Extracto
Introducción
Bio-repositorios son recursos invaluables para poner en práctica la investigación translacional del cáncer y programas clínicos. Representan una de las herramientas más poderosas para los estudios biomoleculares de cohortes clínicamente anotado, pero se requieren muestras de alta calidad para generar lecturas fiables moleculares y estudios funcionales. El objetivo de nuestro estudio era definir el impacto del tiempo de isquemia en el tejido de cáncer de ARN y ADN calidad, y para la generación de xenoinjertos derivados de los pacientes (PDXs).
Métodos
El cien se seleccionaron treinta y cinco especímenes de cáncer de pulmón entre los
biobanco
muestras institucionales. Se evaluaron las asociaciones entre diferentes caliente (quirúrgica) y frío (ex vivo) rangos de tiempo de isquemia y la calidad del ARN o PDXs tasas de injerto. la calidad del ARN se determinó mediante valores numéricos integridad del ARN (RINs). fragmentos de tejido viables frescas se implantaron subcutáneamente en ratones GSN y en serie trasplantado
Resultados
ARN con una RIN & gt;. 7 se detectaron en el 51% de la muestra (70/135), con valores de RIN significativamente menor (OR 0,08; p = 0,01) en las muestras conservadas durante más de 3 horas antes de la crioconservación. Las muestras de ADN de calidad más altos tenían un alto RIN concomitante. Sesenta y tres tumores primarios (41) de adenocarcinoma fueron implantados con una tasa de injerto global de 33%. Tanto prolongada caliente (& gt; 2 horas) y ex vivo en tiempo de isquemia (& gt; 10 horas). Se asociaron con una menor tasa de injerto (OR 0,09 p = 0,01 y OR 0,04 p = 0,008, respectivamente)
conclusión
calidad del ARN y la proporción de injertos PDXs se vieron afectados negativamente por los tiempos de isquemia prolongados. recogida de tejido y el procesamiento adecuados reducen la tasa de fracaso. En general, los bancos biológicos CPNM representa una modalidad innovadora, que puede ser ejecutado con éxito en la práctica clínica habitual, cuando se adoptan estrictos procedimientos operativos estándar
Visto:. Guerrera M, Tabbo M, L Bessone, MALETTA M, M Gaudiano, Ercole E, et al. (2016) La influencia de la isquemia tisular Tiempo de ARN integridad y xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) El injerto Rate en un no microcítico de pulmón (NSCLC) Biobanco. PLoS ONE 11 (1): e0145100. doi: 10.1371 /journal.pone.0145100
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, ITALIA
Recibido: 4 Julio, 2015; Aceptado: 28 Noviembre 2015; Publicado: 5 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Guerrera et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer [1]. No Cáncer de pulmón microcítico (CPNM) es el subtipo más común, y la estadificación clínica-patológica se considera el estándar de oro para definir el pronóstico de los pacientes. Sin embargo, la definición correcta de la evolución clínica de cada paciente concreto sigue siendo problemática [2]. A pesar de que en la última década nuevos enfoques terapéuticos, incluyendo terapias moleculares, se han introducido, una caracterización molecular clínica completa para cada individuo sigue siendo aplicable sólo a una fracción de los pacientes y limitarse a las políticas de proveedores de seguros de salud. Por último, incluso en los mejores ajustes, los resultados siguen siendo muy triste.
Hay un acuerdo abrumadoras de que para avanzar en nuestro éxito clínico, un mapa detallado de los mecanismos patogénicos de conducción cánceres de pulmón es absolutamente necesario. Para obtener específica del paciente y las huellas digitales integrales la integración de múltiples modalidades de análisis (por ejemplo, genómica, transcriptómica, proteómica) y las muestras apropiadas (por ejemplo, muestras de tejidos, plasma) [3] que se requiere. En última instancia, se espera que el conocimiento que surgirá de traducirse rápidamente en los protocolos de tratamiento personalizado. bio-repositorios públicos de muestras caracterizadas molecularmente y clínicamente anotado se cree que representan una herramienta muy valiosa para el diseño y ejecución de tratamientos innovadores y más éxito. xenoinjertos
Derivados-paciente una vez esfuerzos bio-repositorio están asociados a, sus valores aumentan enormemente. De hecho, los modelos PDX representan la vanguardia en la investigación traslacional [4] y cuando se asocia a la secuenciación de próxima generación (NGS) analiza proporcionar una herramienta sin igual. Dado que la tasa de PDX injerto está vinculada a varias variables, incluyendo la naturaleza de los tumores, etapa de la enfermedad y la calidad de toma de muestras de tejido, un tejido de adquisición rápida y un manejo correcto de especímenes frescos es absolutamente crítico.
Hacia este fin, la transferencia de especímenes quirúrgicos de la sala de operaciones (OR) para el teatro patología quirúrgica requiere una organización afilada, capaz de poner en práctica Procedimiento de operación Estándar estrictas (SOP) dentro de una red multidisciplinar integrada [5]. Desde una transferencia oportuna limita el tiempo de isquemia ex vivo, un considerable esfuerzo debe dedicarse a mejorar este paso crítico que favorece la mejor conservación de la pieza anatomopatológica. Nuestro propósito era definir el impacto del tiempo de isquemia de tejido de cáncer de la calidad de especímenes de cáncer de pulmón almacenada en nuestra bio-repositorio y cómo esto puede influir de alto rendimiento molecular analiza y el desarrollo de nuevos modelos preclínicos in vivo.
Aquí se describe un protocolo de recogida de tejido que imaginar la preservación inmediata de la pieza quirúrgica utilizando un método de sellado de vacío dentro de la instalación o, seguida de transporte de muestras a 4 ° C para la patología quirúrgica.
Métodos
A. Descripción paciente Cohorte
Se analizaron retrospectivamente muestras de cáncer de pulmón recogidos de 135 pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica 2010-2012 con intención curativa inicial. Los pacientes tratados con protocolos preoperatorios (
i
.
e
. Quimioterapia, radioterapia) fueron incluidos. Dentro de la biorepositorio corresponde tejido pulmonar normal, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), se adquirieron muestras de suero y saliva.
B. Consentimiento informado
Una dedicada consentimiento informado, en relación con el almacenamiento de muestras humanas, se desarrolló el uso general en la investigación y análisis moleculares. Se prestará especial atención se ha prestado a las siguientes cuestiones:
Propósito del estudio
La participación voluntaria
Recogida de datos clínicos y demográficos
Privacidad y confidencialidad
Beneficios y riesgos de la participación
Re-contacto para la información de seguimiento y resultados de investigación regresan
La retirada del consentimiento
proyecto de investigación secundaria
Muestra la propiedad y la propiedad intelectual
Bio-muestras y el almacenamiento de líquidos bio-
Para cada paciente incluido en el protocolo de biobancos, el consentimiento informado por escrito se recogió en el entorno preoperatorio por el cirujano del Departamento de Cirugía Torácica y el paciente fue inscrito en el Registro BioBanco. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Azienda Ospedaliera Universitaria, Citta 'della Salute e della Scienza di Torino.
C. Protocolo de recogida de
Las muestras de saliva se recogieron antes de la operación con Oragene • ADN (OG-500) para el almacenamiento a largo plazo. Las muestras de sangre (10 cc) se adquirieron el periodo perioperatorio en tubos BD Vacutainer heparinizado (2 y 2 tubos no heparinizada) y procesados. PBMCs, plasma y suero, se recogieron y se almacena adecuadamente. El equipo de banco de tejidos fue alertado el día antes de la cirugía.
Las muestras se conservaron y se transfieren al laboratorio de patología mediante el envasado al vacío y enfriamiento procedimiento (VPAC) [6, 7]. En pocas palabras, en el quirófano, explante de muestras quirúrgicas se colocaron inmediatamente en esterilizada beta-ray bolsas de plástico selladas al vacío y que utilizan la máquina TissueSAFE (Mod VAC 10, por Milestone, Bergamo, Italia;. Www.milestonemedsrl.com), como procedimiento estándar en nuestra institución [8]. Las muestras fueron luego conservados y llevados a los laboratorios de patología, en frío (4 ° C) caja de plástico, y se almacenan aún más a 4 ° C antes del procesamiento.
Los procedimientos de rutina histopatológicos se integraron con el protocolo de biobancos (S1 Higo). Cada muestra se orientó, se mide y se describe, siendo conscientes de que la colección no afectaría el diagnóstico patológico. Entonces, las masas tumorales se extirparon y se tomaron muestras. Al mismo tiempo, el tejido pulmonar normal se tomó de un área no afectada distal (S2 Fig). Los fragmentos de tejidos se almacenaron en diferentes medios: en OCT (Sukura Finetek, Torrance, CA) para el corte de tejido congelado, ARN
después
® Solución de Estabilización (Life Technologies) para la extracción de RNA y congeladas instantáneamente y luego mantiene en -80 ° refrigerador. Por último, los fragmentos de tejido pequeños (2X2X2 mm) se colocaron en un medio de congelación (59% RPMI, 30% FBS, 10% de DMSO, 1% pen-strep) y después se almacenaron en nitrógeno líquido. muestras representativas de diagnóstico se sometieron a procedimientos de procesamiento histopatológicos de rutina. Información relacionada con el paciente (tiempos de almacenamiento y crioconservación y clínicos, datos demográficos y histopatológicos) se almacenan en el Registro BioBanco.
D. ADN /ARN extracción y Evaluación de la Calidad
El ADN genómico se extrajo con el método de extracción con fenol-cloroformo estándar [9].
Las muestras de tejido fueron homogeneizados en Trizol y se extrajo el ARN como para las instrucciones del fabricante. Para eliminar cualquier contaminación de ADN genómico, cuando está presente, las muestras de ARN se sometieron a desoxirribonucleasa tratamiento y se volvió a extraer utilizando el método de fenol-cloroformo [10].
El ADN total y RNA se cuantificó con 2000c NanoDrop (Thermoscientific) instrumento y se registraron las proporciones de absorbancia a 260 nm /280 nm y 260 nm /230 nm. ARN total (1 mu l) se analizaron en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) utilizando ARN Nano LabChips (Caliper Technologies Corporation, Hopkinton, MA). los valores del número de integridad del ARN (RIN) se establecieron como mediciones empíricas de la integridad del ARN.
E. cDNA síntesis y QRT-PCR
ARN total fue inverso-transcrito antes de la amplificación de PCR en tiempo real. 1 ng de ARN total se trató con DNAseI recombinante, libre de RNasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y transcrito de forma inversa usando el Sistema de Síntesis de superíndice First-Strand para el kit de RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. RT-qPCR se realizó con un iCycler Thermal (Bio-Rad) utilizando el iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 10 segundos y luego 60 ° C o 62 ° C durante 30 segundos. Para confirmar la especificidad de la amplificación, los productos de PCR se sometieron a análisis de curva de fusión, la linealidad, y la pendiente de la curva estándar utilizando software CFX (Bio-Rad). Todos los ensayos de PCR se realizaron por triplicado
mRNA se evaluaron los niveles de expresión para 3 diferentes genes de limpieza:. GAPDH, actina y OPH. Los conjuntos de cebadores fueron diseñados utilizando Primer3 (S1 Tabla).
F. Multiplex PCR
integridad del ADN se estimó mediante una PCR múltiple con un conjunto de 5 pares de oligoprimers diseñados para amplificar dianas de ADN diferentes (100, 200, 300, 400 y 600 pb) (S2 cuadro) [11]. Se añadieron cebadores en 1: 1: 1: 2 para obtener productos de PCR con igual intensidad después de la separación en gel de agarosa. amplificación del ADN se realizó de la siguiente manera: preactivación 7 min a 95 ° C (1 ciclo) seguido de 40 ciclos: desnaturalización 45 seg a 95 ° C, recocido 50 seg a 60 ° C, extensión 1,30 min a 72 ° C con un ciclo de extensión final de 15 min a 72 ° C. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa (2% de agarosa en tampón TBE 1%).
G. Los xenoinjertos derivados de los pacientes (PDX) guía
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ ratones (GSN) fueron amablemente proporcionados por L. Shultz de The Jackson Laboratory y se han criado en el Centro de Biotecnología Molecular (CBM) de recursos de animal, bajo la estricta específico y patógeno oportunista (SOPF) condiciones libres.
el animal protocolo para este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de animales de la Universidad de Turín.
PDXs en resumen, se establecieron utilizando frescas o congeladas fragmentos de tejidos patológicos, sólo cuando suficiente material estaba disponible para análisis de diagnóstico molecular y de rutina. Las muestras tumorales-injerto se cortaron en pedazos múltiples mm 2x2x2 (múltiples piezas /muestra) en medio completo. De seis a ocho semanas de edad NSG se anestesiaron primero (Rompun 0.05μl /g e Zoletil 1.6μg /g por vía intramuscular), y se esterilizó su región dorsal (70% de etanol). Una incisión en la piel (0,3 cm) se hizo posteriormente a lo largo de la región retronuchal la línea media dorsal y un pequeño bolsillo fue creado por disección roma. fragmentos de tejido de tumor de injerto múltiples (2-4) se transfirieron a cada bolsillo subcutáneo utilizando pinzas de extremos romos. Los bordes cortados se sellan con un solo clip de metal. Los ratones fueron controlados regularmente hasta que se hicieron vigilia. animales implantados fueron alojados en grupos del mismo sexo. Implante de crecimiento se evaluó por palpación y se recogieron las masas tumorales cuando sea necesario (& lt; 1,5 cm
3). Los animales receptores fueron revisados regularmente y se sacrificaron a las primeras señales de socorro. En la cosecha, los ratones fueron sacrificados en una cámara de CO2 y se recogieron tumorgrafts para la evaluación histológica, los estudios moleculares, re-injerto, o se congelaron en nitrógeno líquido.
H. Resultados del estudio y el análisis estadístico
Los datos categóricos se presentan como número (porcentaje,%), los datos continuos se presentan con su mediana (rango intercuartil, IQR).
El RIN se calculó en todas las muestras como sustituto de la conservación del tejido. Un RIN de ≥7 se estableció como punto de corte para realizar matrices de RNA microarrays de expresión y análisis RNAseq.
PDX injerto fue considerada exitosa cuando las masas tumorales se generaron después de al menos dos pasajes y sus características patológicas fueron confirmados por histología y inmunohistoquímica. Pearson prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher, cuando sea apropiado, se utilizaron para evaluar las diferencias en los grupos injertados no injertado y: la dimensión del tumor, histología, grado tumoral, estadio TNM patológico, estado de la resección, los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) , se determinó la presencia de invasión microvascular y la duración quirúrgica
.
la influencia de los tiempos de isquemia tisular en la calidad y el éxito del injerto RIN PDX fueron los puntos finales primarios del estudio. El
isquemia caliente
tiempo que pretendía ser el tiempo quirúrgico total y el
ex-vivo (en frío)
tiempo de isquemia se definió como el período de tiempo entre la adquisición de especímenes en el quirófano y la momento de su criopreservación
Como segundo punto final, se evaluaron los niveles de expresión de ARN y la integridad del ADN genómico en un subconjunto elegido al azar de muestras (
muestra
comando en STATA):. seleccionamos 3 muestras con baja calidad RIN y 3 con alta calidad RIN entre cada una isquemia clases de tiempo. resultados de expresión génica se evaluaron como expresión absoluta en términos de ciclos de cuantificación (Cq significa). Las diferencias entre los grupos fueron investigados por el test de Wilcoxon-Mann-Whitney. Se analizó también el año de contratación
A los efectos de nuestra investigación, hemos agrupado los casos en cuatro categorías de acuerdo con ex vivo-tiempos de isquemia:. ≤1 horas, 1-2 horas, 3-5 horas, 6 -9 horas y ≥ 10 horas.
La asociación entre la calidad del ARN (RIN de ≥7) o las tasas de injerto PDX y grupos individualizados se evaluó mediante el modelo de regresión logística. Para evitar posibles influencias de confusión, se realizó un modelo de regresión logística multivariante ajustado incluyendo las siguientes variables quirúrgicos y patológicos: subtipos histológicos (adenocarcinoma como referencia), la clasificación del tumor (G1 como referencia), el estadio TNM patológico (Etapa I como referencia) y la duración de la cirugía (horas, como continua).
odds ratio (OR) y los correspondientes intervalos de confianza del 95% (95% IC) se proporcionan para cada modelo. Todos los análisis estadísticos fueron evaluados utilizando STATA (versión 12.1).
Resultados
A. Características clínicas y patológicas
Se estudió un total de 135 muestras de cáncer de pulmón. La Tabla 1 resume las características clínicas, quirúrgicas y patológicos. La mediana de edad en la cirugía fue de 69 años (IQR 64-75), los pacientes con más frecuencia varones (92, 68%) y los fumadores (106, 81%). La duración media quirúrgica (IQR 1-3) y el tiempo de isquemia ex vivo mediana (IQR 1-6) eran ambos de 2 horas. el tamaño tumoral medio fue de 3 cm (IQR 2-5) y las etapas del tumor TNM patológica fueron los siguientes: Etapa IA 32 (23%), IB 13 (10%), IIA 21 (15%), IIB 13 (10%), IIIA 37 (27%) IIIB 1 (1%), IV 18 (13%). Adenocarcinoma fue el subtipo más común histológico (89, 66%) seguido por el carcinoma de células escamosas (31, 23%), carcinoma de células grandes (7, 5%), carcinoide (4, 3%), sarcomatoide (2, 2%) , adenoescamoso (1, 1%) y de células pequeñas (1, 1%). Según Travis clasificación adenocarcinoma [12], se observó 44 adenocarcinoma (55%) acinar, 21 (26%) de un sólido, 10 papilar, mucinoso 3, 2 y 9 lepidic NOS. Noventa y cinco (70%) pacientes fueron sometidos a lobectomía, 14 (10%) a bilobectomy, 13 (10%) a la neumonectomía y 13 a resección sub-lobular; Se observaron márgenes de resección positivos en 13 casos (10%, 10 R1 y R2) 3.
B. RIN Calidad
A RIN ≥7 se observó en el 51% de la muestra (70/135): el porcentaje de muestras con una alta calidad de ARN de acuerdo con el tiempo diferentes ex-vivo de isquemia se ilustra en la figura 1A. electroferogramas representativos muestran las medidas de la integridad del ARN de 12 muestras representativas (figura 2, panel inferior) obtenidos a partir de muestras de cáncer de pulmón fresco congelado en bancos.
A- Porcentaje de muestras adecuadas para las matrices de expresión de genes (número de integridad del ARN [RIN ] de ≥7) en diferentes momentos ex-vivo de adquisición (tiempo de la extirpación quirúrgica de la crioconservación) para ≤1 horas, 1-2 horas, 3-4 horas, 5-9 horas y ≥ 10 horas. Relación entre B- veces ex-vivo de adquisición (& lt; 1 y 1-2 horas, a partir de la escisión de la crioconservación) y la idoneidad para arrays de expresión génica (número integridad del ARN [RIN] de ≥7) y períodos de tiempo 2010, 2011, y 2012 .
electroferogramas representativos (Agilent 2100 Bioanalyzer) demostrar la integridad del ARN se mide por el número de integridad del ARN (RIN) de 12 muestras representativas (parte inferior).
el uso de un modelo multivariado ajustado puso de manifiesto que las muestras almacenadas después de diferentes intervalos muestran un descenso del valor de RIN poco después de 2 horas de tiempo de isquemia ex-vivo (isquemia fría): 3-4 horas (OR 0,08, p = 0,044), 5-9 horas (OR 0,15; P = 0,011) y ≥ 10 horas (OR 0,25, p = 0,022) (tabla 2). Por el contrario, el tiempo quirúrgico (isquemia caliente) no influyó en la calidad del ARN.
Análisis de regresión logística
multivariante en 135 muestras de NSCLC.
No hay diferencia en la proporción de muestras con ARN de alta calidad se demostró de acuerdo con el año de almacenamiento, la histología y el grado tumoral: la figura 1B muestra el porcentaje de muestras tumorales con RIN de ≥7 y el tiempo de adquisición ex-vivo, de acuerdo con las adquisiciones de biobancos. A la inversa, una etapa de alta pTNM se asoció con valores RIN bajas (& lt; 7, P & lt; 0,05).
C. Expresión de ARNm Nivel
Veintiocho casos fueron seleccionados al azar para evaluar la calidad del ARNm mediante la evaluación de los niveles de expresión de los genes de limpieza. Como se muestra en la figura 3A, los valores obtenidos son Cq entre 18 y 37. Cq con más de 25 ciclos se han observado en las muestras con RIN & lt; 4, mientras que en las muestras con valores de RIN dentro de 4 a 10, estos genes podrían detectado de manera eficiente con menos ciclos (de 20 a 25 ciclos). Las muestras con las expresiones más bajos se observaron preferentemente en el grupo con ≥ 3 horas de tiempo de ex-vivo de isquemia.
A-Cq niveles de expresión de los genes de limpieza en seleccionados al azar 28 muestras representativas de todas las categorías de tiempo. electroforesis en gel de 28 B- ADN genómico amplificado con PCR multiplex de amplificación en diferentes números de paires de bases (pb 100, 200 pb, 300 pb, 400 pb, 600 pb).
D. De alta peso molecular (HMW) Genomic DNA Integrity
Las mismas 28 muestras utilizadas para la determinación del ARN también fueron evaluados por su integridad ADN genómico (Fig 3B). La presencia de bandas en cada tamaño fue utilizado como un sustituto de la calidad del ADN, teniendo en cuenta la amplificación a través de 600 pb como el valor más alto de ADN de calidad. Las muestras con menor RIN para cada uno de los grupos marco temporal también tuvieron la mala calidad del ADN. la calidad del ADN observada parece ser similar en todos los rangos de tiempo de isquemia ex-vivo.
E. El injerto PDX
Sesenta y tres tumores primarios (41 adenocarcinomas, 18 de carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes 3 y 1 carcinoma sarcomatoide) fueron implantados, con una tasa global total del injerto del 33% (21/63).
Los tumores con dimensiones más grandes (& gt; 3 cm; 23/25 vs 16/38, P & lt; 0,001) y una etapa patológica más alta (III-IV; 15/25 vs 13/38, P = 0,048) fueron más frecuentemente implantado. El carcinoma de células escamosas (12/25 vs 6/38, p = 0,017) y el tumor con márgenes de resección participación (R1-R2; 4/25 frente a 1/38; p = 0,064) también implantada con más frecuencia. Entre adenocarcinoma, histología sólido se asocia con éxito del injerto (6/11 vs. 7/27, P = 0,09). A la inversa, la alta clasificación de tumor (G3; 12/25 vs. 15/38), TIL positivo (16/17 vs 30/34) y la presencia de invasión microvascular (4/23 vs. 13/38) tenía una frecuencia similar en la injertadas y no injertadas grupos.
multivariante modelo ajustado demostró la correlación entre ambas isquemia prolongada ex-vivo (isquemia fría durante más de 10 horas), tiempo quirúrgico prolongado (isquemia caliente más de 2 horas) con un injerto menor tasa (P = 0,047 y P = 0,008, respectivamente, Tabla 3)
análisis de regresión logística
multivariante en 63 casos de NSCLC
por el contrario, la histología de células escamosas (OR 8,55;.. P = 0,01 M) y estadio tumoral alto se asociaron con el éxito del injerto (OR 8,06; p = 0,053)
además, investigó muestras congeladas de tumores PDX proporción de injertos.. De las 21 líneas PDX generados, elegimos 8 tumores y se implantó las muestras congeladas primarias correspondientes cosechadas en el momento de la cirugía. Cuatro de las ocho muestras (50%) crecieron de manera eficiente, generando una línea PDX comparable con el recién derivada.
Discusión
El objetivo de nuestro estudio fue evaluar la calidad general de los tejidos especímenes de cáncer de pulmón almacenan en nuestra bio-repositorio. También tuvo como objetivo delinear la influencia del tiempo de isquemia en muestras de cáncer de pulmón y cómo la isquemia podría influir en los análisis de alto rendimiento molecular y la realización de modelos preclínicos in vivo.
Los resultados de nuestro estudio sugieren que (1) el valor de RIN es significativamente influenciado por el tiempo de isquemia ex vivo, la clasificación del tumor y el estadio pTNM; (2) derivados del paciente xenoinjertos injerto-tasa de éxito también se asocia con un bajo ex-vivo-tiempo de isquemia, bajo duración quirúrgico (tiempo de isquemia caliente) y la histología de células escamosas; (3) los niveles de ARNm de limpieza genes de expresión y de alto peso molecular (HMW) la integridad del ADN genómico están relacionados con RIN puntuación y puede utilizarse como marcadores biológicos reproducibles para la conservación de tejidos.
Mediante la implementación de procedimientos normalizados de trabajo (PNT) hemos sido capaces de criopreservar 135 especímenes de cáncer de pulmón primarios con el objetivo de generar un gran depósito biológico de alta calidad, y sin comprometer el diagnóstico histopatológico. Cada paso en este proceso es fundamental: esta arrojar luz sobre el papel que se juega por un equipo organizado y una evaluación correcta clasificación de la muestra en la Sala de Patología. El sistema VPAC, ya probado para preservar la integridad de las muestras, fue adoptado como procedimiento estándar de oro para obtener tejidos viables [6-8]. Sin embargo, mientras que en el cáncer de mama tejidos ARN, ADN y las proteínas se puede conservar de forma óptima para & gt; 24 [7, 13], que aquí mostramos que los tejidos del pulmón son mucho más sensibles a este tiempo. . Esto puede sugerir que la isquemia ex vivo puede influir en la viabilidad celular y molecular resultados en función del origen de los tejidos
Hay una aceptación general sobre la importancia del uso de ARN intacto en el análisis de la expresión génica y de RIN & gt; 7 se considera aceptable como valor de corte para las muestras de idoneidad [14,15]. En nuestro repositorio, el 51% de las muestras demostró RIN & gt; 7, con una tendencia favorable en los últimos años. Este resultado se encuentra entre los reportados para el cáncer de próstata (60 a 81% [16]), cáncer de colon (80% [17]) y los descritos en el cáncer de páncreas (40% [14]). Las posibles explicaciones para estas diferencias podrían deberse a la heterogeneidad del contenido celular, la degradación diferente de diferentes tejidos, la variabilidad entre operadores, etc. A pesar de que varios factores podrían afectar aumentada degradación del ARN, la suposición de que ex-vivo de isquemia-tiempo está estrictamente conectado con el grado de la degradación del ARN parece ser razonable. Aquí, se observó una disminución en la calidad del ARN a partir de 3 horas después de la resección quirúrgica. Este resultado está en línea con un informe anterior sobre la degradación de golf en el tejido pulmonar: los autores han encontrado disminución de la estabilidad de ácidos nucleicos a partir de 5 horas después de la cirugía [18]. Del mismo modo, el tiempo de isquemia ex-vivo limitado parecía correlacionarse con la integridad óptima de ARN en cáncer de colon (6-16 horas) [17], cáncer de mama (3 horas) [19], cáncer de próstata (2 horas) [16, 20] y en tejido de cáncer de páncreas. largo tiempo quirúrgico no afectó la integridad del ARN, como sería el caso si la isquemia tisular era la única explicación de la disminución RIN. Por otra parte, los niveles de mRNA de expresión y de HMW integridad del ADN genómico parecen estar asociadas con la puntuación parcial RIN, pero mostraron una reducción de la calidad menor cuando se correlacionó con ex-vivo el tiempo de isquemia. Esto puede rescatar a una gran fracción de la 49% de las muestras con menor RIN (& lt; 7%), ya que se pueden utilizar para técnicas moleculares clásicos. En nuestro estudio, las etapas de alta pTNM también se asociaron con una puntuación RIN reducida. Una posible explicación podría ser la manipulación quirúrgica y la posterior liberación de RNasa como forma postulado Bertilsson y Harveer respecto cáncer de próstata [20].
xenopatients derivados de los pacientes son considerados, en la actualidad, los modelos de ratón pre-clínicos de gran fiabilidad. El establecimiento de esta herramienta requiere instalaciones de investigación sofisticadas y presenta desafíos técnicos y logísticos, y se ha evaluado recientemente como una fuente fundamental de información y material biológico terapéuticamente relevantes [21, 22]. El uso de muestras de tumores primarios frescos y congelados derivados de un
Biobanco
recursos demostró la viabilidad de este enfoque, sobre todo cuando los diferentes esfuerzos se ponen juntos en una red bien integrada. Nuestro grupo se aprovecha de la implantación directa en ratones, por vía subcutánea, de fragmentos de tejidos frescos o congelados derivados de pacientes resecado quirúrgicamente. La tasa de injerto de 33%, incluso sustancialmente comparable con las ya atestiguada (25% -35%) por otros grupos en un entorno subcutáneo [23-25], resultó ligeramente menor de lo esperado teniendo en cuenta la mayor propensión de modelo NSG para el injerto. Sin embargo se observó un porcentaje bastante alto (29%) de adenocarcinomas injertadas que por lo general como resultado menos propensos a la implantación en comparación con los tumores de células escamosas. La isquemia tiempo influyen en la tasa de injerto demostró que un período prolongado quirúrgica (caliente) la isquemia se asocia negativamente con el éxito del injerto [25] en lugar de tiempo total (caliente y frío). Otras características influir en la tasa de injerto: dimensión tumor (& gt; 3 cm), el estadio patológico (III-IV) y la histología de células escamosas tienen un impacto sobre la tasa de injerto, lo que sugiere que las propiedades biológicas también intrínsecas del tumor juegan un papel en la determinación de la PDX éxito Generacion. Lo mismo es válido para la generación de PDX a partir de muestras congeladas de tumores. La capacidad de volver a generar el 50% de la línea PDX a partir de materiales crioconservados sugiere que los diferentes elementos pueden influir en la biología del tejido; Sin embargo destacar la posibilidad de volver a posteriori en el biobanco de tejidos y recoger los tumores-moleculares específicos definidos con el fin de generar la línea PDX apropiado útil para
ad hoc
exámenes preclínicos.
Hasta la fecha, ningún estudio se han llevado a cabo la comparación de diferentes métodos de tejido preservación. Sin embargo, teniendo en cuenta su capacidad de preservar la morfología celular, la integridad y la estabilidad epítopo ácidos nucleicos, se utilizó el sistema de VPAC para almacenamiento de tejidos, especulando una influencia positiva sobre la tasa de injerto también PDX.
En conjunto estos datos indican que la generación biorepositorio de un cáncer de pulmón es un enfoque viable y requiere esfuerzos de red complejos que incluyen diferentes competencias bio-médica. Por lo tanto, los protocolos bien diseñados son fundamentales para el correcto y eficiente
Biobancos
. Patólogos, oncólogos, cirujanos torácicos, enfermeras, biólogos, técnicos, epidemiólogos y estadísticos médicos deben colaborar en un flujo de trabajo operativo común para garantizar no sólo muestras de alta calidad, sino también protocolo de tratamiento adecuado, correcto almacenamiento, recogida de datos, análisis epidemiológicos en proyectos coordinados de manera eficiente .
Nuestro enfoque proporciona la biorepositorio de una preciosa colección de muestras para la investigación de amplio alcance sobre el NSCLC. En particular, el ARN de alta calidad y de ADN se pueden utilizar para las técnicas de secuenciación de próxima generación, como RNAseq, Whole Exoma Secuenciación y Whole Genome Sequencing, sino también los ácidos nucleicos con menor calidad pueden ser rescatados para las técnicas de expresión de genes normales (es decir cuantitativa transcriptasa inversa reacciones en cadena de polimerasa). Por último, la disponibilidad de muestras de tumores frescos y congelados representan un valioso recurso con el fin de generar los xenoinjertos-derivados de los pacientes líneas (PDX) [26].
Conclusión
La estratificación molecular de NSCLC en el época reciente de la "medicina de precisión" ha puesto de relieve la importancia de mantener la serie de muestras de alta calidad integrados con los datos clínico-patológicos. Estos depósitos pueden ser investigadas por Next-Generation Sequencing y son obligatorios para la generación de modelos preclínicos estables.
A continuación se presenta un método reproducible y fiable para generar un banco de tejidos para el NSCLC, y nos proporcionan la prueba de el valor crítico de la calidad de las muestras 'para estudios posteriores. De hecho, la calidad del ARN y la proporción de injertos PDX se vieron afectados negativamente por el tiempo de isquemia prolongada, y por lo tanto, una correcta, el control y la recogida de tejidos bien orquestada podrían reducir la tasa de fracaso.
En general, los bancos biológicos CPNM representa una modalidad innovadora que permite ser ejecutado con éxito en un entorno clínico de rutina dentro de todas las instituciones, sino que requiere validado procedimientos operativos estándar.