Extracto
Hemos descrito previamente una novela de suicidio (o "control del destino celular ') terapia génica sistema de enzima /profármaco basado en una variante modificada de la timidilato quinasa humana (TMPK) que potencia la activación azidotimidina (AZT). La entrega de una secuencia de gen suicida en tumores mediante transducción lentiviral encarna una terapia génica del cáncer que podría emplear muerte celular espectadora como un mecanismo de accionamiento de regresión significativa del tumor
in vivo
. Aquí presentamos evidencia de un celular espectadora significativa matando
e in vitro
in vivo
mediada por el eje gen suicida TMPK /AZT que depende de la formación de las comunicaciones intercelulares gap-funcionales de unión ( GJICs). Potenciación de la activación por el AZT TMPK ingeniería expresa en la línea celular de cáncer de próstata humano, PC-3, resultó en homicidio transeúnte efectiva de PC-3 células que carecen de expresión TMPK - un efecto que podría ser bloqueado por el inhibidor de la GJIC, carbenoxolona. Aunque GJICs están formados principalmente por conexinas, una nueva familia de moléculas GJIC pannexins designados Recientemente se ha identificado. las células PC-3 expresan tanto connexin43 (Cx43) y Pannexin1 (Panx1), pero la expresión Panx1 predominaban en la membrana plasmática, mientras que la expresión de Cx43 fue localizada principalmente en el citosol. La contribución de los efectos espectador a la reducción de xenoinjertos de tumores sólidos establecidos por la línea celular PC-3 se evaluó en un modelo animal. Se demuestra la contribución de muerte celular espectadora a la regresión del tumor en un modelo de xenoinjerto de depender de la entrega de la expresión del gen suicida TMPK en tumores a través de inyección intratumoral directa de lentivirus terapéutico recombinante. Tomados en conjunto, nuestros datos ponen de relieve que el eje de la enzima-profármaco TMPK /AZT pueden utilizarse eficazmente en terapia génica suicida de tumores sólidos, en el que la regresión significativa del tumor se puede lograr a través de espectador efectos mediados por GJICs
Visto:. Sato T, Neschadim a, Lavie a, Yanagisawa T, Medin JA (2013) La Engineered timidilato quinasa (TMPK) /AZT Enzima profármaco-Axis ofrece celular espectadora eficiente Matar por suicidio Terapia génica de cáncer. PLoS ONE 8 (10): e78711. doi: 10.1371 /journal.pone.0078711
Editor: José Najbauer, Universidad de la Escuela Médica de Pécs, Hungría
Recibido: 3 Junio, 2013; Aceptado: September 16, 2013; Publicado: 23 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Sato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado en parte por la subvención-en ayuda para la Investigación Científica (C) (20590533) en el TS de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) y por la beca de investigación de la Fundación Saito Gratitud a T.S .. A. N. fue financiado por los Institutos Canadienses de Programa de Formación en Medicina Regenerativa Investigación en Salud (CIHR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la terapia génica se aproxima a la utilización de vectores oncoretroviral o lentivirus recombinantes para administrar genes que potencian diversas terapias farmacológicas directamente en los tumores sólidos prometedores en el tratamiento de tumores malignos sólidos que son difíciles de extirpar quirúrgicamente, tales como cánceres que afectan el cerebro [1]. Suicide la terapia génica del cáncer (SGTC), también conocida como terapia enzima profármaco dirigida gen (GDEPT), típicamente se basa en el suministro intratumoral de genes suicidas que facilitan la activación selectiva y localizada de profármacos específicos en sus derivados efectoras citotóxicas. Transcriptional- y la orientación basada en pseudotipo de viriones a las células cancerosas se extienden aún más las aplicaciones potenciales para incluir lesiones metastásicas y expandir el método de entrega a la administración sistémica [2,3]. Los retos significativos asociados con la entrega de la gen suicida en todas y cada célula maligna a menudo son superados por confiar en homicidio celular espectadora, o efectos espectador, que crean una zona de muerte localizada alrededor de las células tumorales transducidas con éxito que expresan funcionalmente el gen suicida, por lo tanto mejorar la eficacia global SGTC [4].
Varios genes suicidas se han caracterizado y evaluado hasta ahora con respecto a su utilidad para SGTC. Entre ellos, derivados de virus herpes simplex timidina quinasa (HSV-tk) es uno de los genes suicidas más estudiadas para SGTC [5]. HSV-tk y diversos mutantes mejorados catalíticamente de esta enzima han sido ampliamente utilizado como un gen suicida en combinación con el análogo de guanosina, ganciclovir (GCV), para el tratamiento de diversos tipos de cáncer [1,6]. HSV-tk convierte el no tóxico GCV en GCV-monofosfato (GCV-MP), que está más fosforilada por quinasas celulares para producir el metabolito tóxico, GCV-trifosfato (GCV-TP), que inhibe la replicación del ADN de la célula huésped que resulta en la inducción de la apoptosis [7]. espectador efectos han sido bien caracterizado en el sistema de terapia de gen suicida HSV-tk /GCV, y se cree que implican la difusión de GCV activado, ya sea mono- o formas múltiplemente fosforilado, de HSV-tk-expresión de células a través de células espectadoras comunicaciones intercelulares Gap-unión (GJICs) que conectan el citosol de las células adyacentes en muchos tumores sólidos y permitir el intercambio de metabolitos de bajo peso molecular por difusión [8]. Un número de factores limitan la eficacia general de HSV-tk para su uso en SGTC incluyendo: pobre activación de GCV por HSV-tk en su forma citotóxica, asociado principalmente con la etapa limitante de la velocidad en la activación de GCV ser fosforilación de GCV-MP en GCV -DP por la guanilato celular quinasa (GMPK) [9]; citotoxicidad limitada de GCV, en particular contra tumores de crecimiento lento, debido a su mecanismo de acción limitado que se basa únicamente en la replicación del ADN [10]; y, finalmente, la pobre lipofilia de GCV que resulta en efectos espectador reducidas y una pobre capacidad de cruzar la barrera sangre-cerebro lo que limita la aplicabilidad en el cerebro orientada SGTC [11]. Tomados en conjunto, SGTC aproximaciones utilizando el eje de HSV-TK /GCV son, por tanto limitada por la citotoxicidad y problemas con la dosificación efectiva con GCV, que puede tener para ser utilizado en concentraciones que son sistémicamente mielosupresora para lograr la ablación del tumor significativa limitado.
Hemos descrito previamente alternativas de profármaco de enzima para el suicidio (o "control celular destino"), la terapia génica [12,13], uno de los cuales utiliza una variante mejorada catalíticamente de la timidilato quinasa humana (TMPK-F105Y) que se ha habilitado para potenciar la rápida activación de la azidotimidina profármaco (AZT) [12]. Catalíticamente, de tipo salvaje TMPK es relativamente lenta en la fosforilación de AZT monofosfato, que es la etapa de cuello de botella en su ruta de activación en células de mamífero. La mutación F105Y, adoptada basa en la comparación de una región homóloga de la secuencia de la levadura TMPK, da como resultado una enzima variante que es mucho más robusto en la fosforilación de AZT monofosfato y menos activo en su sustrato natural, la timidilato monofosfato [14]. Este nuevo eje terapia génica suicida utiliza una enzima de origen humano con un potencial mínimo para causar respuestas inmunes adversas dirigidos contra el transgén, como se observa con los enfoques basados en HSV-tk. También utiliza una enzima que es catalíticamente robusto y actúa en la etapa limitante de la velocidad de la activación de AZT. Además, se utiliza un profármaco cuya forma citotóxica puede apuntar de manera eficiente tanto de división y las células que no se dividen debido a dos mecanismos de citotoxicidad distintas [12]. Por último, se utiliza un profármaco que tiene mejor perfil de lipofilia y es probable más adecuado para uso en SGTC. Específicamente, AZT se estima que es al menos 30 veces más lipófilo que GCV [11], que predice mejor difusión pasiva y el aumento de la idoneidad del profármaco AZT para la terapia génica suicida de tumores sólidos, así como una mejor prestación del profármaco a la cerebro, por ejemplo. Debido a estas características superiores del suicidio eje terapia génica TMPK /AZT, nos propusimos evaluar la idoneidad de este sistema y la magnitud de los efectos espectador que engendraría en SGTC.
En este estudio, se presenta que la expresión sostenida de la, variante catalíticamente mejorado AZT-activo TMPK, TMPK-F105Y, en la línea celular de cáncer de carcinoma de próstata humano, PC-3, por transducción con construcciones lentivirales sensibiliza fácilmente estas células al tratamiento con AZT y facilita la muerte celular a través de mejora efectos espectador tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
. Se demuestra que el efecto espectador matar, observado después del tratamiento AZT, depende en gran medida de la existencia de GJICs funcionales y se suprime por tratamiento con un inhibidor de la brecha de la salida. Además, se muestra la Pannexin1, y no connexin43, probablemente forman las uniones gap funcionales entre las células PC-3. Estos resultados ponen de manifiesto la utilidad de SGTC lentivirus mediada basado en el sistema modificado-TMPK /AZT y justifican su evaluación más
in vivo en modelos
específicos de cáncer.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
procedimientos experimentales en animales siguieron un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network (Toronto, ON, Canadá). Los animales se mantuvieron en el Centro de Recursos de animales en el Hospital Princess Margaret (Toronto, ON, Canadá).
Cultivo de células
línea celular
adenocarcinoma prostático humano PC-3 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640 medio (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching , Austria), 100 unidades /ml de penicilina (Nakalai Tesque, Inc., Kyoto, Japón), 100 g /ml de estreptomicina (Nakalai Tesque, Inc.), y 250 ng /ml de anfotericina B (Nakalai Tesque, Inc. ) en un 37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera a una humedad constante. La línea celular de riñón embrionario humano derivado 293T se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.) y se mantiene en de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), complementado con 10% de FBS , 100 unidades /ml de penicilina, 100 g /ml de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
Producción de LV /TMPK recombinante y la transducción de las células PC-3
El procedimiento para la producción de virus de la estomatitis vesicular-glicoproteína (VSV-G) -pseudotyped lentivirus recombinante, se informó anteriormente por nuestra grupo [12], se usó con modificaciones menores. Brevemente, la transfección de tres plásmidos (plásmido pHR 'de transferencia genética, el plásmido de empaquetamiento pCMVR8.91, y el virus de la estomatitis vesicular glicoproteína de la envuelta de codificación de plásmido pMD.G) en células 293T se realizó utilizando una polietilenimina (PEI) -Procedimiento [15 ] y los sobrenadantes de virus se recogieron a las 48 horas después de la transfección, se filtraron usando un filtro de 0,45 micras, y se concentraron a 50.000 × g durante 2 horas. las células PC-3 se infectaron con las reservas de virus concentrado en presencia de 8 g /ml de sulfato de protamina. Las células infectadas fueron luego de una sola célula clonado por dilución limitante. La expresión del transgen en las células PC-3 transducidas se confirmó mediante análisis de transferencia de Western usando conejo TMPK anti-humano (amablemente proporcionado por el Dr. Manfred Konrad, Instituto Max Planck de Química Biofísica, Göttingen, Alemania). Para este análisis, los lisados de células totales se resolvieron por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de filtro de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). La membrana fue bloqueada con 0,5% libre de grasa de leche desnatada en 20 mM solución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween-20, pH 7,4 (TBS-T, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La membrana se sondó con el TMPK anti-humano de conejo (diluido 1: 5000), y luego con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiada (diluido 1: 5000, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.). La igualdad de carga de proteínas se confirmó con un anticuerpo murino anti-GAPDH (diluido 1: 5.000, Ambion Austin, TX, EE.UU.).. Membranas, siguiendo el desarrollo con el sustrato quimioluminiscente de HRP occidental Immobilon (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), se obtuvieron imágenes utilizando el sistema de LAS-1000 (Fuji Film Corp., Tokio, Japón)-cámara del dispositivo de acoplamiento de carga. La expresión de la proteína verde fluorescente (EGFP) en los clones de una sola célula transducidas se confirmó por la detección de citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).
ensayo de transferencia de tintes mediante citometría de flujo y la observación microscópica confocal
Para el etiquetado de calceína, las células cultivadas a semi-confluencia se lavaron dos veces con PBS (sin calcio y magnesio), y después se tiñeron durante 15 minutos con 20 M de metilo calceína-acetoxi (calceína-AM; Doujin Chemical Co., Kumamoto, Japón) disuelto en PBS (sin calcio y magnesio). Después de la tinción con calceína, las células se lavaron con RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. Para PKH26-etiquetado, las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en diluyente de C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) a una densidad de 10
7 células /ml y se tiñeron con 20 mM PKH26 (Sigma-Aldrich ) disuelto en Diluyente C durante 5 min. Las células fueron lavadas 3 veces con RPMI-1640 que contiene 10% de FBS. Tanto la calceína-etiquetados y células marcadas con PKH26 se mezclaron y se co-cultivaron en placas de 6 pocillos (Corning Incorporated, Corning, Nueva York, EE.UU.) durante 3 días. la transferencia de colorantes se analizó por citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences) mediante la medición de la fluorescencia de calceína a 514 nm y detecta PKH26 detecta en 567nm. En un ensayo separado, 100 carbenoxolona mu M (CBX; Sigma-Aldrich) se añadió a los cultivos celulares para examinar su capacidad para bloquear la transferencia de colorantes. Además, para detectar las moléculas que participan en la formación de brecha de la salida, la inmunotinción de las células PC-3 se llevó a cabo. En pocas palabras, células PC-3, se adhirieron a Lab-TekII cámara de diapositivas (Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL, EE.UU.), se fijaron con 4% (w /v) de formalina tamponada (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4, y se permeabilizaron con 0,1% (v /v) Triton X-100 durante 15 min. Las células se bloquearon entonces con suero de cabra normal al 5%, y se hicieron reaccionar secuencialmente con una solución de anticuerpo primario (1: 100 dilución en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA)) a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación en PBS que contenía el secundario anticuerpo (dilución 1: 500 en PBS que contenía 1% de BSA) marcado con Alexa488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregón, EE.UU.) y de contraste con rodamina faloidina (Cytskelton, Inc., Denver, CO, EE.UU.) durante 3 horas en la sala temperatura. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron los siguientes: anticuerpo de conejo anti-connexin43 (Signalway de anticuerpos, College Park, MA, EE.UU.), anticuerpo de conejo anti-pannexin1 (Merck Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.), y marcado con Alexa488 cabra anti -rabbit anticuerpo IgG (Molecular Probes, Inc.). Las señales de fluorescencia fueron analizados utilizando un microscopio confocal de escaneo láser LSM-5 y la versión del sistema LSM 3,98 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) al Núcleo de Investigación Biomédica de la Escuela de Graduados de la Universidad de Tohoku,.
Ensayos de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning Incorporated) a 5 x 10
5 células /pocillo en 200 l de medio RPMI-1640 suplementado, como se describe anteriormente, y se incubaron con concentraciones crecientes de AZT (0, 0,1, 1, 10, 100 mM, y 1 mM; Sigma-Aldrich). El medio se actualiza a diario. Después de 4 días de cultivo, la viabilidad celular se determinó usando el Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.). Para la determinación de la proporción óptima de células para los experimentos posteriores espectador, tanto las células eGFP-expresan y las células transducidas con TMPK-F105Y se sembraron en placas de 96 pocillos a diferentes proporciones, y se cultivaron en presencia de 10 mM AZT durante 5 días. La viabilidad celular se determinó como anteriormente usando el Cell Counting Kit-8 (Doujin Chemical Co.).
Evaluación de apoptosis
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning Incorporated) a 10
6 células /pocillo en 5 ml de medio de cultivo celular (RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, antibióticos y antimicóticos, como se describió anteriormente), con o sin 10 mM AZT. Después de 4 días de cultivo, la tinción de anexina V se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Anexina V-APC; BD Pharmingen, San Diego, CA). Para confirmar el requisito de GJICs para matar espectador inducido por AZT, 100 carbenoxolona mu M (CBX; Sigma-Aldrich) se añadió simultáneamente con AZT al cultivo. índices de apoptosis relativos se calcularon las relaciones normalizadas como de la apoptosis en el AZT-tratados con las células no tratadas con AZT. Para examinar la contribución de los factores solubles secretadas por las células tratadas con AZT, PC-3 células de tipo salvaje se cultivaron durante 5 días en el medio condicionado recogido de tipo salvaje TMPK o TMPK-F105Y que expresan las células que fueron tratadas con 10 mM AZT durante 5 días, seguido de evaluación de la inducción de apoptosis en estas células como anteriormente.
especies reactivas de oxígeno (ROS) de ensayo
generación de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ROS) se controló mediante el dihydroethidium ( DHE) procedimiento [16]. En pocas palabras, después de que los puntos de tiempo de tratamiento indicados, las células se incubaron adicionalmente con DHE (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. la intensidad de emisión de fluorescencia a 525 nm (tras excitación a 488 nm) se midió por un citómetro de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences). El cambio en la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las muestras medidas a partir de cada grupo de tratamiento se expresó como un porcentaje de DHE fluorescencia de las células control no tratadas.
Evaluación del efecto espectador in vivo después de una inyección intratumoral de LV /TMPK
diabéticos no obesos /inmunodeficiencia combinada severa (NOD /SCID) (5-8 semanas de edad, comprados a Laboratorios Jackson, Bar Harbor, ME) se mantuvieron en el Centro de recursos de animales en el hospital Princess Margaret (Toronto , ON, Canadá). Los animales fueron inyectados en el día 0 en su derecho dorsal flanco con 4x10
6 LV /eGFP transduced células PC-3, suspendidas en 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aproximadamente 10 l de un /TMPK-F105Y LV (1.5x10
8 UI /ml) se inyectó por vía intratumoral preparación en día 11. Los animales en los grupos tratados con fármaco recibieron una dosis de 50 mg /kg /día de AZT por vía intraperitoneal durante 6 días a partir de día 12. Los grupos experimentales fueron los siguientes: PC-3-TMPK-F105Y tratado con AZT y PC-3-TMPK-F105Y tratados con vehículo (PBS). Los animales fueron sacrificados en el día 18; Los tumores se recogieron y se pesaron
Estadísticas
La significación estadística entre los grupos se evaluó mediante ANOVA de una vía análisis con la prueba de Bonferroni post hoc utilizando GraphPad INSTAT (ver 3.0a para Macintosh..; GraphPad Software, San Diego, CA).
resultados
células PC-3 expresan GJICs funcionales compuestos por pannexin1
brecha ocasiones comunicaciones intracelulares (GJICs), además de jugar un papel directo en la progresión tumoral [17], se considera que es importante para el efecto destructor de células transeúnte en aplicaciones SGTC [18]. GJICs típicamente se componen de proteínas de la familia connexin, y, como recientemente se demostró, a partir de proteínas de la familia pannexin así como [19]. GJICs permiten la difusión pasiva de pequeñas moléculas (≤1 kDa en tamaño) entre las células adyacentes, conectadas. Las expresiones de las proteínas clave, GJIC connexin43 y pannexin1, fueron confirmados en PC-3 células por Western blot (Figura 1A); expresiones de tipo salvaje y TMPK TMPK-F105Y también se confirmaron de forma análoga (Figura 1B). Los patrones de distribución de connexin43 y pannexin1, como se determina por análisis de microscopía de inmunofluorescencia confocal, revelaron sin embargo que connexin43 células PC-3 predominantemente expresa en compartimentos citoplasma perinuclear (Figura 1C, panel izquierdo), mientras que pannexin1 fue localizada principalmente en la membrana plasmática, observado como manchas y rayas que son el sello de la pauta apariencia GJIC (Figura 1C, panel derecho). Este hallazgo sugiere que pannexin1 puede predominar sobre connexin43 en la formación de GJICs funcionales en esta línea celular de cáncer de próstata.
(A) Expresión de GJIC componentes, connexin43 y pannexin1, fue confirmada por Western blot de lisados de células enteras de no transducidas, /transducidas TMPK-LV y LV /eGFP transduced células PC-3. expresión de GAPDH se evaluó como un control de carga igual. (B) Expresión de TMPK se confirmó por Western blot en lisados de células enteras de no transducidas, LV /TMPK transducidas con, y LV /TMPK-F105Y-transduced células PC-3. expresión de GAPDH se evaluó como un control de carga igual. (C) Patrón de expresión de la conexina 43 (panel izquierdo) y pannexin1 (panel derecho) GJIC componentes (fluorescencia verde) se evaluó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Citoesqueleto (actina F) se visualizó con rodamina faloidina tinción (fluorescencia roja). (D) Transferencia de tinte de calceína en las células PKH26 marcado adyacentes se midió por citometría de flujo en co-cultivos directos (normal) o Transwell de células PC-3 como porcentaje de células doble positivas para calceína y fluorescencia PKH26 (n = 3) . (E) Transferencia de tinte de calceína en las células PKH26 marcado adyacentes se inhibió significativamente por la carbenoxolona (CBX) (n = 3). La significación estadística se indica (p & lt; 0,0001).
A continuación examinó la formación de GJICs funcionales en las células PC-3 en un experimento de transferencia de colorante. Dos poblaciones de células, por separado y de forma estable marcadas con uno de los dos colorantes diferentes (calceína, que es permeable no membrana y está atrapado en el citosol de la célula, y PKH26, que las etiquetas específicamente las membranas celulares) exhibieron la transferencia de colorante en 2-día largo co- culturas, como se demuestra por la aparición de células doblemente marcada (Figura 1D). Esta transferencia de colorante calceína a las células marcadas con PKH26 se requieren contacto directo célula-célula, como la transferencia de tinte no fue aparente en las células marcadas diferencialmente que se cultivaron en un sistema transwell (Figura 1D). Además, la transferencia de colorantes se inhibió en presencia de un inhibidor específico brecha de la salida, la carbenoxolona (CBX) (Figura 1E). Tomados en conjunto, los datos sugieren que la transferencia de colorante calceína en las células marcadas con PKH26 necesario el contacto directo célula-célula, y fue probablemente facilitada por GJICs funcionales.
Evaluación de la muerte celular mediada por el AZT de LV /TMPK transducidas efectos células PC-3 y espectadoras
PC-3 células fueron transducidas con vectores lentivirales expresión de la ingeniería, ya sea de tipo salvaje o TMPK TMPK-F105Y. TMPK y TMPK-F105Y expresión se confirmó mediante análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo TMPK de conejo anti-humano en clones de células individuales aislados por dilución limitante (Figura 1B). Mientras que la expresión endógena TMPK fue detectable en las células no transducidas (NT), se observó una sobreexpresión significativa de TMPK en las células transducidas. Dependiente de la dosis la sensibilidad de clones AZT PC-3 celulares que expresan de tipo salvaje TMPK, que son incapaces de activar AZT significativamente, o el AZT-activo mutante TMPK-F105Y, se evaluó en cultivo celular. las células PC que expresan el mutante TMPK-F105Y eran altamente sensibles al tratamiento con concentraciones crecientes de AZT (IC50 de 1,8 M) en comparación con células no transducidas o las células que sobreexpresan de tipo salvaje TMPK (IC50 de & gt; 1 mM y & gt; 0,1 mM , respectivamente) (Figura 2A). Sobre la base de la relación dosis-respuestas determinados, una dosis de 10 M de AZT fue seleccionado para los experimentos posteriores como una dosis que era muy eficaz en las células-F105Y-expresión de TMPK pero no mostraron toxicidad detectable en las células no transducidas o las células que sobreexpresan de tipo salvaje TMPK.
(A) dependiente de la dosis la muerte celular de las células transducidas-LV PC-3 se incubaron con concentraciones crecientes de AZT (media +/- SEM, n = 3). (B) La inducción de la apoptosis por 10 M AZT se evaluó por la anexina V tinción de las células TMPK-F105Y tratados. la muerte de células (C) Bystander se evaluó mediante la evaluación relativa de V tinción de anexina en AZT-tratada para espectador sin tratar eGFP-expresión de PC-3 células por citometría de flujo en directo (normal) y transwell co-cultivos de eGFP-transducidas con TMPK-WT - o TMPK-F105 transducidas células PC-3 (n = 3). La significación estadística se indica (p & lt; 0,0001). (D) Determinación de la proporción óptima de células eGFP-expresión a las células para evaluar espectador matando a efectos de 10 M AZT (media +/- SEM, n = 4 TMPKF105Y-expresión; * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 ). (E) La inducción de la apoptosis en las de tipo salvaje las células PC-3 por medios condicionados a partir de tratado con AZT de tipo salvaje TMPK-transduced y TMPK-F105Y transducidas con células PC-3 normalizada a la apoptosis en las células tratadas con medio condicionado de AZT-sin tratar células (n = 3).
Para confirmar aún más la inducción específica de la apoptosis en células que expresan-F105Y TMPK tras la incubación con 10 mM AZT, se evaluó la exposición de un marcador de apoptosis, la fosfatidilserina (PS ), en la superficie celular de las células tratadas por tinción con la proteína APC conjugado con anexina V. células TMPK-F105Y transducidas cultivadas en presencia de 10 mM AZT, pero no otros grupos de células de control, mostraron una inducción significativa de la apoptosis como se muestra por un aumento de más de 3 veces en el índice apoptótico de estas células (Figura 2B).
para evaluar la muerte celular espectadora mediada por la activación derivada de TMPK-F105Y de AZT en células PC-3, TMPK transducidas y las células de control no transducidas fueron directamente co-cultivadas con células PC-3 independientes diseñados para de forma estable expresar la proteína verde fluorescente (eGFP). Los co-cultivos tratados con AZT fueron evaluados por la anexina V (y 7-AAD) tinción para la inducción de la apoptosis en la población de células PC-3-eGFP positivo. Como se muestra en la Figura 2C (barras blancas), células espectadoras solamente eGFP-positivos co-cultivadas con células que expresan el AZT-activo TMPK-F105Y y no la de tipo salvaje TMPK demostró un aumento significativo en el índice apoptótico tras el tratamiento AZT. TMPK-expresión de las células efectoras y eGFP-expresión de células espectadoras necesarios el contacto directo célula-célula, ya que no se observó aumento en el índice apoptótico de las células espectadoras cuando las poblaciones de células fueron separados por un sistema transwell (Figura 2C, barras sombreadas). El espectador matar efecto en co-cultivos con una relación 1: 4 de las células eGFP-expresan (20%) a las células-F105Y-expresión de TMPK (80%) fue muy significativa que conduce a una disminución general de 80% en la supervivencia celular en el co -cultures siguientes 5 días de tratamiento con AZT (Figura 2D), lo que sugiere que un potente efecto transeúnte matando pudo observar. Para confirmar aún más que el efecto espectador observado no fue mediada por factores solubles secretadas a partir de TMPK-F105Y células que expresan, tratados con AZT, cultivamos no transducidas células PC-3 en los medios condicionados recogidos de tipo salvaje TMPK o TMPK-F105Y expresando las células tratadas con 10 mM AZT durante 5 días. Bajo estas condiciones de cultivo, las células PC-3 no transducidas no mostraron significativa de muerte celular (Figura 2E). Tomados en conjunto, estos datos indican que el efecto espectador observado matando está mediada por la transferencia de metabolitos citotóxicos del AZT mediante un mecanismo que requiere el contacto directo de célula a célula.
El papel de GJICs en la mediación del efecto espectador en PC-3 células
Para profundizar en los mecanismos del efecto espectador observado en las células PC-3 facilitadas por el sistema de suicidio TMPK-F105Y /AZT, se evaluó la matanza celular espectadora observada en la población eGFP-positivo directamente co-cultivadas con células TMPK-F105Y expresan tratados con 10 mM AZT en ausencia y en presencia de 100 mM de un inhibidor específico brecha de la salida, la carbenoxolona (CBX). La adición de CBX a la co-cultivo de matar completamente abolido celular espectadora (índice apoptótico de 1) (Figura 3A), lo que indica que el efecto espectador en nuestros PC-3 co-cultivos está mediada principalmente por GJICs funcionales.
(A) la eliminación de células espectador se evaluó mediante la evaluación relativa de la tinción de anexina V en transeúnte tratado con AZT eGFP-que expresan las células PC-3, co-cultivadas con células PC-3-tranduced TMPK-F105Y, por el flujo de citometría. Co-cultivos se dejaron sin tratar o tratadas con el inhibidor de la GJIC sartén, carbenoxolona (CBX) (n = 3). (B) veces el cambio en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) debido al tratamiento AZT se evaluó en de tipo salvaje TMPK-expresar y TMPK-F105Y-expresión de las células PC-3 (n = 3). (C) Doble cambio en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) debido al tratamiento AZT se evaluó en eGFP-expresión de las células PC-3, co-cultivadas con células tranduced-TMPK-F105Y PC-3, con y sin carbenoxolona (CBX ) de tratamiento (n = 3). La significación estadística se indica (p & lt; 0,0001).
Se determinó que la activación AZT en TMPK-F105Y-expresando células aumenta especies reactivas de oxígeno (ROS) (Figura 3B). Puesto que es bien sabido que la producción de ROS a menudo induce el daño celular que conduce a la muerte celular, se especuló que la producción de ROS podría contribuir a la muerte celular espectadora observado en este sistema. De hecho, hemos demostrado que el tratamiento CBX de nuestros co-cultivos que pueda interrumpir GJICs funcionales resultó en la reducción de ROS elaborado tras el tratamiento con AZT en la población celular espectadora (Figura 3C), lo que sugiere que la transferencia de metabolitos de AZT activados a espectador células induce la producción de ROS y potencialmente contribuye a la inducción de la apoptosis celular en estas células.
espectador efectos mediados por el AZT en Evaluación de modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humano in vivo
para evaluar la eficacia del transeúnte efectos inducidos en el sistema TMPK-F105Y /AZT suicidio
in vivo
y la idoneidad de este enfoque para SGTC, se empleó un modelo de xenoinjerto de ratón de PC-3. Desde pobres transducción de las células tumorales mediante vectores de ingeniería de la expresión de genes suicidas es una limitación general de los enfoques GDEPT, hemos tratado de examinar si el espectador efectos en el sistema suicidio TMPK /AZT son suficientemente robustos para compensar posiblemente por limitaciones en la eficiencia de transducción de tumor. Aquí NOD /SCID animales fueron inoculados por vía subcutánea con no transducidas PC 3-tumores, y después de 11 días de crecimiento del tumor, se inyectaron directamente los tumores palpables, intratumoral, con ~ 1.5x10
6 partículas virales infecciosas ingeniería de la expresión de la TMPK-F105Y gen suicida. A partir de las 24 horas después de la inyección de los viriones, los animales recibieron inyecciones diarias intraperitoneales de AZT (50 mg /kg /día) o un vehículo de control durante 6 días consecutivos. Los ratones fueron sacrificados al final del periodo de tratamiento, y los tejidos tumorales se recogieron y se pesaron.