaling Technology, 1:100 en PBS-BSA) a 4 ° C y se incubó durante la noche. Los cubreobjetos se lavaron con PBS, se incubaron con Alexa Fluor 546 anti-conejo (Molecular Probes, 1:500) anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 h, y se montaron en Dako Cytomation fluorescente medio de montaje. Confocal imágenes fueron recolectados a través de un microscopio confocal de barrido láser Leica SP2 equipado con excitación UV, un láser de argón, un 633 /1,32 petróleo objetivo PH3 CS, y un conjunto pinhole confocal en 1 unidad de Airy. Todas las imágenes fueron confocal secciones ópticas individuales.
modelo de xenoinjerto
Cuarenta macho BALB /c ratones desnudos (Beijing Vital River Laboratories, China) se utiliza para producir la tumorigenicidad de las células SCC15
in vivo. El protocolo experimento fue aprobado por el comité de ética local para uso animal. Las células SCC15 (6 × 10
6) se suspendieron en 100 l de solución salina tamponada con fosfato y se trasplantaron por vía subcutánea en el lado derecho e izquierdo flancos de 4 semanas de edad ratones desnudos. El crecimiento del tumor se monitorizó cada 3 días después del trasplante. Los tumores se recogieron cuando el diámetro máximo de los tumores alcanzaron 2 mm, 5 mm, 10 mm o 15 mm, respectivamente. Para etiquetar las células hipóxicas, se inyectaron los ratones desnudos por vía intraperitoneal con 0,1 ml de solución salina que contiene hidrocloruro de pimonidazole (1 - [(2-hidroxi-3-piperidinil) propil) -2-nitro-imidazol hidrocloruro) a una dosis de 60 mg /kg de peso corporal 1 horas antes de la escisión del tumor. Los ratones se llevaron a cabo la eutanasia y se retiraron las muestras de tumor y se almacenan inmediatamente en nitrógeno líquido para el análisis molecular /celular, o en formalina para hacer bloques de tejido incluidos en parafina. Total de 80 tumores fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo con el diámetro del tumor (20 tumores /tamaño).
tinción pimonidazole en tumores
Los bloques incluidos en parafina con muestras tumorales fueron seccionados para la tinción pimonidazole. Las secciones fueron incubadas con conejo primaria antisuero anti-pimonidazole hypoxyprobe-1 mAb1 (dilución: 1:50; Chemicon, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche. Para evaluar el estado de hipoxia, cinco áreas de microscopía óptica representativa se calcularon en cada sección (aumento x 200) y la densidad óptica media (MOD) se calculó utilizando la Imagen Pro Plus 7.0 analizador, MOD = IOD /área.
QRT-PCR
ARN total fue extraído de células cultivadas y los tejidos tumorales utilizando TRIzol (Invitrogen Life Technologies, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. cDNA fue sintetizado por transcripción inversa del ARN 2 g con la alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, EE.UU.). alícuotas de un microlitro de ADNc se utilizaron como plantillas. Los FAMTM Dye /MGB sondas de Prx1, HO-1 y beta-actina fueron sintetizados por ABI (Ensayo ID: Prx1, HS0060202; HO-1, HS00015796; ACTB humana, 4352935E). Para el análisis de datos, el 2
-ΔΔCT método se utilizó con la normalización de los datos de los genes interesados a limpieza de genes ß-actina. Los experimentos se realizaron por triplicado.
análisis de transferencia de Western
Las células y los tejidos tumorales se lisaron en tampón de ensayo de inmunoprecipitación (50 mM Tris-Cl [pH 7,4], 1% de NP40, NaCl 150 mM , EDTA 1 mM, 1 M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg cada uno de aprotinina y leupeptina, y Na3VO4 1 mM). Después se centrifugó a 12.000 g durante 30 min, se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteína usando el método de Lowry. Igual cantidad de proteínas se separaron en geles al 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se incubaron con anti-Prx1 (1:5000, Upstate, EE.UU.) y anti-HO-1 (1:2000, Abcam, EE.UU.) anticuerpo. Anticuerpo de β-actina (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó como control de carga. Las bandas inmunorreactivas se detectaron con rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y aumentada por los reactivos de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Los experimentos se realizaron por triplicado.
ADN NF-kB actividad de unión de detección
La proteína nuclear fue extraído de células y tejidos tumorales utilizando NE-PER nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Thermo, EE.UU.) . En resumen, las células y los tejidos se suspendieron en tampón hipotónico y se incubaron en hielo durante 10 min, seguido de centrifugado a 12000 g y 4 ° C durante 10 min para precipitar los núcleos. Después de lavado en el tampón hipotónico, los núcleos se lisaron en un tampón de lisis para obtener los extractos de núcleos. Se detectó la actividad de unión a ADN de NF-kB mediante el NF-kappa B (p65) Factor de Transcripción Kit de ensayo (Cayman Chemical Company, EE.UU.).
La inmunohistoquímica
Los bloques incluidos en parafina se seccionaron para inmunohistoquímica análisis. Las secciones se trataron con 20 mg /L de proteinasa K (dilución: 1:1000; Sigma-Aldrich, EE.UU.) a 37 ° C durante 30 min para la recuperación de antígeno. Después de bloquear la actividad peroxidasa endógena con 0,3% de peroxidasa de hidrógeno durante 15 min, las secciones se trataron con 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG; 1:8000; Abcam, EE.UU.) o NF-kappa B (Cell Signaling Technology, 1:100) primaria anticuerpo a 4 ° C durante la noche. Los portaobjetos se incubaron en anticuerpos IgG secundarios biotinilados a 37 ° C durante 30 min, y luego se visualizaron utilizando DAB para 2-5 min. hematoxilina de Mayer se utilizó para contrateñir las secciones, que eran a continuación, deshidratadas y montadas. Para el control negativo, PBS se utilizó en lugar de anticuerpos primarios. Las células con tinción positiva se determinó contando el porcentaje de células teñidas utilizando el Pro Plus 7.0 Imagen analizador. Un mínimo de 1.000 células fueron contados para cada muestra tumoral.
El análisis estadístico
Los niveles de expresión de Prx1, HO-1, NF-kB y 8-OHdG, y los datos de la producción de ROS, tinción pimonidazole, inmunofluorescencia y la actividad de unión a ADN de NF-kB se analizaron y se compararon mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Todo el análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 17.0 para Windows Software. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
P
& lt; 0,05. Todos los
P
valores fueron de dos caras.
Resultados
Prx1 desmontables aumenta la hipoxia y la producción de ROS intracelular
Se utilizó el plásmido shRNA para derribar Prx1 en células SCC15. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, los niveles de Prx1 ARNm y la expresión de proteínas se redujeron a 40 hasta 50% en shRNA transfección en células SCC15. Después Prx1 caída, hemos detectado la condición de hipoxia en las células Prx1 desmontables y control de las células, las cuales fueron transfectadas con el vector vacío. Nuestros datos muestran que la condición hipóxica se incrementó por la hipoxia o hipoxia /reoxigenación excepto 12-h de tratamiento de hipoxia en las células control (Figura 1C, panel superior). En las células Prx1 una caída, la condición de hipoxia aumentó más significativamente en comparación con las células control (Figura 1 C, inferior pannel). Se observó el mayor hipoxia en las células desmontables Prx1 después de 24 h de hipoxia /reoxigenación 2 h de tratamiento, y 2 h de tratamiento reoxigenación no disminuyó el nivel de hipoxia elevado por el tratamiento hipoxia. También se detectó la producción de ROS intracelulares. Similar a la condición de hipoxia, la producción de ROS intracelular se aumentó mediante tratamiento hipoxia excepto 12 h hipoxia y /2 h de tratamiento reoxigenación 12 h hipoxia (Figura 1D). La acumulación de ROS intracelular es mayor en las células Prx1 desmontables en comparación con los que en las células control.
A, proteína Prx1 se redujo significativamente por shRNA transfección. B, Prx1 ARNm se redujo significativamente por shRNA transfección. C, pimonidazole tinción mostró el estado de hipoxia aumento en las células después del tratamiento hipoxia /reoxigenación. nivel D, intercelular ROS identificado por citometría de flujo en células después del tratamiento hipoxia /reoxigenación. *
P Hotel & lt; 0,05 vs células WT SCC15;
#
P
. & Lt; 0,05 frente a la hipoxia células WT SCC15
Prx1 regula negativamente la HO-1 en condiciones hipóxicas
Con el fin de determinar si Prx1 estaba relacionada con HO-1 en las células SCC15 en condiciones hipóxicas, se evaluó los niveles de expresión de Prx1 y HO-1 después del tratamiento hipóxico. Como se muestra en la Figura 2A (a, b), la expresión de la proteína de Prx1 se aumentó mediante tratamiento hipóxico. Sin embargo, la expresión de la proteína de HO-1 se redujo en las etapas iniciales de la hipoxia cuando se aumentó la expresión Prx1, y luego aumenta, mientras que la expresión Prx1 disminuyó en 12 h hipoxia /2 h reoxigenación, 24 h hipoxia y 24 h de hipoxia /2 h reoxigenación, como se indica en la Figura 2A (c y d). En el grupo reoxigenación /2 h 4 h hipoxia, el nivel de proteína Prx1 se incrementó en un 50% mientras que la proteína HO-1 se redujo reguladas en un 30% en comparación con las células no tratadas (Figura 2A-B y D). Sin embargo, en las células Prx1 desmontables, HO-1 fue significativamente hasta reguladas después de la hipoxia o hipoxia /tratamiento reoxygenantin excepto para el grupo de 24 h. La expresión de la proteína de HO-1 se incrementó en un 30% (Figura 2A-d), y el nivel de ARNm se incrementó en 1,4 veces en las células SCC15 knockdown Prx1 tratados con 4 h de hipoxia /2 h reoxigenación en comparación con las células no tratadas (Figura 2C) . La expresión de mRNA Prx1 se incrementó en 2,7 veces, mientras que la expresión de HO-1 mRNA se redujo reguladas en un 40% (Figura 2B y 2C).
A (a), la expresión de proteínas de PRX-1 y HO-1 detectó por Western blot después del tratamiento hipoxia /reoxigenación; A (B y D), Prx1 y HO-1 de proteína cuantificación relativa de ß-actina; A (c), la correlación de PRX-1 y HO-1 después del tratamiento de hipoxia /reoxigenación. B y C, la expresión de ARNm de PRX-1 y HO-1 detectada por qRT-PCR después del tratamiento de hipoxia /reoxigenación. *
P Hotel & lt; 0,05 vs células WT SCC15;
#
P
. & Lt; 0,05 frente a la hipoxia células WT SCC15
caída Prx1 inhibe la translocación de NF-kB y la actividad de unión al ADN
Hemos detectado la expresión endógena de NF-kB en las células después del tratamiento hipoxia. Se observó un aumento de la expresión núcleo de NF-kappa B en células SCC15 después del tratamiento, especialmente en 24 h grupo hipoxia (Figura 3A, panel superior). Por otra parte, en las células Prx1 desmontables, NF-kB translocación desde el citoplasma al núcleo se redujo en comparación con las células control (Figura 3A, panel inferior). a continuación, se detectó la actividad de NF-kB en las células después del tratamiento hipoxia. Se encontró que la capacidad de unión p65 ADN de NF-kB fue significativamente menor en desmontables células Prx1 hipoxia después del tratamiento en comparación con las células control (Figura 3B).
A, expresión núcleos endógenos de NF-kB. B, la actividad de unión a ADN de NF-kB detectada por ELISA. *
P Hotel & lt; 0,05 vs células WT SCC15;
#
P Hotel & lt; 0,05 frente a la hipoxia células WT SCC15
La hipoxia se asocia con el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto
Para evaluar el cambio. de las condiciones de hipoxia durante el desarrollo del tumor, se evaluó la hipoxia en tumores con un diámetro máximo de 2 mm, 5 mm, 10 mm o 15 mm. Como se muestra en la figura 4A, se observaron las pequeñas y dispersas células positivas en tumores de 2 mm. En 5 mm, 10 mm y 15 mm de tumores, las células hipóxicas se encuentran principalmente en los centros de los nidos de cáncer. La hipoxia en 5 mm, 10 mm y 15 mm tumores fue significativamente más alto que en los tumores de 2 mm (Figura 4B). También se detectó el nivel de 8-OHdG para evaluar la lesión oxidativa del ADN en las células tumorales. La expresión de 8-OHdG aumentó de 2 mm a 15 mm de los tumores (Figura 4C). Se fue significativamente mayor en los tumores de 10 mm y 15 mm en comparación con los tumores de 2 mm (Figura 4D).
A, hipoxia se detectó en 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) y 15 mm (d), los tumores de tinción pimonidazole. B, La hipoxia MOD aumenta significativamente en 5 mm, 10 mm y 15 mm en comparación con los tumores de los tumores de 2 mm. C, 8-OHdG se detectó mediante inmunohistoquímica en 2 (d) tumores de 15 mm mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) y. D, el nivel de 8-OHdG fue mayor en los tumores 15 mm en comparación con los tumores de 2 mm 10 mm y. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
La sobreexpresión de Prx1 y HO-1 durante la tumorigénesis en el modelo de xenoinjerto
Tal como se muestra en la Figura 5A, la expresión de mRNA Prx1 aumentó significativamente en 5 mm, 10 mm y 15 mm tumores en comparación con los tumores de 2 mm. La expresión de la proteína de Prx1 también se elevó en 10 mm y 15 mm de tumores (Figura 5B). se observó sobreexpresión de HO-1 en tumores de 15 mm, como se indica en la Figura 5C y 5D.
A y C, la expresión de ARNm de Prx1 y HO-1 detectada por qRT-PCR. B y D, expresión de la proteína de Prx1 y HO-1 detectada por transferencia de western. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01
NF-B translocación y la actividad de unión al ADN se incrementan en el modelo de xenoinjerto
actividad
NF-kB y la translocación de ADN vinculante ambos. fueron elevados cuando el tumor se desarrolló. El análisis inmunohistoquímico demostró que la expresión de NF-kB fue significativamente mayor en los tumores de 15 mm en comparación con los tumores de 2 mm (Figura 6A y 6B). Del mismo modo, la actividad de unión a ADN de NF-kB fue significativamente elevado en 15 tumores mm que los tumores de 2 mm (Figura 6C).
A, la expresión de NF-kB se detectó mediante inmunohistoquímica en 2 mm (a), 5 mm ( b), 10 mm (c) y (d) tumores de 15 mm. B, el porcentaje de células positivas NF-kB nucleares es significativamente mayor en 15 mm en comparación con los tumores que en los tumores de 2 mm. C, la actividad de unión a ADN de NF-kB fue significativamente mayor en los tumores de 15 mm en comparación con los tumores de 2 mm. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
Discusión
El objetivo general de este estudio es explorar el papel de la hipoxia en Prx1 en COCE. En primer lugar, se utilizó para derribar shRNA Prx1 en SCC15 células y luego detectamos Prx1, NF-kappa B y HO-1 en la hipoxia. También se investigó la Prx1 con la hipoxia durante el desarrollo tumoral en el modelo de xenoinjerto. Nuestros datos muestran que después de la exposición a la hipoxia o hipoxia /reoxigenación, la hipoxia intracelular y los niveles de ROS se agrava. También se encontró que la expresión de HO-1 fue hasta reguladas en las células Prx1 una caída, mientras que la translocación de NF-kB y la actividad de unión al ADN se redujeron. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la acumulación elevada de ROS inducida por la hipoxia puede hasta de regular Prx1, que puede activa NF-kB regula negativamente y HO-1 en células de cáncer orales hipoxia inducida. Nuestro
in vivo
datos mostraron que la sobreexpresión de Prx1 está asociada con la hipoxia y el crecimiento del tumor. Estos resultados sugieren que Prx1 /NF-kB /HO-1 vía de señalización puede jugar un papel clave en la carcinogénesis del cáncer oral inducida por hipoxia.
Una de las principales funciones de Prx1 es la actividad peroxidasa tiorredoxina dependiente de confiar exclusivamente en la cisteína en la región N-terminal [24]. Se neutraliza ROS adicionales como un antioxidante. La hipoxia aumenta los niveles de ROS intracelulares a través de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La hipoxia es uno de los factores clave que influyen en la iniciación del tumor y la progresión mediante el aumento de daño oxidativo del ADN [25]. En los últimos años, se informó de la sobreexpresión de Prx1 para jugar un papel importante en muchos tumores malignos, debido a su papel crítico en la patogénesis de la hipoxia. En las células de cáncer de pulmón, la hipoxia /reoxigenación puede aumentar la expresión Prx1 mediante la activación relacionada con el factor de 2 eritroide nuclear factor de 2 (Nrf2), un importante factor de transcripción implicados en el estrés oxidante [26]. La pérdida de la expresión Prx1 puede mejorar la sensibilidad a los oxidantes y por lo tanto, aumentar la ROS daño oxidativo del ADN y la producción de [27]. En el presente estudio, la expresión de ARNm y proteínas de Prx1 fue hasta reguladas en las células SCC15 por cualquiera de hipoxia (4 h, 12 h) solo o seguido de reoxigenación (2 h). En otro estudio publicado por Kim
et al., España Prx1 fue sólo hasta reguladas por la hipoxia /reoxigenación, pero no solo por la hipoxia [27]. Se encontró que las células SCC15 son todavía hipóxico después de 2 h de tratamiento reoxigenación, que indica que Prx1 aún podría ser inducida por la hipoxia, incluso después de 2 h de tratamiento reoxigenación. Nuestro resultado sugiere que la hipoxia está estrechamente relacionada con la sobreexpresión de Prx1 en OSCC. La regulación de Prx1 aumenta la capacidad de las células para eliminar ROS adicional y proteger a las células tumorales, lo que puede aumentar la progresión del tumor y reducir las eficacias de quimio y radioterapias
.
Un estudio reciente mostró que en las células Hela , citoplásmica Prx1 alterada citoplásmica translocación de NF-kappa B en el núcleo. Nuclear Prx1 regula ADN NF-kB /unión a través de la eliminación de H
2O
2 [23]. Wang
et al.
Informó que Prx1 interactúa con NF-kB en el nivel de ADN y, presumiblemente, modula su actividad transcripcional en células de cáncer de mama [10]. Como un potente antioxidante, HO-1 facilita la progresión del tumor de una manera específica de tejido. Los estudios han indicado que NF-kappa B induce la expresión de HO-1 en los tejidos tumorales [28] - [31]. Por otra parte, numerosos estudios sugieren una relación directa entre NF-kappa B y HO-1, pero la función de NF-kappa B en la regulación de HO-1 expresión en células humanas es controvertido [32] - [35]. En este estudio, nuestros datos muestran que la hipoxia induce Prx1 y NF-kB, y Prx1 regula HO-1 a través de la activación de NF-kB.
Prx1 ha sido recientemente identificado como un ligando endógeno para el receptor tipo Toll (TLR ) ligandos [36]. En condiciones de normoxia, Prx1 puede aumentar la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a través de la inducción de la actividad del factor promotor 1-alfa inducible por hipoxia a través Prx1: interacción TLR4. Este proceso está mediado por NF-kB. NF-kappa B interactúa con el promotor de VEGF, sin embargo, no se requiere para Prx1, lo que sugiere que NF-kappa B puede regular VEGF sin Prx1 inducción [37]. Prx1 y HO-1 se caracterizan por tanto oxidativo inducible por estrés y las proteínas relacionadas con hemo. Prx1 tiene actividad de unión a hemo. La actividad antioxidante específico de tiol de Prx1 puede ser inhibida por hemo. Co-expresión o co-inducción de Prx1 y HO-1 se ha observado en algunos tejidos o células, lo que indica que Prx1 y proteínas HO-1 puede co-localizar e interactuar para exhibir las actividades antioxidantes [15]. Los estudios han demostrado que la expresión de HO-1 es principalmente hasta reguladas por Nrf2. Nrf2 es también uno de los principales factores de transcripción para la expresión de genes en células de cáncer Prx1 hipóxicas. Por primera vez, nos informan de que Prx1 y HO-1 podrían tener una relación de regulación negativa de una manera indirecta. Los mecanismos moleculares precisos, sin embargo, deben ser confirmadas y se investigó en un futuro estudio.
En CCCA modelo de xenoinjerto, encontramos resultados similares que la elevación significativa de HO-1 es inferior al de Prx1. Bajo el daño oxidativo del ADN y la condición hipóxica, Prx1 y HO-1 están regulados por incremento y se potencia la actividad de unión a ADN de NF-kB. Nuestros datos sugieren que Prx1 juega un papel antioxidante mediante la activación de NF-kappa B y la regulación de HO-1 en la progresión OSCC relacionados con la hipoxia. En conclusión, se encontró que la hipoxia juega un papel importante en OSCC través de la regulación Prx1 /NF-kB /HO-1 vía de señalización. Nuestro estudio ofrece un examen sistemático de Prx1 en sistemas celulares y modelo de xenoinjerto de COCE, cada uno con ventajas específicas para la investigación de biomarcadores. Se necesitan más estudios sobre el papel funcional de Prx1 en la carcinogénesis oral. La información de este estudio puede ser útil en el desarrollo de agentes quimiopreventivos /terapéuticos dirigidos Prx1.