Extracto
Antecedentes
reducción inducida por la quimioterapia en la carga tumoral es una función de la muerte celular apoptótica, orquestada por caspasas intracelular. Sin embargo, la eficacia de estas terapias se ve comprometido por mutaciones que afectan a genes específicos, control y /o regulación de la señalización de apoptosis. Por lo tanto, es deseable identificar nuevas vías de muerte celular, que podrían funcionar en conjunto con o en ausencia de maquinaria apoptótica eficiente. A este respecto, la evidencia reciente apoya la existencia de una nueva vía de muerte celular denominado autofagia, que se activa sobre la privación del factor de crecimiento o la exposición a compuestos genotóxicos. La relevancia funcional de esta vía en términos de su capacidad para servir como una respuesta de estrés o un mecanismo efector verdaderamente muerte todavía está en cuestión; Sin embargo, los informes indican que la autofagia es una forma especializada de la muerte celular en ciertas condiciones.
Metodología /Principales conclusiones
Presentamos aquí la inducción simultánea de la autofagia no canónica y la apoptosis en células de cáncer humano tras la exposición a un pequeño compuesto molecular que desencadena la producción de peróxido de hidrógeno intracelular (H
2O
2). Considerando que, el silenciamiento de beclin1 ni inhibe las características de la autofagia, ni la inducción de la muerte celular, Atg 7 o desmontables Ulk1 abrogadas significativamente inducida por fármacos H
2O
2 mediada por la autofagia. Por otra parte, aportar pruebas de que activa la quinasa regulada extracelular (ERK) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) son efectores aguas arriba que controlan tanto la autofagia y apoptosis en respuesta a la elevada intracelular H
2O
2. Curiosamente, la inhibición de la actividad de JNK invirtió el aumento de la expresión ATG7 en este sistema, lo que indica que JNK puede regular mediante la activación de la autofagia ATG7. De nota, el compuesto de molécula pequeña activa la autofagia y la apoptosis en células primarias derivadas de pacientes con linfoma, pero no en células no transformadas.
Conclusiones /Importancia
Teniendo en cuenta que la pérdida de supresor de tumor beclin 1 se asocia con neoplasia, la capacidad de este compuesto de moléculas pequeñas a participar tanto autofágicos y apoptóticos mecanismos a través de la producción de ROS y la posterior activación de ERK y JNK podría tener potenciales implicaciones traslacionales
Visto:. Wong CH, Iskandar KB; Yadav SK, Hirpara JL, Loh T, Pervaiz S (2010) inducción simultánea de no canónica autofagia y apoptosis en células cancerosas por ERK-dependiente de ROS y JNK activación. PLoS ONE 5 (4): e9996. doi: 10.1371 /journal.pone.0009996
Editor: Gian Maria Fimia, INMI, Italia |
Recibido: 3 de diciembre de 2009; Aceptado: 7 Marzo 2010; Publicado: April 2, 2010
Derechos de Autor © 2010 Wong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de las subvenciones a SP desde el Consejo Nacional de investigación médica, Singapur, el Consejo de investigación Biomédica, Singapur, el Ministerio de Educación (MOE-Nivel 2), Singapur, y los fondos de investigación de la Facultad de Medicina de Duke-NUS Graduate, Singapur. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ahora está bien establecido que la reducción inducida por la quimioterapia en la carga tumoral es una función de la muerte celular apoptótica, orquestada por proteasas caspasas intracelular. Sin embargo, la eficacia de algunas de estas terapias es mitigado por mutaciones que afectan a efectores específicos genes que controlan y /o regulación de la señalización de apoptosis, tales como el silenciamiento epigenético de la caspasa 8, regulación a la baja de las proteínas pro-apoptóticas Bax y Apaf-1, así como la regulación positiva de las proteínas anti-apoptóticas de las familias Bcl-2 y PAI. Por lo tanto, ha habido una oleada de actividad en torno a la identificación de nuevas vías de muerte celular, que podrían funcionar en conjunto con o en ausencia de maquinaria apoptótica eficiente. A este respecto, la evidencia reciente ha puesto de manifiesto la existencia de una novela, vía independiente de caspasas, la autofagia denominado, que se activa en respuesta a la privación del factor de crecimiento o a la exposición a compuestos genotóxicos [1]. Considerando que, el jurado está todavía fuera de la relevancia funcional de esta vía en términos de su capacidad para servir como una respuesta al estrés o un mecanismo verdaderamente efector de muerte, la evidencia reciente parece apoyar que la autofagia es una forma especializada de la muerte celular bajo ciertas condiciones [ ,,,0],2], [3], [4].
Entre los varios mecanismos efectores implicados en el control y regulación de las vías de muerte celular, incluyendo la apoptosis y la autofagia, es el estado redox celular. El estado redox de la célula se determina por el equilibrio entre las tasas de producción y descomposición de oxígeno reactivo y /o especies de nitrógeno (ROS; RNS) [5], tales como el anión superóxido (O
2
-) , peróxido de hidrógeno (H
2O
2), (OH), el óxido nítrico (NO) y el ácido hipocloroso radical hidroxilo (HOCl) [6]. Hemos demostrado previamente que la respuesta de las células tumorales a los estímulos de muerte es una función del estado redox celular, y los estímulos, en los compuestos que inducen la muerte particulares, que inducen un aumento significativo en H
2O ejecución intracelular
2 facilitar la muerte [7 ], [8], [9], [10] [11], [12], [13], [14], [15].
Curiosamente, ROS también se han mostrado señales fuertes como para la activación de mitogen activar la proteína quinasa (MAPK) la familia de proteínas que comprenden de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) de señalización, p38 y ERK [16]. Los miembros de la familia MAPK se activan en una cascada de quinasa de 3 niveles que comprende de MAPK quinasa quinasa (MAPKKK), MAPK quinasa (MAPKK) y MAPK [17]. la activación sostenida de JNK se ha vinculado directamente a un aumento en la producción de ROS intracelular [18], y un posible mecanismo podría ser a través de la inactivación de MAPK fosfatasas (MKP) [6]. Es de destacar que un aumento de ROS intracelulares, así como la activación de MAPK se ha demostrado durante la ejecución de autofagia [19], [20].
La autofagia ha sido bien reconocida como la recogida de basuras de la célula, que se referían principalmente en el secuestro de la membrana plasmática y orgánulos de larga vida en autofagosomas, que finalmente se fusionan con los lisosomas para la degradación y el reciclaje de los nutrientes [21], [22]. Más importante aún, la autofagia persistente en respuesta a estados de estrés celular sirve como una señal potente de la muerte [23], [24], [25], como en el caso de la autofagia inducida por el tratamiento, una vía específica muerte no apoptótica desencadenó tras la exposición a compuestos quimioterapéuticos [26]. Esto último constituye la base para la identificación del tipo II muerte celular, que se caracteriza por la formación excesiva autofagosoma [27], [28]. Paradójicamente, el nivel basal de autofagia inducida por el estrés, tales como la hipoxia y el factor de crecimiento consejos de abstinencia el destino celular hacia la supervivencia [29], [30], [31].
La activación de la vía canónica autofagia es crítico con arreglo el control de la interacción de proteínas BH-3 solamente Bcl-2, Beclin1 [32]. En particular, la evidencia reciente ha desenredado una nueva vía en la que la muerte celular autofágica Beclin1 es completamente prescindible [33]. Esto podría ser de gran importancia como la ejecución de la autofagia no canónica en las células cancerosas que llevan un fenotipo knockout Beclin1, podría representar un nuevo y eficaz estrategia para inducir la muerte de células de cáncer [34].
Aquí mostramos el mecanismo de muerte celular inducida en células tumorales humanas mediante un compuesto de molécula pequeña novela, 1,3-dibutil-2-thiooxo-imidazolidina-4,5-diona (C1). La exposición de carcinoma colorrectal humano y una variedad de otras líneas celulares tumorales a C1 resultó en la muerte de células con características morfológicas y bioquímicas de conformidad con la autofagia no canónica y apoptosis. Por otra parte, destacamos la participación fundamental de los principios de la producción de ROS y la activación de ERK y JNK aguas arriba de la autofagia y apoptosis vías. Esta es una novela informe que destaca la inducción simultánea de la autofagia Beclin1-independiente y la apoptosis en células tumorales mediante un compuesto de molécula pequeña, lo que podría tener enormes implicaciones clínicas, teniendo en cuenta la relativamente alta incidencia de pérdida Beclin1 en los cánceres humanos.
materiales y Métodos
Reactivos y productos químicos
el inhibidor de pan-caspasa, ZVAD-FMK, y la caspasa 3 y 9 inhibidores (DEVD-FMK y VEHD-FMK) se obtuvieron de Alexis (Bioquímicos Lausen, Suiza). El inhibidor de JNK (SP600125), el inhibidor de ERK (PD98059), catalasa bovina, solución salina equilibrada de Earle (EBSS) medio, rapamicina, dietilditiocarbamato (DDC), E64D, pepstatina-A, 3-metiladenina, C2-ceramida, N-acetil -cisteına, cristal violeta, y MTT se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). La superóxido dismutasa (SOD) se adquirió de Calbichem (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Se obtuvo el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α) de Upstate (Millipore, MA).
líneas de células tumorales
células de carcinoma de colon HCT116 fueron generosamente proporcionadas por el Dr. Bert Vogelstein (The Johns Escuela Hopkins University of Medicine, Baltimore, MD) y se mantuvieron en McCoy 5A (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suplementado con 10% FBS suero bovino fetal), 1% de L-glutamina y 1% S-penicilina (Hyclone, Thermo científica, Waltham, MA) en una incubadora a 37ºC con 5% de CO
2. HeLa carcinoma cervical, carcinoma de pulmón de células A549, M14 melanoma, las líneas celulares de neuroblastoma y SHEP1 SHSY5Y se obtuvieron de ATCC y se mantuvo en DMEM (Hyclone) suplementado con 10% FBS. líneas celulares de cáncer de mama MCF-7, T47D, y MB-MDA231 eran de ATCC y se cultivaron en RPMI (Hyclone) suplementado con 10% FBS. HK-6, C666-1 líneas celulares de carcinoma nasofaríngeo, dotados por el Dr. Lo Kwok-wai (La Universidad China de Hong Kong) y el Dr. Hsieh Wen-hijo (Johns Hopkins Singapur), se mantuvieron en RPMI suplementado con 10% de SFB .
transfección con pGFP-RLC3 y siRNA
Para la expresión transitoria, las células fueron transfectadas con 8 g de pGFP-LC3 o pCINeoEV o plásmidos pCIneo + gato en medio Optimem1 ™ (Invitrogen Corporation, Carlsbad , CA) usando el reactivo de transfección Superfect (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Para knockdown de la expresión génica, 50 nM siRNA (siRNA beclin- 1, o JNK1 /2 siRNA, o ERK1 /2 siRNA, o ATG7 siRNA, o ULK-1 siRNA) se transfectó en células en medio Optimem1 ™ utilizando el reactivo Dharmafect1 ( Dharmacon) según las instrucciones del fabricante.
viabilidad celular y la colonia formando tumor ensayos
la viabilidad celular después de la exposición al fármaco se determinó por el ensayo MTT como se ha descrito previamente (14). Para los ensayos de formación de colonias, se sembraron 10.000 células en placas de Petri y se dejaron crecer durante 2 semanas. Las placas fueron teñidas con una solución de cristal violeta (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y las colonias se puntuaron de forma manual como se describió anteriormente [35].
yoduro de propidio tinción para la fragmentación del ADN
Las células fueron tratados con C1 para los puntos de tiempo indicados como se describe en leyendas de las figuras antes de propidio tinción de yoduro para el análisis de contenido de ADN como se ha descrito previamente (14). datos de histograma que indica el porcentaje de células con ADN sub-diploide y se muestran son la media ± desviación estándar de tres observaciones independientes.
Flujo de análisis de citometría de ROS intracelular
Las células se cargaron con 5 mmol /l de el colorante sensible al redox 5- (y-6) -chloromethyl-2-, diacetato de 7-dichlorofluorescin (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) como se describió previamente (14) y se analizaron por citometría de flujo (Coulter EPICS Elite ESP). La detección de O intra-mitocondrial
2
- se llevó a cabo mediante la carga de las células con MitoSOX ™ RED MITOCHODNRIAL O
2
- indicador (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) como se describió anteriormente y se analizó por citometría de flujo ( Coulter EPICS Elite ESP). Se analizaron Al menos 10.000 acontecimientos.
Aislamiento de mitocondrias
células HCT116
tratados con C1 para 6, 12 y 24 hr se sometió a extracción mitocondrial tal como se describe en otro lugar (14). Los pellets mitocondriales se lisaron en tampón de lisis 1xRIPA estándar y los sobrenadantes se utilizaron como las fracciones citosólicas.
El análisis de inmunofluorescencia de pGFP-RLC3 y acridina naranja
de LC3 se realizó
Análisis usando pGFP-RLC3 células transfectadas mediante microscopía de inmunofluorescencia. Después de la transfección con pGFP vector vacío o pGFP-RLC3, las células se incubaron con C1 durante 6 a 24 horas y se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia (Eclipse TE2000-S, Nikon) usando la longitud de onda de excitación de 488 nm y de emisión de longitud de onda de 525 nm. Para la visualización de los lisosomas, las células se trataron durante 6 horas y luego se tiñeron con 2,5 mg /ml de naranja de acridina (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) durante 10 minutos a 37 ° C, y se analizaron para ambos, flurorescence verde y rojo, mediante microscopía de fluorescencia como se mencionó anteriormente.
La microscopía electrónica
Las células se fijaron durante la noche en un 2,5% glutaraldelhyde en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,2), antes de ser-puesto fijo en OsO4 al 1% durante 1 hora. A continuación, las células se deshidrataron en series de etanol y embebidos en resina de Spurr. Las secciones ultra finas se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron con un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1230.
Ensayo de citotoxicidad para células primarias a partir de tejidos de linfoma
tejido tumoral primaria de pacientes con T o linfoma de células B se obtuvieron de pacientes que consienten en el hospital de la Universidad Nacional de acuerdo con el protocolo aprobado por el IRB. Los tejidos se picada y filtrar a través de MACS filtro de separación (Miltenyi Biotec) para obtener suspensiones de células individuales. Los linfocitos se obtuvieron después de la centrifugación de gradiente de Ficoll Hypaque. La viabilidad celular de linfoma primario 200 l //pocillo en placas de 96 pocillos se determinó mediante ensayo MTT después de la exposición a 25 y 50 g /ml de C1 durante 24 horas. ensayo de MTT se evaluó como se describe en la sección anterior.
análisis de transferencia de Western
Se aislaron extractos de proteínas de células enteras usando 1X tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM , ácido desoxicólico 0,25%, 1% inhibidores de la proteasa (Calbiochem, San Diego, CA). cantidades iguales de proteína a partir de los lisados de células totales NP-40, EDTA 1 mM y (30 a 120 g /carril) se separaron mediante dodecilsulfato de sodio (10%, 12% o 15%) de gel de poliacrilamida de electroforesis de geles (SDS-PAGE; BioRad Laboratories), se transfirió a membrana de PVDF (BioRad Laboratories) utilizando la transferencia húmeda (BioRad Laboratories) y se transfirieron con anticuerpos primarios específicos para Bax, p62, LC3 , caspasa 9, β-actina, GAPDH, ULK1 (Santa Cruz Biotechnology), Beclin1, ATG7, ATG12, ATG5, citocromo C, JNK, p-JNK, c-Jun, PC-jun, Oferta (Cell Signaling Technology), caspasa 3 (Upstate, Millipore Corporation), la caspasa 8, Smac, anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (BD Pharmingen) y catalasa (Calbiochem) y se sondearon con los respectivos anticuerpos específicos de isotipo secundaria etiquetados con peroxidasa de rábano (Thermo Scientific Pierce, Rockford, ILLINOIS). inmuno-complejos unidos se detectaron mediante quimioluminiscencia West Pico sustrato (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).
Síntesis y análisis de la pequeña molécula de compuesto C1
La pequeña molécula de compuesto de 1,3- dibutil-2-thiooxo-imidazolidina-4,5-diona, en el presente documento se hace referencia como C1, se sintetizó como sigue: cloruro de oxalilo se añadió a 1,3-dibutil-2-tiourea (10 mM) en éter anhidro en un fondo redondo matraz bajo agitación. La mezcla de reacción se agitó durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente y después se vertió en NaHCO saturado
3. El producto se extrajo con acetato de etilo 3 veces. La capa de acetato de etilo se lavó con agua destilada y después con agua salmuera. El acetato de etilo se secó con anhidro Mg
2SO
4 y se eliminó bajo presión reducida. La purificación a través de cromatografía flash (acetato de etilo: hexano) proporcionó el producto de aceite de color amarillo. El producto oleoso se solidificó en un refrigerador. entonces el compuesto fue analizado por
1H NMR,
13C NMR y MS y los resultados se presentan de la siguiente manera:
Nombre: 1,3-dibutil-2-thiooxo-imidazolidina-4,5-diona; Color naranja; FT-IR (en CH
2Cl
2): 2875-2960 cm
- (CH alifáticos), 1770 (C = O), 1410 (C = S);
RMN 1H (en la CDCL
3): δ = 0,95 9 (t, J = 7,3 Hz, 6H, 4 '-CH
3), 1,34 (sext, J = 7,7 Hz, 4H, 3' -CH
2), 1,67 (quint, J = 7,2 Hz, 4H, 2-CH
2) 3,93 (t, J = 7,5 Hz, 4H, 1'-CH
2);
13C RMN (en CHCl
3): δ = 13,54 (C4 '), 19.90 (C-3'), 29.72 (C-2 '), 41.83 (C-1'), 155.35 (C- 4,5), 180,63 (C-2); De masas m /z (%): 242 (100) [M
+], 209 (26) [M + -HS], 187 (22); MF C
11H
18N
2O
2S calcula 242,34, 243,34 encontrado
Rendimiento:. 95%
Estadística análisis
Todos los experimentos se realizaron al menos 3 veces menos que se indique lo contrario. Se probaron las diferencias experimentales de significación estadística utilizando Estudiante de
t-test
.
P valor Red de & lt; 0,05 fue considerado como significativo
Resultados
C1 induce la muerte celular y MOMP en células tumorales humanas
La exposición de las células tumorales. a concentraciones crecientes (desde 25 hasta 200 g /ml) de C1 resultado en una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular a las 24 horas con la LD50 de ~ 100 g /ml (Figura 1B). Además, el ensayo de formación de colonias mostró una reducción significativa en la capacidad clonogénico en 25 y 50 mg /ml y un cese completo de la formación de colonias en 100 g /ml (Figura 1C). Los resultados también mostraron que la incubación de células con C1 desencadena permeabilización mitocondrial membrana externa (MOMP) como se evidencia por la translocación de citocromo c y Smac, y la translocación recíproca de Bax y Bid a la mitocondria (Figura 1D). Además, hemos obtenido la evidencia para el procesamiento eficiente de las caspasas 3, 8 y 9, y la escisión de la PARP sustrato de caspasa 3 en lisados de células totales a partir de células después del tratamiento C1, que fue rescatado en presencia de zVAD-fmk (Figura 1E, F ). Análisis del ciclo celular reveló un 20% de las células con contenido de ADN sub-diploide (población sub-G1) después de un tratamiento de 24 horas, lo cual fue significativamente mayor (52%) tras la incubación durante 48 horas y se bloquearon en presencia del pan-caspasa inhibidor (Figura 1G). Curiosamente, zVAD- sólo proporcionó una protección parcial formulario de la muerte celular inducida por C1 (Figura 1H). Estos datos indicaron que la muerte celular inducida por C1 podría implicar vías de caspasa-independiente. Para investigar eso, primero evaluó el efecto del inhibidor de la necrosis, necrostatin, sobre la muerte celular inducida por C1. Los resultados mostraron que mientras necrostatin podría derogar efectivamente factor de necrosis tumoral-α inducida por la muerte celular (Figura S1A), que no tuvo ningún efecto sobre la muerte celular inducida por C1, lo que excluye la participación de necrosis en este modelo (Figura 1I).
(A) estructura química y el peso molecular del compuesto C1. (B) Las células se trataron con concentraciones crecientes de C1 (25 mg /ml a 100 mg /ml) durante 18 horas y la supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. (C) Después de la exposición a C1 como en (B), se sembraron 10.000 células en 100 mm placas de Petri para la evaluación de la formación de colonias. (D) Las células fueron tratadas con C1 (100 mg /ml) durante 6, 12 y 24 horas, y las fracciones subcelulares fueron sometidos a análisis de transferencia Western. (E) Los lisados de las células tratadas con C1 (100 mg /ml) para se probaron para el procesamiento de las caspasas 3, 9 y 8. (F, G, H) Las células fueron tratadas con C1 (100 mg /ml para 18 h) en la presencia o ausencia de zVAD-fmk (50 M) durante 12 y 24 horas y los lisados (F) se probaron para la escisión de PARP y (g) los perfiles del ciclo celular se obtuvieron mediante tinción con PI y la supervivencia (H) se evaluó mediante el ensayo de MTT . (I) Las células fueron pre-incubadas con Necrostatin-1 (50 mM durante 1 hora) antes de la exposición a C1 (100 mg /ml durante 18 h) y la supervivencia se evaluó mediante el ensayo de MTT.
La inducción de la autofagia Beclin1 independiente por alquilo C1
a continuación, se realizó un análisis con microscopio electrónico de la morfología celular después de la exposición a C1. Curiosamente, la exposición de las células a C1 (100 mg /ml durante 24 horas) dio lugar a la formación de autofagosomas y vacuolas autofágicas (Figura 2A). Además, se observó el aumento de expresión de MAP1 LC3II (en adelante denominado como LC3II) de una manera dependiente del tiempo (Figura 2B). De particular interés, se identificaron por primera vez en el enriquecimiento LC3II las fracciones de membrana pesados después del tratamiento de drogas (Figura 2C). Esto puede indicar la presencia de inmersión mitocondrial por las vacuolas autofágicas. Además, las células transfectadas con LC3-GFP muestran un patrón difuso, mientras que la exposición a C1 dio lugar a una tinción punteada verde, indicativo de acumulación LC3II dentro de las membranas autophagosomal (Figura 2D). Además, se observó un aumento significativo en la expresión de ATG7 y ATG5 junto con una disminución recíproca en la expresión Atg12 después de la exposición (6-24 horas) de las células a C1, lo que indica ATG5-Atg12 conjugación (Figura 2E).
(a) se trataron con C1 (100 mg /ml) durante 24 horas, se fijaron y se observan bajo un microscopio electrónico (aumento x 40.000). Las flechas indican la presencia de autofagosomas. (B) Los lisados de células tratadas con C1 (100 mg /ml) se probaron para LC3II. (C) Análisis de transferencia de Western de LC3II dentro citosólica y las fracciones mitocondriales de las células tras la exposición a C1. (D) Las células fueron transfectadas transitoriamente con GFP-Vector o LC3-GFP durante 48 horas, expuestos a C1 durante 24 horas y después se analizaron usando un microscopio de fluorescencia. Las flechas apuntan a la tinción punteada indica LC3 II agregación en autofagosomas. (Mag: 40.000 ×). (E) Después de la exposición C1, lisados celulares se probaron para ATG7, ATG5 y Atg12.
A continuación se examinó si había suficiente flujo de autofagia con la exposición a C1. flujo de autofagia es crucial para determinar si la carga de la autofagia y montaje finalmente llega a los lisosomas y es posteriormente degradada. Una de las maneras de determinar flujo autophagic es pre-tratamiento con inhibidores lisosomales, E64D y pepstatina A, antes de la adición del estímulo. inhibidores lisosomales aumentan la formación LC3 II, en parte, mediante el bloqueo de la fusión autophagosomal-lisosomal. Por lo tanto, se investigó el efecto de la inhibición en la formación de los lisosomas LC3II inducida C1. Nuestros resultados muestran que los inhibidores de aumento del recambio LC3II en las células en puntos de tiempo tempranos (6 horas), sin embargo, no hubo más aumento tras la incubación más largo (24 horas) con el compuesto (Figura S1E). Entonces nos registramos para el nivel de expresión de p62 /SQSTM1, un marcador de flujo de autofagia [36]. Los niveles de p62 disminuyó tras el tratamiento C1 en puntos de tiempo tempranos indicativos de la autofagia eficiente, sin embargo, los niveles aumentaron posteriormente (12-24 hrs, que complementa la figura S1F), lo que podría implicar la posibilidad de flujo de autofagia aberrante. Esta última observación fue respaldada por la evidencia de ruptura lisosomal, ensayada por el naranja de acridina, que emite fluorescencia roja en los compartimientos ácidos tales como los lisosomas y verde en el pH neutro. Se observó un aumento en flurorescence verde con una disminución recíproca en flurorescence rojo en las células tras la exposición a C1, lo que indica la ruptura de los lisosomas (Figura S1F)
.
Con el fin de evaluar el papel de Beclin1 en C1-inducida autofagia, se llevó a cabo el silenciamiento mediado por RNAi de
Beclin1
. Golpear abajo de
Beclin1
ni acumulación LC3II inhibida inducida por C1 ni podía rescatar células de la actividad de muerte activación de la pequeña molécula de compuesto (Figura 3A). En particular,
Beclin1
silenciamiento podría derogar eficazmente la formación LC3II inanición inducida por el suero, lo que demuestra el papel clásico de Beclin1 en la inanición inducida por la autofagia (Figura S1C). En contraste con
Beclin1
silenciamiento, Si
ATG7
resultó en una disminución significativa en la acumulación de LC3II inducida por exposición C1 mientras que la señal de apoptosis (escisión PARP) se mantuvo sin cambios (Figura 3B). Tomados en conjunto, estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que la exposición de las células HCT116 a C1 desencadena la autofagia no canónica, pero implica la intermediación de la ubiquitina enzima E1-como ATG7. Corroborando estos hallazgos son resultados obtenidos con el gen desmontables de la UNC-51 como quinasa (ULK1; homólogo de mamífero de la levadura ATG1), que de igual forma inhibió la formación de LC3II en este modelo (Figura 3C). Por otra parte,
a priori
tratamiento de las células con 3-MA (5 ó 10 mM) tuvo prácticamente ningún efecto sobre la acumulación de LC3 II inducida por C1 (Figura 3D). Es importante destacar que el tratamiento previo de las células HCT116 con ZVAD-fmk, caspasa 3 inhibidor o inhibidor de la caspasa 9 no alteró la acumulación de LC3II I inducida por C1, lo que indica que las señales que regulan la apoptosis no afectan la señalización autophagic vía (Figura 3E). Las células HCT116 que es más importante, el silenciamiento de ATG7 protegida de manera significativa a partir de la reducción inducida por C1 en la viabilidad celular, lo que indica que la señal de la autofagia podría ser un disparador de la muerte celular efectiva (Figura 3F). Como Beclin1 no participó en la autofagia inducida por C1, desmontables de forma natural Beclin1 no alteró la respuesta de muerte celular (Figura 3F). Sin embargo, ULK silenciamiento también tuvo ningún efecto significativo sobre la muerte celular (Figura 3F), con el argumento de este modo a favor de los efectos compensatorios ejercidas por otros
Atg
prominentes genes.
(A), (B) y (C) Las células fueron transfectadas transitoriamente con siRNA contra Beclin1, o ATG7 o ULK1 durante 48 horas, seguido por la exposición a C1 (100 mg /ml) durante 24 horas. lisados de células enteras fueron luego probaron para LC3II. (D) Las células se pre-incubaron con 3-MA (5 o 10 mM) durante 1 hora antes de la exposición a 100 mg /ml de C1 durante 18 horas. Lisados fueron inmuno-borró con anti-LC3. (E) Las células se pre-trataron con ZVAD-fmk (50 mM), caspasa 3 inhibidor (50 mM) o la caspasa 9 inhibidor (50 mM) antes de la adición de 100 g /ml de C1 durante 18 horas. Lisados fueron inmuno-borró con anti-PARP y el anticuerpo anti-LC3. (F) Las células fueron transfectadas con siRNA contra Beclin-1 o ATG7 o ULK1 y luego expuestos a 100 g /ml de C1 durante 18 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT como se describe en Materiales y Métodos.
Para demostrar que el efecto inductor de la autofagia de este compuesto de moléculas pequeñas no se limitaba a la línea celular de carcinoma colorrectal, la formación era LC3II evaluado en 9 otras líneas celulares de cáncer humano de variados orígenes. De hecho, se observó un aumento en la formación de LC3II en todas las líneas celulares ensayadas, aunque a diferentes concentraciones de fármaco (figura 4A). Cabe señalar que, de forma similar a las células HCT116, estas líneas celulares también fueron sensibles a la inducción de apoptosis por C1 (datos no mostrados). Para explorar adicionalmente la relevancia de traslación de estos datos obtenidos con líneas celulares establecidas, próximo a prueba el efecto de C1 en células no transformadas (MCF-10A y MRC líneas) así como en células primarias obtenidas de pacientes con linfomas. A diferencia de las células cancerosas, las células no transformadas no mostraron ningún signo de la autofagia en respuesta a C1, en comparación con las células HCT116 y las células MDA-MB-231 (Figura 4B). Además, una muestra representativa de un paciente con linfoma clínica suscitó claramente la formación LC3II fuerte en respuesta a la exposición al fármaco (Figura 4B). Más importante aún, la exposición de células primarias derivadas de pacientes con linfoma (n = 12) mostró la sensibilidad dependiente de la dosis a C1, mientras que las células de los ganglios linfáticos no cancerosas eran relativamente refractario al tratamiento (Figura 4C). Estos datos establecen claramente que la pequeña molécula de compuesto C1 activa y la muerte celular en una variedad de líneas celulares de cáncer y en células primarias, sin afectar a las células no transformadas.
(A) Cultivos primarios de linfoma y benignos tejidos eran cultivar en placas de 6 pocillos y se expone a C1 a 25 y 50 mg /ml durante 24 horas y la supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo de MTT. (B) las células del linfoma primario, MDA-MB-231 células de cáncer de mama, células epiteliales mamarias MCF10A, HCT116 células colorrectales y MRC-5 de fibroblastos de pulmón humanos estaban siendo tratados con C1 a varias dosis durante 18 horas. Los lisados celulares fueron luego ser inmuno-inmunotransferencia con anti-LC3 con GAPDH como control de carga. (C) Las células tumorales de diferentes linajes fueron tratados con varias concentraciones de C1 durante 24 horas y los lisados de células totales se probaron para LC3 II y β-actina.
intracelular de ROS controla la autofagia inducida por C1 y apoptosis
Una vez establecido claramente la capacidad de C1 para inducir simultáneamente la autofagia y apoptosis en las células cancerosas, nos dispusimos a investigar el mecanismo (s) molecular que subyace a esta actividad biológica. En primer lugar, se evaluó el efecto sobre la producción de ROS intracelular usando dos sondas fluorescentes diferentes (MitoSOX ™ RED y CM-DCHF-DA). De hecho, la exposición de las células a C1 resultó en un aumento significativo de la producción de ROS intracelular medido por el H
2O
2-sensitve sonda CM-DCHF-DA, así como un aumento en O intra-mitocondrial
2
- producción (Figura 5A). Pre-incubación de células con el ROS scavenger N-acetil cisteína (NAC; 200 mM) o el H
2O
2 scavenger, catalasa (7000 unidades /ml), bloqueó completamente el aumento de la CM-DCHF-DA fluorescencia, lo que sugiere fuertemente que las especies involucradas ROS es H
2O
2 (Figura 5B). Corroborando estos hallazgos, se encontró que la sobreexpresión de la catalasa humana de abrogar la producción de ROS inducida por C1, evaluado por tinción con CM-DCHF-DA (Figura 5A). Curiosamente, la catalasa pre-incubación, así como la sobreexpresión transitoria de plásmido que contiene el gen de la catalasa humana también inhibió la escisión de PARP inducida por C1, un marcador de la activación de caspasa 3 (Figura 5B). Se observó un efecto similar inhibidor de la catalasa (adición exógena, así como la sobreexpresión) y NAC sobre la acumulación inducida por LC3II C1 (Figura 5C). Estos datos implican fuertemente intracelular H
2O
2 como el estímulo de aguas arriba que controla tanto la autofagia y la apoptosis en este modelo.
En total, 1 × 10
6 células se incubaron con 100 g /ml de C1 durante 3 horas y (Ai) intra-mitocondrial O
2
- se determinó usando el colorante fluorescente MitoSOX ™ ROJO mitocondrial O
2
- Indicador e intracelular H
2O
2 se detectó por DCHF-DA de carga y se analizó por citometría de flujo. (Ai) Las células se pre-incubaron con catalasa (7000 unidades /ml) o NAC (200 mM) durante 1 hora antes del tratamiento con C1 (100 mg /ml durante 3 horas) y intracelular H
2O
2 fue determinado. (AII) Las células fueron transfectadas transitoriamente con 8 g de pCINeoEV o pCINeo + CAT durante 48 horas (AIII) y se trató con C1 (100 mg /ml durante 3 horas) y intracelular H
2O se determinó
2 (Aii ). Las células se pre-incubaron con catalasa (7000 unidades /ml durante 1 hora) o fueron transfectadas transitoriamente con pCINeoEV o pCINeo + CAT antes de la exposición a C1 (100 mg /ml durante 24 horas), y los lisados celulares totales se sometieron a inmunotransferencia para (B)