Extracto
resistencia progestina es un obstáculo importante para el tratamiento de la fase inicial, bien diferenciado de cáncer de endometrio, así como cáncer de endometrio recurrente. El mecanismo detrás de la respuesta subóptima a progestina no se entiende bien. El
PTEN
gen supresor de tumores se muta con frecuencia en los cánceres de endometrio tipo I y esta mutación da lugar a la hiperactivación de la vía PI3K /AKT. La hipótesis de que el aumento de la activación de AKT promueve una respuesta inadecuada a las progestinas en las células de cáncer de endometrio. Ishikawa células transfectadas de forma estable con el receptor de progesterona B (células PRB23) fueron tratados con el inhibidor de AKT, MK-2206, que disminuyó con eficacia los niveles de p (Ser473) -AKT en una dosis-dependiente (10 nM a 1 uM) y dependiente del tiempo manera (0,5 h a 24 h). MK-2206 inhibió los niveles de p (Thr308) -AKT y una diana aguas abajo, p (Thr246) -PRAS40, pero no se puede modificar el nivel de p (Thr202 /Tyr204) ERK o p (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, lo que demuestra la especificidad de MK-2206 para AKT. Además, el tratamiento MK-2206 de células PRB23 resultó en un aumento significativo en los niveles de proteína del receptor de progesterona B (PRB). el análisis de microarrays de células PRB23 identificados PDK4 como el gen más altamente upregulated entre los 70 genes regulados positivamente en respuesta a R5020. La inhibición de AKT upregulated adicionalmente la expresión de progestina mediada de PDK4 pero no afectó a otro gen de progestina sensible, SGK1. El tratamiento de células PRB23 con R5020 y MK-2206 disminuyó independientemente viabilidad de las células mientras que la combinación de R5020 y MK-2206 causó la mayor disminución de la viabilidad celular. Además, los ratones con tumores xenoinjertados tratados con MK-2206 solo o con progesterona sola mostraron una modesta reducción en el volumen del tumor. La mayor disminución en el tamaño del tumor se observó en los ratones tratados tanto con MK-2206 y progesterona; estos tumores exhibieron menos la proliferación (Ki67) y el más apoptosis (exfoliados caspasa-3) de todos los grupos de tratamiento. En resumen, la inhibición de AKT estabiliza el receptor de progesterona B y aumenta la respuesta de la progesterona en las células de cáncer de endometrio que han hyperactivated AKT
Visto:. Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) la inhibición de AKT con el activo por vía oral inhibidor alostérico AKT, MK-2206, sensibiliza a las células del cáncer endometrial con progestina. PLoS ONE 7 (7): e41593. doi: 10.1371 /journal.pone.0041593
Editor: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Marzo, 2012; Aceptado: 22 Junio 2012; Publicado: 24 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Pant et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Institutos Nacionales de Salud R21 CA127674 (JJK), Institutos nacionales de /Instituto Nacional del cáncer de la Salud T32CA09560 la formación de subvención, y desde el Programa Malkin estudiosos del Centro de cáncer Integral Robert H. Lurie de la Universidad Northwestern (IIL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de endometrio es la neoplasia ginecológica más común en los Estados Unidos. En 2010, se anticiparon 43,470 nuevos casos resulta en muertes por 7950 [1]. La gran mayoría de los casos de cáncer de endometrio están relacionados con la acción de estrógenos sin oposición se denominan de tipo I de endometrio cánceres. La mutación genética más común que ocurre en aproximadamente el 50-80% de todos los casos en que el cáncer de endometrio tipo es en el gen supresor de tumores
PTEN
[2], [3]. Una mutación en el
gen PTEN
resultado en la activación constitutiva aguas abajo de la fosfatidilinositol 3 'cinasa (PI3K) /Akt [4]. AKT es una quinasa serina /treonina que activa diferentes vías de promoción de la supervivencia celular y la inhibición de la apoptosis [4], [5]. Se ha demostrado previamente que hay niveles de AKT activado aumento en el cáncer de endometrio y que esto puede presagiar un mal pronóstico en estos pacientes [6]. Además, se ha demostrado que la inhibición de la vía de AKT en los resultados de las células de cáncer de endometrio en el aumento de la apoptosis, lo que demuestra que la modulación de esta vía podría desempeñar un importante papel terapéutico [7], [8].
El cáncer de endometrio se trata generalmente con la extirpación quirúrgica del útero y la terapia adyuvante tal como se indica por la patología específica. Para la enfermedad en estadio temprano este tratamiento da como resultado excelentes tasas de supervivencia a los 5 años de más del 90% [9]. Sin embargo, esta cirugía definitiva se opone a cualquier fertilidad más. A medida que aumentan las tasas de obesidad en la población, esto se traduce en un número creciente de mujeres jóvenes con cáncer de endometrio y la terapia conservadora de la fertilidad será más un valor incalculable. En la actualidad, las progestinas se utilizan como tratamiento primario en la enfermedad avanzada o recurrente, en pacientes que no son candidatos quirúrgicos debido a la morbilidad médica, y en pacientes con la esperanza de preservar su fertilidad en el futuro. series de casos múltiples de los pacientes tratados con progestinas han sido publicados con alentadora, aunque no absoluta, resultados. Las tasas de respuesta para la hiperplasia endometrial con atipia han oscilado entre 67-82% y respuesta tarifas de bajo grado gama cáncer endometrial del 50-70% (revisado en [10]). Para aquellos pacientes que no responden a la terapia de progestina, se recomienda la histerectomía. Esta situación clínica es común como el porcentaje de pacientes menores de 45 diagnosticado con cáncer endometrial ahora varía de 5 a 29% [10],.
progesterona media sus efectos inhibidores sobre el endometrio y cáncer de endometrio a través del receptor de progesterona (PR), un receptor de esteroides intracelular con isoformas a y B. Un aumento en las tasas de respuesta a la terapia de progestina y mejores resultados de supervivencia se han reportado en los tumores con un mayor porcentaje de PR [12]. PRA carece de 164 aminoácidos del N-terminal y ambas isoformas se traducen a partir de especies de ARNm individuales de un solo gen bajo el control de promotores distintos y se consideran funcionalmente distinta [13]. Mientras que las funciones específicas para PRA y PRB siguen sin estar claros en el cáncer de endometrio, los estudios sugieren que el PRB puede ser la isoforma principal responsable de los inhibidores de crecimiento de tumores y las acciones represivas de la progesterona in vitro. En las células de Ishikawa PRB-transfectadas de forma estable, el tratamiento MPA como resultado la inhibición de la proliferación, la migración y la invasión, mientras que las células de Ishikawa PRA-transfectadas de forma estable no inhibir estos procesos [14], [15]. células Hec50co Además, transfectadas con PRB tratados con progesterona demostrado una reducción significativa en la proliferación celular y la invasión, mientras que las células que expresan Hec50co ARP tenían efectos inhibidores modestos [16].
MK-2206 es un activo por vía oral, inhibidor alostérico de AKT. Numerosos estudios preclínicos han demostrado eficacia en la inhibición de AKT y la promoción de la muerte celular del cáncer como agente único como en combinación con otros agentes quimioterapéuticos [17], [18], [19], [20]. Los ensayos clínicos están en curso el uso de este nuevo compuesto para el tratamiento del cáncer de diversos tumores sólidos. MK-2206 ha demostrado ser generalmente bien tolerado en dosis de hasta 60 mg QOD por la boca y dio lugar a concentraciones plasmáticas dentro del rango terapéutico aceptado [21]. En la actualidad, hay un ensayo abierto de fase II patrocinado por el Instituto Nacional del Cáncer para los pacientes con cáncer de endometrio avanzado o recurrente. Los resultados primarios son la supervivencia libre de progresión y la respuesta objetiva del tumor.
En este estudio, mostramos que la inhibición de la vía de AKT resultados MK-2206 en la disminución de la viabilidad y el aumento de la apoptosis de las células de cáncer de endometrio. Además, la inhibición de AKT aumenta los niveles de proteína PRB, modifica la expresión de genes regulados de progestina, y sinergia con progestina para disminuir el volumen del tumor de xenoinjertos. tratamiento combinatorio con progestinas y los inhibidores de AKT podría ser considerado para sensibilizar adenocarcinoma de endometrio a la terapia progestina.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la Universidad de Northwestern Animal Comité de Cuidado.
se obtuvieron células de cáncer endometrial
PRB23 células Ishikawa de L. Blok (Universidad Erasmus, Países Bajos). Ishikawa células se originaron a partir de un adenocarcinoma de endometrio bien diferenciado con una mutación conocida PTEN [14]. Las células PRB23 fueron generados por transfección estable del vector de expresión pcDNA3.1 PRB en células Ishikawa desprovistos de PR endógeno [14]. Las células PRB23 se mantuvieron en DMEM /F12 con 10% FBS, piruvato sódico, penicilina /estreptomicina, higromicina, y G418. En aproximadamente 60 a 80% de confluencia, las células se privaron de suero durante la noche en DMEM /F12. Las células se trataron luego al día siguiente con vehículo, 100 nM MK-2206 (2 h de tratamiento previo), 10 nM R5020, o una combinación de los MK-2206 y R5020. Se obtuvo MK-2206 (Merck) a través del Programa de Evaluación de la terapia del cáncer.
Western Blot
lisados de células enteras se obtuvieron en hielo usando la solución de lisis de mamíferos M-PER (Thermo Scientific) suplementado con inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (Sigma). La concentración de proteína en los lisados se midió usando el kit Micro BCA (Thermo Scientific). muestras de proteínas aisladas se corrieron en geles de acrilamida al 8% y luego se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Whatman). Las membranas se bloquearon en 5% albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) en TBS-T a temperatura ambiente durante una hora. Las membranas se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra -AKT fosforilada (Ser473), fosforilada (Thr 308) -AKT, PRAS40 fosforilada, PRAS40, fosforilada (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (/Tyr185 pThr183) SAPK /JNK, JNK, PARP escindida, caspasa 3 escindida (Señalización celular) y PR (Dako). Las transferencias se lavaron cuatro veces en TBS-T a temperatura ambiente y después se incubaron con secundario conjugado con peroxidasa de cabra anti-conejo o anticuerpo anti-ratón de cabra durante una hora a temperatura ambiente. Las membranas se desarrollaron con el kit de detección ECL Super Señal West Femto (Thermo Scientific). Las membranas fueron despojados utilizando Restaurar Western Blot Stripping Buffer (Pierce) y se sondearon con un anticuerpo para la beta-actina (Sigma) durante un control de carga.
Viabilidad de las células
Para evaluar la viabilidad de las células, se utilizó el reactivo viabilidad celular alamarBlue (Invitrogen). PRB23 células fueron sembradas en una placa de negro 96 pocillos de fondo claro en aproximadamente 1.500 células por pocillo en una incubadora a 37ºC. Se dejó que las células se unieran durante la noche y el día siguiente, se lavaron con PBS y después se privaron de suero durante la noche en DMEM /F12 libre de suero. El día siguiente, las células se pre-trató con 1 M MK-2206 durante una hora y después se trató con 100 nM R5020 durante 120 horas. Al final del tiempo de tratamiento, se añadió 10 l de reactivo de alamarBlue a cada pocillo durante dos horas y luego la señal de fluorescencia se midió en el lector de placas Synergy HT de Bio-Tek con el software KC4 3,4 a 530/590 nm para determinar la viabilidad celular.
análisis de microarrays y análisis estadístico
Tres cultivos de células PRB-Ishikawa separadas se utilizaron para el análisis de microarrays. Las condiciones experimentales fueron vehículo o el tratamiento con 10 nM R5020 durante 2 h. Todas las muestras de ARN fueron procesadas en el Centro de Genómica en el Centro de Medicina Genética de la Universidad Northwestern (Chicago, IL). Se evaluó la calidad del RNA total utilizando el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1,5 g de cada muestra de ARN, con 260/280 y la relación de 28S /18S de mayor que 1,8, se utilizó para hacer cDNA de doble cadena. Los controles de calidad y procesamiento de la sonda de nivel de los datos de microarrays Illumina se hicieron aún más con el paquete R Bioconductor, lumi (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). Procesamiento de datos también incluye un procedimiento de normalización utilizando el método cuantil normalización [22] para reducir la variación entre el oscurecimiento microarrays, que podrían introducirse durante el proceso de preparación de la muestra, la fabricación, el etiquetado de fluorescencia, la hibridación y /o exploración. La agrupación jerárquica y análisis de componentes principales se realizaron en los datos de las señales normalizadas para evaluar la relación de la muestra y la variabilidad. Sondas ausente en todas las muestras fueron filtradas a cabo de acuerdo con los valores de p de detección de Illumina en el análisis de aguas abajo. La expresión génica diferencial entre las diferentes condiciones se evaluó mediante un análisis del modelo lineal estadístico utilizando la limma paquete bioconductor, en el que se utilizó un método de Bayes empírico para moderar los errores estándar de los estimados cambios log-veces de la expresión de genes, y resultó en una mayor inferencia estable y mejorar la potencia, especialmente para los experimentos con un pequeño número de microarrays ([23]; http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). Los valores de p moderado t-estadísticas derivadas del análisis limma anterior se ajustaron posteriormente para múltiples pruebas por Benjamini y Hochberg método de controlar la tasa de falso descubrimiento (FDR). Las listas de genes expresados diferencialmente fueron obtenidos por los criterios de FDR & lt; 5% y un doble cambio de corte de & gt;. 1.5, y se visualizaron por parcelas volcán
PCR en tiempo real
Se aisló el ARN a partir de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. La concentración y pureza del ARN extraído se determinaron utilizando el ND-1000 Espectrofotómetro (NanoDrop). muestras de ARN total fueron DNasa I (Investigación Zymo) tratada para eliminar cualquier contaminación de ADN. El ARN total se transcribe inversamente con el Smart MMLV transcriptasa (Invitrogen) para la síntesis de cDNA utilizando el protocolo del fabricante inversa. PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos (Applied Biosystems) a PDK4 y SGK1 y el PDD gen de mantenimiento. El cambio veces en la expresión se calculó utilizando el método ΔΔCt [24], con PDD como un control interno. Todas las reacciones de PCR se realizaron en un ABI PRISM Sistema de Detección de Secuencia 7000 (Applied Biosystems) durante 40 ciclos (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min) después de 10 min de incubación a 95 ° C.
xenoinjertos de tumores
Seis semanas de edad desnudos CD-1, los ratones hembra ovariectomizadas fueron adquiridos de Charles River Laboratories. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Northwestern. Un millón de PRB23 células se suspendieron en PBS 01:02 /Matrigel (BD Biosciences) en un volumen total de 100 l y se inyectaron subcutáneamente en el dorso derecho e izquierdo de cada ratón. Un total de 32 ratones fueron inyectados con el fin de tener 8 ratones por grupo de tratamiento. Los tumores se dejaron crecer durante 8 semanas. Fuera de 32 ratones, los tumores crecieron en 28 ratones. Además, 2 ratones murieron por razones desconocidas. Los 26 ratones restantes se dividieron en 4 grupos, vehículo (6), la progesterona (7), MK-2206 (7), y MK-2206 + progesterona (6). gránulos de progesterona (50 mg, de liberación de 21 días para 2,4 mg /día) se implantaron subcutáneamente. Los ratones recibieron 120 mg /kg de MK-2206, 3 veces por semana durante 9 días en un volumen de 0,3 ml de 30% Captisol. Todos los estudios de toxicidad se han realizado en los roedores por Merck y 120 mg /kg es la dosis recomendada para estudiar los efectos sobre los tumores sin causar toxicidad [25]. Los ratones del grupo de control del vehículo recibieron 0,3 ml de 30% Captisol. Los ratones se pesaron antes y después de los tratamientos. tamaños de los tumores se midieron con calibradores en el transcurso de 8 semanas, así como después de los tratamientos. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula:
El volumen del tumor
= 1/2 (
longitud
×
Ancho
)
2 [25] . Los tumores se extirparon y se procesaron para inmunohistoquímica.
Inmunohistoquímica
Los tejidos se fijaron en formalina y embebidos en parafina, y 4 micras secciones de tejido se colocaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones de tumor se-des con parafina. A continuación, calentar recuperación del epítopo inducida se realizó en un tampón de citrato 10 nM de sodio con 0,05% de Tween (Sigma) a pH 6,0. El tampón de citrato se pre-calienta en un baño de agua a 99 ° C y, a continuación los portaobjetos se colocó en el tampón durante 45 minutos. Los portaobjetos se dejaron enfriar durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron en TBS-T durante 5 minutos. Se utilizó el kit Dako EnVision HRP IHC. 3% de peróxido de hidrógeno se aplicó a las secciones de tejido durante 10 minutos, seguido de 2 lavados durante 10 minutos en TBS-T. bloque de proteínas se aplicó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios a PR (Dako) o exfoliados caspasa 3 (Señalización Celular) durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. Anti-conejo o anticuerpo secundario anti-ratón a continuación, se aplicó a las secciones de tejido durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron en TBS-T dos veces durante 5 minutos. solución de DAB se aplicó a cada sección de tejido durante 5 minutos y después se aclara. Hematoxilina de Mayer se utilizó para contrateñir y se enjuagaron los portaobjetos. Las secciones se colocaron entonces en una solución de hidróxido de amonio al 28% y después se aclararon. Las secciones se deshidrataron a través de 2 cambios de 95% de etanol, 2 cambios de 100% de etanol, y 2 cambios de xileno. Las secciones fueron montadas sobre cubreobjetos utilizando medios de montaje Cytoseal XYL (Richard Allan-científico). Los portaobjetos se visualizaron utilizando el microscopio y 200 imágenes Axiovert (Zeiss) tomadas con la cámara Zeiss Axiocam.
Resultados
Inhibe MK-2206 AKT
La entrada ha sido previamente informaron que las células de Ishikawa llevan una mutación PTEN y esto resulta en activación constitutiva de aguas abajo AKT [7], [8]. Con el fin de determinar si MK-2206 inhibió AKT en las células PRB23, las células se trataron con concentraciones crecientes de MK-2206 (0-1 M) y se incubaron durante diversos tiempos (0-24 h) (Fig. 1A, 1B). se detectó fosforilada (Ser473) -AKT en células tratadas con vehículo y los niveles disminuyó progresivamente con concentraciones crecientes de MK-2206 (Fig. 1A). Los niveles totales de AKT no fueron afectados por el tratamiento con MK-2206. Los niveles de p -AKT (Ser473) disminuyeron, tan pronto como 1 h, y se mantuvieron por debajo de las células tratadas con vehículo a las 24 h (Fig. 1B). Los niveles de P (Thr308) -AKT también se redujo con 100 nM de tratamiento MK-2206 en ambos 4 hy 24 h (Fig. 1C). PRAS40 es un sustrato directo de AKT y los niveles de p (Thr246) -PRAS40 disminuyó tras el tratamiento MK-2206 en 4 h y 24 h, indicando que disminuye la actividad de AKT (Fig. 1C). A continuación, con el fin de demostrar que MK-2206 era específico para la vía de AKT en las células PRB23, se midieron los niveles de otras quinasas fosforiladas, que no son objetivos directos de AKT. Los niveles de P (Thr202 /Tyr204) -ERK, así como p (/Tyr185 Thr183) -JNK no cambiaron tras el tratamiento MK-2206, ya sea a las 4 h o 24 h (Fig. 1C).
PRB- células específicas Ishikawa (PRB23) fueron tratados con a) concentraciones crecientes (0 a 1 M) de MK-2206 para 24 h y B) 100 nM MK-2206 durante diversos tiempos (0-24 h). Los niveles de proteína de p (Ser473) -AKT, AKT y la actina se midieron mediante transferencia Western. ) las células PRB23 C fueron tratadas con 100 nM MK-2206 de 4 h o 24 h y los niveles de p (Thr308) -AKT, AKT, p (Thr246) PRAS40, PRAS40, p (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, p ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK y actina se midió por Western blot.
la inhibición de AKT Aumenta los valores de proteína PRB
Curiosamente, el tratamiento con MK-2206 también dio lugar a una aumento significativo en los niveles de PRB en las células PRB23, lo que indica que AKT afecta a los niveles de proteína PR en estas células (Fig. 2A). Dada la función antagonista de la progesterona en el endometrio, las implicaciones de la modulación de los niveles de PR son significativos. En primer lugar, se realizó un microarray para identificar los genes regulados por la PRB en células PRB23. Específicamente, las células PRB23 se trataron con 10 nM R5020 durante 2 h y por lo tanto se identificaron sólo los genes de respuesta temprana a las progestinas. Un total de 70 genes se upregulated significativamente en más de 1,5 veces y 16 genes se downregulated significativamente (Fig. 2B). Los genes más altamente upregulated fueron PDK4 (9,92 veces), TIPARP (7,79 veces), y SGK1 (4,41 veces). Los genes fueron analizados con la herramienta 'anotación funcional agrupación' de la base de datos para anotación, y Visualización Integrada Discovery (DAVID) [26]. Los genes se clasifican de acuerdo a la base de datos SP-PIR Palabras clave. La categoría que incluye el mayor número de genes que son regulados por R5020 fue "fosfoproteínas" y la segunda más alta eran los genes que sus productos estaban asociados con el núcleo (Fig. 2C).
A)-PRB específica Ishikawa células (PRB23) fueron tratados con vehículo, 100 nM MK-2206, 10 nM R5020, o una combinación de MK-2206 + R5020 (M + R) durante 4 h y los niveles de proteína de p (Ser473) -AKT, AKT, PRB , y la actina se midieron mediante transferencia Western. Se realizó B) Análisis de microarrays de células PRB23 tratados con vehículo o 10 nM R5020 y genes regulados significativamente por 1,5 veces o más fueron identificados. análisis C) Gene ontología categorías se realizó utilizando DAVID como genes regulados por más de 1,5 veces para el R5020.
A continuación, la influencia de AKT en PRB genes diana se examinó. células PRB23 se trataron con 10 nM R5020 en presencia o ausencia de 100 nM MK-2206. Expresión de PDK4 y SGK1 fueron medidos por PCR en tiempo real. PDK4 y SGK1 se clasificaron como fosfoproteínas. Como se muestra en la Figura 3, tanto PDK4 y SGK1 se upregulated significativamente por R5020, confirmando los datos de microarrays. tratamiento MK-2206 solo no influyó en la expresión de cualquiera de los genes ensayados en comparación con células tratadas con vehículo. Cuando las células se trataron en combinación con R5020 y MK-2206, la expresión de PDK4 aumentó significativamente, sin embargo, la expresión SGK1 no cambió con el tratamiento de combinación en comparación con R5020 solo. Esta regulación diferencial de PRB genes diana en las células PRB23 cuando AKT se inhibe fuertemente sugiere un mecanismo más complejo de la regulación de genes que simplemente niveles crecientes de proteína PRB.
células PRB23 se trataron con vehículo, 10 nM R5020, 100 nM MK-2206, o una combinación de MK-2206 + R5020 (M + R) y la expresión génica de PDK4 y SGK1 se midió usando PCR en tiempo real. Los datos se presentan como cambios veces de las muestras tratadas con vehículo y representan la media ± SEM de 6 experimentos independientes. "*" Denota significación estadística en comparación con el control del vehículo. P £ 0,05.
MK-2206 y progestina disminuye la viabilidad celular y el tamaño del tumor
Con el fin de medir los efectos de AKT y progestina en la viabilidad de las células cancerosas, las células fueron tratadas con PRB23 R5020 en presencia o ausencia de MK-2206 y la viabilidad celular se midió. Mientras R5020 y MK-2206 disminuyeron independientemente viabilidad de las células en el transcurso de 5 días de la combinación de R5020 y MK-2206 causado la mayor disminución de la viabilidad (Fig. 4).
células PRB23 se trataron con vehículo, 100 nM R5020, 1 uM MK-2206, o una combinación de MK-2206 + R5020 (M + R) durante 5 días y la viabilidad celular se midió utilizando el ensayo Alamar Blue. Los datos se presentan como% de viabilidad de las muestras tratadas con vehículo y representan la media ± SEM de 4 experimentos independientes.
A continuación, los efectos de la progesterona y MK-2206 se pusieron a prueba en los tumores xenoinjertados que se desarrollaron a partir de la inyección subcutánea de las células PRB23 en ratones desnudos. Los tumores se dejaron crecer durante 8 semanas y posteriormente tratados durante 9 días con vehículo, la progesterona, MK-2206, o progesterona + MK-2206 (Fig. 5A). Peso de los ratones no cambió significativamente con los tratamientos (Fig. 5B). En comparación con los ratones tratados con vehículo, los ratones tratados con MK-2206 solo o progesterona sola mostraron reducciones modestas en su volumen de tumor basado en factor de cambio del tamaño del tumor antes del tratamiento. Se observó que la mayor disminución en el tamaño del tumor en los ratones tratados tanto con MK-2206 y progesterona (Fig. 5C).
células PRB23
A) fueron subcutáneamente xenoinjertado en ratones desnudos CD1. Después de 8 semanas, los ratones fueron tratados con vehículo, 120 mg /kg de MK-2206 por vía oral, 3 veces a la semana durante 9 días, progesterona o combinación de MK-2206 y progesterona. B) Los pesos de los ratones se midieron antes y después de los tratamientos y los tumores C) se midieron antes y después de los tratamientos y se calculó el volumen. "*" Denota significación estadística en comparación con el control del vehículo. P £ 0,05.
El análisis inmunohistoquímico se realizó en secciones de tumores utilizando anticuerpos contra los receptores de progesterona, Ki67 y se escindió de la caspasa-3 (Fig. 6). La tinción de PR fue evidente en los tumores, aunque no todas las células fueron positivas para PR. tratamiento con progesterona disminución de los niveles de PR tanto en la presencia y ausencia de MK-2206. En contraste, el tratamiento MK-2206 promovido un aumento en los niveles de proteína PR en los tumores, similar a lo observado en células de cáncer de endometrio (Fig. 2A). La proliferación de las células se midió mediante los niveles de proteína Ki67, que disminuyeron con la progesterona, MK-2206, así como la progesterona combinación + tratamiento MK-2206. Los niveles más bajos de tinción Ki67 se observó con el tratamiento combinado, lo que sugiere que el tratamiento combinado disminuye más efectivamente la proliferación de las células cancerosas. Los niveles de caspasa-3 troceados, un indicador de la apoptosis, fueron insignificantes en los tumores de los ratones tratados con vehículo, mientras que la tinción era evidente en los tumores de progesterona o MK-2206 ratones tratados. El tratamiento combinado dio lugar a la más alta expresión de la caspasa-3 escinde, indicativo de aumento de la apoptosis.
tumores xenoinjertados se fijaron, se incrustan y se seccionaron. Se realizó la tinción inmunohistoquímica de tumores de PR, Ki67 y se escindió casapse-3 (CC3).
Discusión
En este estudio, hemos demostrado que el MK-2206 se redujo de manera eficiente los niveles de p (Ser473) -AKT y p -AKT (Thr308) en las células Ishikawa PTEN-mutado. Como resultado, los niveles de p (Thr246) -PRAS40, un objetivo corriente abajo de AKT, la disminución, así, indicativo de que la actividad de AKT fue inhibida por MK-2206. Este inhibidor no afectó a los niveles de otras quinasas, tales como pERK y pJNK demuestra la especificidad de este compuesto a la vía de AKT. La inhibición de AKT también aumentó los niveles de PRB. Anteriormente, hemos demostrado que un inhibidor de AKT diferente, API-59CJ-OMe (Merck4Biosciences), también aumentó significativamente los niveles de relaciones públicas en las células PRB23 Ishikawa [8]. Gu et al., [27], mostró recientemente que la inhibición de PI3K LY294002 usando aumento de los niveles de PR en células de Ishikawa. La influencia de la vía de AKT en PR expresión y la función no se ha estudiado en detalle y los mecanismos por los que este aumento de la proteína PR ocurre actualmente se están explorando en nuestro laboratorio. Nuestra hipótesis de trabajo actual se centra en el papel de AKT en la disminución de la sensibilidad a la progesterona en el cáncer de endometrio. La disminución de los niveles de PR fue la primera pieza de evidencia de apoyo de nuestra hipótesis. Se suponía que el aumento de los niveles de relaciones públicas debe mejorar PR transcripcional función, sin embargo, los datos revelan que la acción de relaciones públicas es más complejo, ya que no todos los genes regulados de progesterona fueron influenciados por la inhibición de AKT. Está bien establecido que, como otros receptores de hormonas esteroides, la regulación de genes por PR implica numerosas interacciones con otros factores de transcripción, el ADN, coregulators, y complejos de remodelación de la cromatina. PR es la acción de genes específicos donde los diferentes mecanismos se emplean en diferentes sitios de la cromatina. Nuestro análisis de microarrays identificado PDK4 que es el gen más altamente upregulated (aumento de más de 50 veces) con el tratamiento con progestina a corto plazo. Este fue también un gen que se incrementó aún más con progestina cuando AKT se inhibió, lo que indica que AKT hiperactiva en las células Ishikawa amortigua la acción de la progesterona en este gen particular. Se ha demostrado que PDK4 también está regulada positivamente por los glucocorticoides, a través de GR, en las células HepG2 [28]. Ellos demostraron que la sobreexpresión de PKB abrogó la estimulación del promotor de dexametasona PDK4 que apoya nuestros resultados. Además, demostraron que FoxO1, que se fosforila directamente por AKT y exportado al citoplasma, se requiere para la regulación positiva mediada por GR de PDK4. Hemos demostrado una cooperación de PR y FoxO1 en la regulación de genes en las células del estroma endometrial [29], [30], [31] y por lo tanto es probable que PDK4 regulación al alza por las progestinas requiere tanto de PR y FoxO1 en células de cáncer de endometrio. Por lo tanto, cuando AKT está activo, niveles insuficientes de FoxO1 están disponibles para actuar en el núcleo y la expresión de PDK4 es humedecido. Sería interesante para determinar la importancia de la PR y FoxO1 cooperación en los otros genes de progesterona-sensible que fueron influenciadas por la inhibición de AKT en el cáncer de endometrio.
PDK4 es una quinasa que inactiva el complejo piruvato deshidrogenasa (PDC) . El PDC genera acetil-CoA, que es el precursor para la síntesis de ácidos grasos y la producción de energía por el ciclo de Krebs. actividad PDC está regulada por PDKs y fosfatasas de PDC para fosforilar o desfosforilar el componente de E1a del complejo. Esta regulación es importante el control de la glucosa y el metabolismo de los lípidos. Upregulation de PDK4 por las progestinas, y una mejora adicional de este aumento en el tratamiento MK-2206 sugiere que las progestinas pueden actuar para inactivar el PDC y de inhibir la conversión de piruvato a acetil-CoA. Esta inhibición de la producción de acetil-CoA en consecuencia puede conducir a la utilización de las vías metabólicas alternativas, tales como la glucólisis. Dado el papel central que juega PDK4 en la regulación de la elección entre la glucólisis y la fosforilación oxidativa, PDK4 ha sido implicada en un número de diferentes tipos de cáncer. Previamente se ha demostrado que la inhibición de la actividad PDK es suficiente para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis en células de cáncer de pulmón, lo que sugiere que PDKs puede conducir la tumorigénesis [32]. Sin embargo, estudios recientes también han demostrado que la sobreexpresión de PDK4 es suficiente para inhibir la proliferación de células de cáncer de mama y que la expresión PDK4 es downregulated en una serie de diferentes tejidos de cáncer [33]. El papel específico que desempeña PDK4 en el cáncer de endometrio queda por descifrado.
Los estudios preclínicos han demostrado MK-2206 para inhibir eficazmente la vía AKT así como la proliferación y el crecimiento tumoral disminución de varias líneas celulares de cáncer [25]. También se ha demostrado que la combinación de MK-2206 y agentes quimioterapéuticos es más eficaz en la inhibición de crecimiento del tumor [25]. MK-2206, junto con un inhibidor de MEK fue demostrado tener un efecto sinérgico sobre el crecimiento del tumor y llevado a un aumento de las tasas de supervivencia en ratones con tumores de pulmón humanos altamente agresivos [34]. MK-2206 fue capaz de restaurar la sensibilidad de las células resistentes a sorafenib, un inhibidor de la tirosina quinasa, para inducir la apoptosis en células de carcinoma hepatocelular [35]. En combinación con gefitinib, un inhibidor de molécula pequeña de la tirosina quinasa EGFR, MK-2206 promueve eficazmente la apoptosis en glioma maligno [17].