Extracto
La proteína quinasa CK2 es frecuentemente elevada en una variedad de cánceres humanos. La vía de señalización Hedgehog (Hh) ha sido implicado en el mantenimiento de células madre, y su activación aberrante se ha indicado en varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón. En este estudio, mostramos que CK2 participa positivamente en la señalización de Hh /Gli en el cáncer de pulmón líneas celulares A549 y H1299. En primer lugar, hemos encontrado una correlación entre los niveles de ARNm y CK2α Gli1 en 100 tejidos de cáncer de pulmón primario. Baja regulación de la expresión y la actividad transcripcional Gli1 se demostró después de que el silenciamiento de CK2α en células de cáncer de pulmón. Además, CK2α siRNA redujo regulado la expresión de genes diana Hh. Además, dos inhibidores de molécula pequeña CK2α condujeron a una inhibición dependiente de la dosis de la expresión Gli1 y la actividad transcripcional en células de cáncer de pulmón. A la inversa, forzada sobre-expresión de CK2α resultó en un aumento tanto en la expresión Gli1 y la actividad transcripcional en las células A549. Por último, la inhibición de Hh /Gli por CK2α siRNA condujo a una reducción de un lado la población de células madre de cáncer como el que muestra mayor nivel de expresión ABCG2. Por lo tanto, nos informan de que la inhibición de la CK2α regula a la baja la señalización de Hh /Gli y posteriormente se reduce la población de tallo como lado en células de cáncer de pulmón humano
Visto:. Zhang S, Wang Y, Mao JH, Hsieh D, Kim IJ, Hu LM, et al. (2012) La inhibición de la CK2α regula a la baja del erizo /Gli señalización conduce a una reducción de un tallo-como lado Población en células de cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 7 (6): e38996. doi: 10.1371 /journal.pone.0038996
Editor: Alan P. Campos, Mayo Clinic College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Enero 16, 2012; Aceptado: 14 de mayo de 2012; Publicado: 29 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La presente labor fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención R01 CA140654-01A1 (LY) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, República Popular China 2009 (9451008901003072). También estamos agradecidos por el apoyo de la Kazan, McClain, Abrams, Fernandez, Lyons, Greenwood, Harley & amp; Fundación Oberman, Inc; Los herederos de Robert Griffiths; la Fundación Jeffrey y Karen Peterson familia; Paul y Michelle Zygielbaum; la Herencia de Norman Mancini; y la Isackson Fondo de Investigación del Cáncer de pulmón Bárbara. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CK2 proteína quinasa (anteriormente conocida como la caseína quinasa II) es una quinasa de serina /treonina altamente conservadas que fosforila más de 300 proteínas [1]. CK2 tiene una estructura heterotetrameric que consta de dos subunidades catalíticas (42-kDa alfa o 38-kDa α ') y la subunidad reguladora (28-kDa β), que forma el configuraciones α2β2, αα'β2 y α'2β2. CK2 es una proteína quinasa multifuncional [2], que se ha demostrado que participan en casi todos los aspectos de la proliferación celular y la supervivencia [3], [4], [5]. El nivel de expresión CK2α está estrechamente regulada en células normales [6], y el aumento de nivel CK2α y la actividad se ha observado consistentemente en una variedad de cánceres humanos [7], [8], [9]. Por ejemplo, el alto nivel y /o la localización nuclear de CK2α es un marcador de mal pronóstico para los pacientes con leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, cáncer de próstata y cáncer gástrico [10], [11], [12], [13] . CK2 también afecta a varias vías de señalización celular, incluyendo PI3K, NFkB y Wnt [6], [14], [15].
The Hedgehog (Hh) la familia de proteínas secretadas, que consta de Sonic, desierto indio y erizo, juega un papel importante en el desarrollo de los mamíferos y en el mantenimiento de células madre [16], [17]. La activación de la ruta de Hh se inicia en la superficie celular por la unión a su receptor Patched (Ptc) ligando Hh, dando como resultado la desrepresión de la proteína efectora, un receptor acoplado a proteína G, Smoothened (Smo) [18]. En última instancia, Smo activa la familia de factores de transcripción Gli y genes diana. Hay tres proteínas Gli en los seres humanos: Gli1 sirve para activar genes diana Hh, Gli2 actúa como activador y represor de Hh genes diana, mientras que Gli3 actúa como un represor de Hh objetivo genes [19], [20]. La desregulación de la señalización de Hh /Gli está implicada como un desencadenante, o como factor de mantenimiento en la progresión de varios tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas de células basales, meduloblastomas, leucemia, pulmón, gastrointestinal, de pulmón, de ovario, de mama y de próstata [19], [21]. Por ejemplo, el gen Gli1 se amplifica en glioma humano y se activa en el carcinoma de células basales [22], [23], [24]. Transgenic sobre-expresión de Gli1 en ratones conduce al desarrollo de carcinoma de células basales [25]. Gli1 la activación se ha demostrado en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) las células y tejidos [26].
La evidencia directa de que la señalización Hh /Gli juega un papel importante en las células madre del cáncer (CSC) se deriva de una serie de estudios en diferentes tipos de tumores [21]. Estudios recientes han indicado que el miembro de casete transportador 2 de la familia de proteínas G (ABCG2) de unión a ATP es un objetivo directo transcripcional de Hh /Gli señalización [27]. Una subpoblación, la población lado llamado (SP) con un mayor nivel de expresión ABCG2 en las células cancerosas humanas, incluyendo las células de cáncer de pulmón A549, serie de características CSC '[28], [29], [30] mostró. Varias líneas de evidencia reciente sugiere que la señalización de hedgehog regula población lado de tallo como en células de cáncer de pulmón humano. Por ejemplo, la población de lado de línea celular de cáncer de pulmón H460 expresa preferentemente ABCG2 y SMO, un mediador crítico de la señalización de hedgehog. La ciclopamina, un inhibidor de la vía hedgehog natural, inhibe en gran medida la progresión del ciclo celular y la proliferación de células de la línea celular H460 [30]. La ciclopamina también redujo la población lado en las células cancerosas humanas [31]. Además, inhibidor de la vía Hedgehog GDC-0449, un FDA aprobado por la FDA para el tratamiento de carcinoma de células basales metastásico, el crecimiento celular reducido de manera efectiva en líneas celulares de cáncer de pulmón humano. El efecto es mediado por la inhibición de la población laterales del pie-como [32].
Hasta la fecha, no hay evidencia de la relación entre CK2 y la señalización de Hh /Gli en células de mamífero. Para investigar si CK2 está implicada en la ruta de Hh en células de cáncer de pulmón humano, hemos probado la actividad de Gli1 después de la inhibición CK2.
Resultados
CK2α y Gli1 Los genes se activan y correlacionada en el CPNM Humano genes
Tanto CK2α y Gli1 han demostrado ser sobre-expresado en una variedad de cánceres, incluyendo cáncer de pulmón [26], [33]. Mediante el uso de semi-cuantitativos de RT-PCR (Figura 1 A) y análisis de transferencia Western (Figura 1B), se analizó el gen y la proteína CK2α en ocho de las líneas celulares de NSCLC. Los datos mostraron que CK2α se expresa en todas las células cancerosas. Entre ellos, por lo menos cinco líneas de células (A549, A427, H1299, H358 y H838) mostraron relativamente más alta expresión de CK2α tanto en el ARNm y los niveles de proteína. CK2α expresión se había demostrado que ser mínima en las células pulmonares normales [34]. Gli1 de genes y proteínas se detectaron expresiones ampliamente en todas las líneas celulares, excepto H358. Curiosamente, no parece haber una correlación entre la expresión de CK2α y Gli1 en estas líneas celulares. Se realizó en tiempo real de RT-PCR de CK2α y Gli1 en 100 muestras de NSCLC primarios. Una correlación moderada entre CK2α y los niveles de ARNm Gli1 se encontró en estos tejidos (r = 0,37,
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 1C). Para los estudios experimentales posteriores, A549 fue elegido debido a que el estado de las vías relacionadas con el cáncer en las células A549 ha sido bien caracterizado. H1299 también fue elegido debido a su relativamente más alta expresión de genes CK2α y Gli1.
(A) RT-PCR. (B) transferencia de Western. El gen CK2α se activó en las ocho líneas celulares de NSCLC examinadas (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 y H322), y el gen Gli1 se expresó en todas las líneas celulares excepto H358. curva de correlación (C) lineal de los niveles de ARNm y CK2α Gli1. Una correlación moderada (r = 0,37,
P Hotel & lt; 0,05) se demostró en el análisis de correlación lineal por SPSS. tejidos primaria NCSCL de pacientes sometidos a resección se recogieron en el momento de la cirugía e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Estas muestras de tejido se mantuvieron a -170 ° C en un congelador de nitrógeno líquido antes de su uso.
CK2α Derribo Inhibe Hh /Gli señalización a través de la regulación negativa de Gli1
Para investigar si la supresión CK2 tienen un efecto sobre la vía de Hh, que silenciado expresión CK2 usando CK2 siRNAs subunidad específica. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la eficiencia de la interferencia de ARN se monitorizó por semi-cuantitativos de RT-PCR (Figura S1). Los correspondientes niveles de ARNm de las tres subunidades disminuyó, y la caída de α y α 'fue confirmada por co-transfección de sus siRNAs. La expresión de los componentes de la ruta Hh indicados también se determinó (Figura S2). En general, los resultados de RT-PCR mostraron que los niveles de ARNm y Ptc1 Gli1 en A549 y células H1299 fueron consistentemente las reguladas después CK2α o CK2β caída, mientras que se observaron cambios mínimos en otros componentes de la vía Hh. Por tiempo real de RT-PCR, se confirmó que el silenciamiento de CK2α inhibió significativamente la expresión Gli1 tanto en A549 y líneas celulares H1299 (Figura 2A). El silenciamiento de CK2β también resultó en una disminución significativa de Gli1 en ambas líneas celulares (Figura 2A). Además, la expresión Gli1 fue mínima en el control de pulmón normal. A nivel de proteína, el silenciamiento de CK2α llevó a un 71% (A549) y una disminución del 73% (H1299) de Gli1, mientras que el silenciamiento de CK2β llevó a un 67% (A549) y una disminución del 35% (H1299) de Gli1. El tratamiento con CK2α' de metas de siRNA produjo ninguna diferencia evidente, en lugar de disminuir de Gli1 en A549, y produjo un aumento de 60% en H1299, tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Figura 2B). Además, se realizó la tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-Gli1, ya que la localización nuclear de Gli1 refleja la actividad de la vía de Hh [35]. proteínas nucleares Gli1 se redujeron drásticamente en presencia de CK2α siRNA (Figura 2C). Por otra parte, el silenciamiento de CK2α resultó en una disminución significativa (45% a 25 M y 60% a 50 M, P & lt; 0,01) en la actividad de reportero Gli Gli1 potenciado, en comparación con el ARNsi no director (control) (Figura 2D) .
(a) los niveles de mRNA cuantitativa Gli1 después del tratamiento con siRNA CK2 subunidad específica detectada por tiempo real RT-PCR. El silenciamiento de CK2α redujo significativamente los niveles de ARNm de Gli1 tanto en A549 y líneas celulares H1299 (por 50% y 45%, respectivamente). El silenciamiento de CK2β también resultó en una disminución significativa de Gli1 en ambas líneas celulares. Mínimo nivel Gli1 mRNA se observó en el pulmón normal (NL). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. niveles (B) proteína detectada por Western blot. El silenciamiento de CK2α llevó al 71% (A549) y la reducción del 73% (H1299) de Gli1, mientras que el silenciamiento de CK2β llevó al 67% (A549) y 35% (H1299) disminución de Gli1. Tratamiento por CK2α' de metas de siRNA produjo ninguna diferencia evidente, en lugar de disminuir de Gli1 en A549, y produjo un aumento de 60% en H1299, tanto en el ARNm y los niveles de proteína. (C) La localización de Gli1 detectado por fluorescencia verde. La proteína Gli1 localiza principalmente en el compartimento nuclear de las células, y muestra una gran reducción después de CK2α caída. Barra de escala = 30 micras. (D) la actividad transcripcional de la vía de Hh en A549 detectado por el ensayo de reportero de Gli. El silenciamiento de CK2α resultó en una disminución significativa (más de 40% a 25 M y 60% a 50 M) de la actividad transcripcional, en comparación con el control de siRNA. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. los niveles de (E) Cuantitativo Gli1 mRNA después del tratamiento con TBB y CX-4945 por tiempo real RT-PCR. expresión Gli1 en A549 se redujo notablemente en los niveles de dosificación de 1 M CX-4945 y 10 mM TBB, significativamente en 10 mM CX-4945 y 50 mM TBB (50% y 60%). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. los niveles (F) proteína detectada por Western blot. En el nivel de proteína, estos descensos se elevó a 76% (10 M CX-4945) y 89% (50 mM TBB) en el A549, y el 81% (10 M CX-4945) y 93% (50 mM TBB) en H1299, respectivamente . (G) La expresión de proteínas de Gli1 detectada por fluorescencia verde. Las células se tratar con TBB 30 M o vehículo DMSO, la tinción de inmunofluorescencia con anti-Gli1 mAb en células cultivadas mostraron una fluorescencia verde claramente inferior en presencia de 30 mM TBB. (Barra de escala = 30 micras). (H) La actividad transcripcional de la vía de Hh en A549 detectado por el ensayo de reportero de Gli. Una disminución del 50% se detectó en presencia de 10 mM CX-4945 o 10 mM TBB. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01, prueba t de Student
pequeña molécula CK2α Inhibidores de Down-regulación de la expresión y Gli1 Actividad transcripcional
a fin de validar el papel desempeñado por CK2α en la vía de Hh, que utiliza dos inhibidores de molécula pequeña CK2α: TBB (4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole), un conocido inhibidor de CK2α [36], y el CX-4945 (5- (3-clorofenilamino) benzo [c] [2], [6] naftiridina-8-carboxílico), una investigación de primera en su clase, inhibidor selectivo, oral de bajo CK2α en la Fase 1 de pruebas clínicas [37].
las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de TBB (10, 30, 50 M) o CX-4945 (1, 3, 10 mM), o con el vehículo DMSO para 48 horas. Los tratamientos con TBB o CX-4945 condujo a una disminución dependiente de la dosis de Gli1 ARNm y los niveles de proteína tanto en A549 y líneas celulares H1299 (Figura 2E, 2F y S3). Los niveles de mRNA fueron detectados por cuantitativas en tiempo real de RT-PCR. Como se muestra en la Figura 2E, la expresión Gli1 en A549 se redujo notablemente en los niveles de dosificación de 1 M CX-4945 y 10 mM TBB, y disminuyó significativamente en 10 mM CX-4945 y 50 mM TBB (50% y 60%,
P Hotel & lt; 0,05). A nivel de proteínas, estas disminuciones alcanzaron a 76% (10 mM CX-4945) y 89% (50 mM TBB) en A549, y 81% (10 mM CX-4945) y 93% (50 mM TBB) en H1299, respectivamente (Figura 2F). La tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal anti-Gli1 en células cultivadas mostraron una fluorescencia verde mucho más bajo en presencia de 30 mM TBB (Figura 2G). a continuación, hemos demostrado que las pequeñas moléculas inhibió la actividad de reportero Gli en la línea celular A549, en donde una disminución significativa (55%, P & lt; 0,01) se detectó en presencia de 10 mM CX-4945 o 10 mM TBB (Figura 2H). Estos resultados son consistentes con lo que encontramos en los estudios de siRNA.
forzado sobre-expresión del gen CK2α Conduce a Gli1 Regulación hacia Arriba y activación transcripcional
Para confirmar si el gen afecta positivamente a la CK2 actividad transcripcional de Gli1, transfectadas las células A549 con o bien un pcDNA3.1-CK2α o control pcDNA3.1-LacZ plásmido. Como era de esperar, la sobre-expresión de CK2α se atribuyó a la activación de Gli1 en la línea celular A549. La sobre-expresión de CK2α fue detectado por RT-PCR (Figura 3A) y Western blot (Figura 3B). El nivel de mRNA Gli1 elevada también se detectó mediante RT-PCR (Figura 3A). Por análisis de transferencia de Western, mostramos el nivel elevado Gli1 proteína (2,35 veces) en las células con expresión sobre-ectópica de CK2α (Figura 3B). Además, el ensayo de indicador también mostró una disminución significativa (& gt; 2 pliegues, P & lt; 0,01) aumento de Gli1 actividad transcripcional (Figura 3C). Estos hallazgos sugieren que la expresión excesiva del gen CK2α conduce a una sobre regulación de la expresión génica y la actividad transcripcional Gli1. Células A549
(A) fueron transfectadas ya sea con un pcDNA3.1-CK2α o pcDNA3 de control. 1-LacZ vectores plásmidos, los sobreexpresados CK2α y hasta regulado Gli1was detectados por tiempo real RT-PCR. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. (B) transferencia de Western. El nivel de proteína Gli1 fue hasta reguladas en este sistema con un aumento de dos veces. (C) Además, el ensayo de indicador también mostró una (más de 2 veces) aumento significativo de la actividad transcripcional Gli1. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. (D) En un análisis de la degradación de proteínas, las células A549 demostraron una reducción de la proteína Gli1 en el punto de tiempo de 2 horas después de tratado con CK2α siRNA.
El silenciamiento de CK2α Promueve Gli1 Degradación
Se llevó a cabo un experimento adicional del curso del tiempo para examinar Gli1 medio tiempo. Las células A549 se transfectaron con CK2α o ARNsi de control, y se detectaron los niveles de proteína Gli1 en los puntos de tiempo de 0, 1 y 2 horas después del tratamiento con el inhibidor de proteína, cicloheximida. En el grupo de caída CK2α, el nivel de proteína Gli1 reduce a mimimum a las 2 horas después del tratamiento con cicloheximida (cuando se compara con el de 0 horas), lo que sugiere que la vida media de Gli1 después CK2α siRNA desmontables es & lt; 2 horas. Estos datos indican que CK2α desmontables resultados en la degradación de Gli1 (Figura 3D). Esto, a su vez, sugiere que regula la actividad CK2α Gli1 impidiendo su degradación.
CK2α Derribo regula a la baja Hh genes abajo y reduce SP perfil a través de ABCG2 en el A549
Según los informes Hh controla la proliferación de varios tipos de células a través de diversos mecanismos moleculares y apunta a genes aguas abajo, incluyendo Ptc, miembros de la familia de ciclinas, y la auto-inducción de Gli1 [20], [38]. Se analizaron los niveles de mRNA de cuatro (Gli1, Ptc1, pTC2 y ciclina E1) de estos genes mediante el uso de tiempo real RT-PCR (Figura 4A). La expresión de los cuatro genes diana Hh disminuyó significativamente (
P
& lt; 0,05). Después de CK2α caída, lo que sugiere una actividad transcripcional deprimido de la vía de Hh
(A) Hh genes aguas abajo expresión detectado por tiempo real RT-PCR. El nivel de ARNm de los cuatro genes Hh objetivo (Gli1, Ptc1, pTC2 y ciclina E1) se redujo significativamente después de CK2α caída. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, prueba t de Student. (B) La expresión de ABCG2 disminuyó en las células A549-silenciado CK2α. (C) La proporción de células SP se redujo de 26,8% a 15,4%, y del 9,4% al 3,4% en presencia de 50 mM verapamilo, respectivamente. Las células se marcaron con el Hoechst 33342 y se analizaron por citometría de flujo. (Derecha) se produce cuando las células fueron tratadas con 50 mM verapamil durante el procedimiento de etiquetado. La SP se describe y se muestra como un porcentaje de la población celular total. Estos experimentos se repitieron tres veces con resultados similares. (D) Gráfico de barras para (C). (E) Modelo de Hh /Gli1 señalización regulada por CK2. Los detalles se describen en el texto.
Se ha demostrado que ABCG2 es el principal contribuyente al fenotipo SP en varias líneas celulares de cáncer incluyendo A549 [28]. El fenotipo SP se ha caracterizado en una serie de estudios de células madre de cáncer derivadas de próstata, mama, colon, glioma, vejiga, ovario, cuello del útero, y melanoma [29], [39], [40], [41], [ ,,,0],42]. Estudios recientes muestran que ABCG2 es un objetivo directo de la vía Hh que está implicado en el mantenimiento de células madre [27]. Primero examinamos la expresión ABCG2 después CK2α desmontables y encontramos que el nivel ABCG2 se redujo drásticamente en las células A549-silenciado CK2α (Figura 4B). De acuerdo con otros hallazgos, relativamente mayor porcentaje (26,8%) de células A549 fueron clasificados como células SP en nuestro estudio. En presencia de verapamil, un inhibidor de transportador de ABC, la proporción de células SP se redujo a 9,4%. Después del tratamiento con siRNA CK2α, la proporción se redujo a 15,4% (sin verapamilo) o el 3,4% (con verapamilo) (Figura 4C y 4D). A continuación, ordenados células SP y no SP en este sistema. En un análisis más detallado por semi-cuantitativos de RT-PCR, las células SP según mostraron mayor expresión de ABCG2 que hizo las células no-SP, pero no hubo diferencias de expresión ABCG2 en células SP o no SP se mostró entre el CK2α siRNA y control (Figura S4). En resumen, hemos demostrado una reducción del 42,5% de la proporción de SP después de CK2α caída.
Discusión
Nuestros resultados sugieren que la CK2 es un regulador positivo de Hh /Gli1 señalización en el cáncer de pulmón humano. Esto es apoyado por varias líneas de evidencia. En primer lugar, la correlación de CK2 y Gli1 expresiones se observaron en varias líneas celulares de cáncer de pulmón. Además, demostró una correlación lineal de 100 tejidos primarios NSCLC. En segundo lugar, la inhibición de la CK2α de siRNA o inhibidores moleculares pequeños dio lugar a baja regulación de la expresión y la actividad transcripcional Gli1. En tercer lugar, forzada sobre-expresión de CK2α resultó en el aumento de expresión Gli1 y la actividad transcripcional. Por último, CK2α caída condujo a una reducción de la población lado a través de la regulación negativa ABCG2, un objetivo directo de Hh /Gli señalización [27].
Hasta la fecha, no hay evidencia de la correlación entre CK2 y Hh /señalización Gli en células de cáncer humano, aunque CK2 se sugirió como un regulador positivo de la vía de transducción de señal Hh y dos residuos de serina en Smo fueron fosforilados por CK2 en
Drosophila
[43]. Sin embargo, no aparece este mecanismo sobre la fosforilación de Smo por CK2 para aplicar a los seres humanos, ya que estos dos residuos de Smo no se conservan en Smo humana cuando se alinea con Clustal W [44] (Figura S5). Por otra parte, varios estudios han sugerido que los mamíferos Smo y
Drosophila
Smo están regulados por mecanismos fundamentalmente distintas [45], [46]. Recientemente, Chen et al. demostró que los mamíferos Smo se activa a través de la fosforilación de múltiples sitios por CK1α y GRK2 y propuso mecanismo de dos pasos para la fosforilación Smo en células de mamífero [47].
Para investigar el posible mecanismo a través del cual CK2 regula positivamente la expresión humana Gli1 y la actividad transcripcional, se realizó un ensayo de degradación de las proteínas de Gli1 después del tratamiento con CK2α siRNA. Nuestros resultados indican que CK2 silenciamiento reduce la vida media de la proteína Gil1 humano en células A549. Por otra parte, tanto CK2 siRNA y los inhibidores de moléculas pequeñas regulados hacia abajo actividad transcripcional Gli1 potenciado. Por otra parte, forzada sobre-expresión de CK2α resultó en la actividad transcripcional Gli1. Además, encontramos dos predijo sitios de fosforilación de CK2 en Gli1 humana mediante el uso de Scansite con rigurosidad media [48] (Figura S6). Nuestros datos sugieren que CK2 puede regular Gli1 en células de cáncer humano de una manera similar con la de
Drosophila
. Por ejemplo, Jia et al. informó que CK2 fosforila directamente en Ci
Drosophila
, y luego impide su ubiquitinación y degradación [43]. Por otra parte, se ha propuesto que la glucógeno sintasa quinasa-3 beta regula negativamente factores de transcripción Gli1 que cooperan con otras quinasas tales como PKA y CK1s en las células A549 de cáncer de pulmón [49]. Por lo tanto, dos pasos están probablemente implicadas en la regulación positiva de Gli1 por CK2. En el primer paso, la inhibición de CK2 promueve la degradación Gli1, seguido por la acumulación reducida de Gli1 en el compartimento nuclear. En el segundo paso, como el factor de transcripción clave de la vía Hh, la proteína Gli1 reducido posteriormente suprime la transcripción de los genes diana Hh. Esto a su vez, forma un bucle de realimentación para disminuir aún más el nivel de expresión de Gli1, que está actuando como un gen diana de la vía (Figura 4E). Aunque el mecanismo de la regulación CK2 en los cánceres humanos sigue siendo desconocida, hay pruebas de que CK2 es esencial para Wnt /beta-catenina de señalización [50], [51]. Por ejemplo, fue implicado que CK2 puede unirse y fosforilar β-catenina y promueve su degradación [52]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que CK2α puede estabilizar de proteína Gli1 humano a través de la fosforilación directa. Se necesitan más estudios para dilucidar los mecanismos precisos.
La ruta del factor de transcripción Hh Gli1 regula la expresión de la proteína ABCG2 transportador ABC uniéndose directamente al promotor ABCG2 [27], ABCG2 es un determinante molecular del SP fenotipo y expresa en niveles más altos en células SP, en comparación con las células no SP [28], [31]. Según los informes, las células SP están enriquecidas con células madre del cáncer, ya que muestra propiedades de células madre (altamente tumurigenic y quimio-resistentes). Estudios previos han detectado fenotipo SP con el nivel de expresión más alto y ABCG2 implicado ABCG2 como marcador CSC en las células A549 de cáncer de pulmón [28]. Por ejemplo, en células SP A549 mostraron potencial más tumurigenic [29]. En nuestro estudio, el gen diana de Hh /Gli ABCG2 señalización se había reducido regulado después de la inhibición CK2α, donde la población lado ABCG2 impulsada se redujo posteriormente. Por lo tanto, nos informan de que CK2 participa en el mantenimiento de células madre cancerosas mediante la regulación de la señalización de Hh /Gli.
Vía
Hh puede desempeñar un papel clave en el mantenimiento de células madre cancerosas, sin embargo los objetivos druggable en vía Hh es muy limitada. CK2 proporcionar un objetivo adicional para la inhibición de la señalización de Hh /Gli. inhibidores de CK2 no han sido ampliamente desarrollado como agentes terapéuticos, en parte debido a que el bolsillo de unión a ATP de CK2 no es tan druggable como algunas otras proteínas quinasas [50], [53], [54]. Hasta la fecha, sólo un inhibidor de la CK2 de molécula pequeña se ha introducido a los ensayos clínicos como un fármaco potencial anticanceroso. CX-4945, un inhibidor de molécula pequeña CK2 altamente selectiva, es un agente terapéutico oral de primera en su clase prometedora de orientación múltiples cánceres humanos. CX-4945 muestra un perfil de seguridad favorable en ensayos clínicos de fase I [55]. Además, el CIGB-300 (un medicamento a base de péptidos sintéticos focalización del dominio CK2 phosphoaceptor) ha demostrado ser seguro y de beneficio clínico en Fase I de ensayos de cáncer cervical [56].
En resumen, informamos que CK2 es un regulador positivo en la vía de señalización Hh /Gli, y la inhibición de CK2α regula a la baja Hh /Gli señalización en células de cáncer de pulmón humano. Dada la creciente importancia de la señalización de Hh /Gli en la iniciación y progresión del tumor, nuestros resultados proporcionan una evidencia importante que los beneficios potenciales de los inhibidores de CK2.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y tratamiento de moléculas pequeñas
líneas celulares de cáncer humano (A549, A427, H460, H1299, H1650, H358, H838 y H322) se obtuvieron de la American Type Culture Collections (Manassas, VA). Las células se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI-1640 suplementado con suero inactivado por calor 10% fetal bovino, penicilina (100 mg /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Todas las células se cultivaron de forma rutinaria a 37 ° C en un incubador húmedo con 5% de CO2. El tratamiento con CX-4945 (Synkinase, San Diego, CA) y TBB (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en DMSO se administró a varias dosis (1, 3 y 10 micras de CX4945; 10, 30, 50 M de TBB ). Las células fueron cultivadas en medio durante 48 horas después del tratamiento.
siRNA y transfección de ADN plásmido
siRNAs
CK2α, CK2α 'y CK2β-específicos (en-blanco
más
SmartPool) y el ARN de control se compraron de Thermo Scientific (Waltham, MA). En resumen, las células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos como 10
5 células /pocillo un día antes de la transfección, con un objetivo de 30 a 50% de confluencia en el momento de la transfección. Las células fueron transfectadas con 50 nmol /L de ARNsi utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. la inhibición adecuada de la caída siRNA mediada fue confirmada por RT-PCR. Los pcDNA3.1-CK2α o de control de vectores de plásmido pcDNA3.1-LacZ fueron transfectadas en las células A549 (0,5 g /ml en placas de 24 pocillos) usando Lipofectamine reactivo de transfección 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron por RT-PCR y Western blot o se utilizan en ensayos de reportero a las 48 horas post-transfección.
Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RT-PCR
Aislamiento Semi-cuantitativa de ARN se realizado utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). El ARN total de pulmón humano se adquirió en Applied Biosystems (Foster City, CA). Cinco cien ng de ARN total se convirtió en cDNA 20 l utilizando iScript cDNA Synthesis Kits (Bio-Rad, Hercules, CA,) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. bandas de PCR se visualizaron bajo luz UV y se fotografiaron.
Real-Time RT-PCR
Un total de 2 l de la reacción de transcripción inversa se utilizó como molde para la detección en tiempo real de la expresión Gli1 utilizando la tecnología TaqMan en un Applied Biosystems 7000 secuencia sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA). La expresión génica se cuantificó para los genes ensayados (Gli1, PTC1, PTC2 y ciclina E1) y de control de gen endógeno b-glucuronidasa (GUSB) usando las secuencias de cebador y sonda comercialmente (Applied Biosystems).
Western Blot y análisis la tinción de inmunofluorescencia
proteína total se extrajo de M-PER proteínas de mamíferos reactivo de extracción (Thermo) a partir de líneas celulares añadido con fosfatasa cóctel inhibidor conjunto II (Calbiochem, San Diego, CA) y se completa inhibidor de la proteasa cócteles (Roche, Lewes , Reino Unido) de acuerdo con los protocolos de fabrica '. Las proteínas se separaron en geles de gradiente de 4-15% de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Bellerica, MA). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-CK2α (Millipore), anti-Gli1 (Cell Signaling, Beverly, MA), anti-ABCG2 (Millipore), y anti-GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD). Después de haber sido incubadas con anticuerpos secundarios apropiados, los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante el uso de un sistema de análisis de transferencia de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La tinción de inmunofluorescencia se llevó a cabo. El examen se realizó mediante barrido láser microscopía confocal (LSM510, Carl Zeiss, Oakland, CA). Las imágenes digitales de las rebanadas individuales confocal se prepararon utilizando Adobe Photoshop 6.0.
La degradación de proteínas Ensayo
El CK2α- y el control de las células A549 siRNA-transtected fueron expuestos a 50 mg cicloheximida /ml y se recogieron en el los puntos de tiempo de 0 y 6 horas. proteínas celulares totales se extrajeron y se analizaron por Western blot.
Ensayos de luciferasa
Para medir la actividad transcripcional mediada Hh-Gli, el reportero de la luciferasa construye, 8 × tipo salvaje sitio de unión Gli (8 × Gli
peso Luc) o 8 × mutante sitio de unión Gli (8 × Gli
mut Luc) plásmidos [57] y un vector de expresión Gli1 humana (pcDNA3.1-Gli1) se co-transfectaron en A549 las células en placas de 24 pocillos. El
Renilla luciferasa
plásmido PRL-TK (Promega, Madison, WI), cuya expresión está dirigida por el promotor del gen de la timidina quinasa de limpieza, fue co-transfectadas para normalizar la eficiencia de transfección. Todos los experimentos de transfección se realizaron utilizando el Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se lisaron 24 h las células y se realizaron ensayos de luciferasa como se describe anteriormente [58]. Los resultados se expresan como veces de inducción, que es la relación de la actividad luciferasa inducida en las células transfectadas con Gli relativos a la actividad luciferasa basal en las células A549 de control transfectadas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado;