Extracto
La vía de CDK /Rb /E2F es comúnmente alterado en el cáncer de pulmón, y por lo tanto, se predice que el bloqueo de la vía E2F tendría potencial terapéutico. Para probar esta hipótesis, hemos examinado la actividad de HLM006474 (una molécula pequeña inhibidor de pan-E2F) en líneas celulares de cáncer de pulmón como agente único y en combinación con otros compuestos. HLM006474 reduce la viabilidad de ambas líneas SCLC y NSCLC con un biológica IC
50 que varía entre 15 y 75 mM, pero sin diferencias significativas entre los grupos. Combinación de HLM006474 con cisplatino y gemcitabina demuestran poca sinergia; sin embargo, HLM006474 sinergia con paclitaxel. Sorprendentemente, hemos descubierto que el tratamiento breve de las células con HLM006474 condujo a un aumento de los niveles de proteína E2F3 (debido a la des-represión de estos sitios de promotor). Dado que la sensibilidad paclitaxel se ha demostrado que se correlaciona con los niveles de E2F3, la hipótesis de que la sinergia HLM006474 con paclitaxel puede estar mediada por la inducción transitoria de E2F3. Para probar esto, células H1299 se agotaron de E2F3a y E2F3b con siRNA y tratados con paclitaxel. Los ensayos de proliferación mostraron que ambos siRNAs redujo significativamente la sensibilidad paclitaxel, como se esperaba. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que HLM006474 puede tener eficacia en el cáncer de pulmón y puede ser útil en combinación con taxanos
Visto:. Kurtyka CA, Chen L, berro WD (2014) E2F Inhibición sinergia con paclitaxel en el cáncer de pulmón Líneas celulares. PLoS ONE 9 (5): e96357. doi: 10.1371 /journal.pone.0096357
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de diciembre de 2013; Aceptado: 4 Abril 2014; Publicado: 15 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Kurtyka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer (CA119997), el Programa de Investigación del cáncer Bankhead Coley del Departamento de Salud de Florida (FDH 08BB-05) y el Centro de cáncer Moffitt. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. WDC es un inventor en la patente US 8,202,886 B2 en poder de la Universidad del Sur de Florida. De lo contrario, los autores no tienen ningún conflicto de intereses. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
La proteína retinoblastoma (Rb comúnmente llamado) es ampliamente reconocido como uno de los supresores tumorales más importantes en humanos. Junto con los similares "de bolsillo" proteínas p107 y p130, que es responsable de la regulación de la progresión del ciclo celular [1]. La familia Rb regula el ciclo celular a través de la unión y la inhibición de la actividad transcripcional de los primeros 2 factores (E2Fs) y su actividad supresora de tumores está estrechamente relacionado con esta función [2]. Cuando está fosforilada (típicamente por las CDK 2, 4, y 6 en G1), Rb se inactiva, liberando así E2Fs y permitiendo la progresión del ciclo celular [3]. Con el fin de evitar la entrada del ciclo celular aberrante, inhibidores de CDK como CDKN2A (comúnmente conocido como p16) impiden que las CDK de fosforilación de Rb células y de la fuerza para permanecer en G1 [4].
Dependiendo del contexto, miembros de la familia E2F puede servir como activadores transcripcionales que impulsan la progresión del ciclo celular o represores transcripcionales que limiten de progresión del ciclo celular [5]. Como activadores, E2Fs se reconocen como importantes en la proliferación a través de su activación de la transcripción de genes S de fase. E2Fs activan la transcripción a través de la asociación con la histona acetiltransferasa (HAT) la actividad [6], [7]. Como represores, E2Fs inhibir la transcripción de genes utilizados en entrada en la fase S mediante la unión a sus promotores y la represión de la transcripción a través de su capacidad para unirse a Rb y otras proteínas de bolsillo, que a su vez reclutan modificadores de la cromatina, tales como las histona desacetilasas (HDACs) [6] - [8]. De todos los miembros de la familia E2F, E2F3 es la única requerida individualmente para la proliferación celular que se produzca [9] - [13]. E2F3 es importante para la transcripción de varios genes de la entrada en la fase S y se ha demostrado que tienen un papel en la transcripción de genes necesarios para la G2 fases /m (tales como Aurora quinasa A [14], CDC2 [15], y ciclina B1 [15], [dieciséis]). Existen dos isoformas de E2F3, E2F3a y E2F3b, cada uno resultante de la transcripción a dos promotores diferentes. niveles E2F3b permanecen constantes durante todo el ciclo celular, mientras que los niveles E2F3a fluctúan y alcanzan picos de los niveles de expresión de todo el G1 /S transición [17] - [19]. Los estudios revelan que los ratones knockout E2F3a y E2F3b son generalmente compensatoria para los unos a los otros [20], [21], pero la supresión de las dos isoformas es letal [9], [20]. Finalmente, E2F3 está más altamente expresado en múltiples tipos de cáncer (véase [5] para una revisión), incluyendo de pulmón [22] y su actividad se ha correlacionado con un aumento de la sensibilidad al tratamiento con taxanos en el cáncer de ovario [23] y el cáncer de mama ER-negativo [ ,,,0],24].
el /CDK vía Rb /E2F se interrumpe en prácticamente todos los casos de cáncer de pulmón humano, la causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [25]. En el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), lo que representa aproximadamente el 15% de los cánceres de pulmón, el mecanismo más común de interrupción ruta de Rb es la mutación de la proteína Rb sí mismo. De hecho, aproximadamente el 90% de los cánceres de pulmón de células carecen de una proteína Rb funcional [26], [27]. Por el contrario, en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cuentas de mutación Rb para el 15-30% de estos tipos de cáncer [26], [28], y la desregulación de la vía de CDK /Rb /E2F ocurre con más frecuencia a través del silenciamiento inhibidor de CDK p16 [29] - [32]. En la mayoría de los casos de CPNM donde el
RB1
gen está intacto, los inhibidores de CDK4 y 6 representaría una posible manera de apuntar a esta vía. Esta hipótesis ha sido examinado en varios ensayos clínicos y resultados preliminares en el cáncer de mama son muy prometedores [33] - [35]., Lo que sugiere que los inhibidores de la vía de CDK /Rb /E2F pueden tener un papel importante que desempeñar en el tratamiento de varios tipos de cáncer
el beneficio de inhibidores de CDK puede estar limitada a tumores en los que la proteína de Rb permanece WT y funcional, y por lo tanto, los reactivos que podrían dirigirse a esta vía aguas abajo de Rb puede ser útil en los cánceres donde Rb es comúnmente mutado (tales como cáncer de pulmón). Para probar esta hipótesis, hemos examinado la actividad de HLM006474 contra un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón. HLM006474 (también discutido aquí como 6474) es una molécula pequeña inhibidor de pan-de E2F-DNA de unión [36]. Aunque la IC
50 de HLM006474 es relativamente alta (30 mM), se ha encontrado uso como un compuesto útil [37] - [40].
In vivo
estudios indican que los efectos de tratamiento 6474 en diferentes líneas celulares incluyen una reducción en la proliferación celular y un aumento de la apoptosis y la reducción de la invasión en un sistema modelo de cultivo de tejido tridimensional [36]. HLM006474 puede ser útil en la prevención del cáncer por que conduce a un aumento de la apoptosis y la disminución de la proliferación en células tumorigénicas madre embrionarias humanas [39], así como que conduce a una disminución de la formación de tumores en los embriones de ratón propensas a retinoblastoma [40]. En conjunto, estos resultados sugieren que la interferencia con la actividad de E2F utilizando moléculas pequeñas pueden tener aplicación clínica en la terapia del cáncer. En el presente trabajo, proporcionamos una caracterización más completa de 6474 en el contexto del cáncer de pulmón. HLM006474 reduce la viabilidad de una amplia gama de líneas celulares con una biológica IC
50 que varía entre 15 y 75 mM. Combinación de HLM006474 con agentes quimioterapéuticos comunes cisplatino y gemcitabina demuestra poca sinergia; sin embargo, HLM006474 sinergia con paclitaxel. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que HLM006474 puede tener eficacia contra cánceres en los que está desregulado E2F y puede ser útil en combinación con otros fármacos que se dirigen a los componentes del ciclo celular.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares y compuestos químicos
líneas celulares de cáncer de pulmón se obtuvieron a partir de ATCC o originadores y fueron proporcionados por la espora Moffitt en las instalaciones de la célula Core cáncer de pulmón. Todas las líneas son autenticados por genotipo y mantenerse libres de
Mycoplasma
. CEP líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS y 1% penicilina /estreptomicina. líneas celulares de NSCLC se cultivaron en RPMI 1640 con 10% de FBS sin antibióticos. HLM006474 fue sintetizado y validado por el Moffitt Chemistry Core como se describe anteriormente [36]. Gemcitabina (Gemzar, Eli Lilly) se adquirió a través de la Farmacia Moffitt y se disuelve en agua. Cisplatino y paclitaxel fueron adquiridos de Sigma y soluciones de reserva concentradas se prepararon en dimetilsulfóxido.
siRNA desmontables
Las células en placas a ~ 50% de confluencia en placas de 6 pocillos fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Vida Technologies) según las instrucciones del vendedor con 200 pmol de cualquiera siGENOME no director siRNA#2 (Dharmacon) o siRNA dirigidos E2F3a o E2F3b como se describe en un artículo de Hurst
et al
[41]. Las células se recogieron cuatro horas después de la transfección para ensayo de viabilidad celular (como se describe a continuación). Las células restantes se re-sembraron y se recogieron para análisis de transferencia de Western 24 horas después de la transfección.
Ensayos de viabilidad
Se evaluó la actividad antiproliferativa de los compuestos y de sus combinaciones usando un alto rendimiento CellTiter-Blue ensayo de viabilidad celular (Promega), como se describe anteriormente [42]. Para los ensayos, 1000 células en 24 l se sembraron en placas de 384 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO
2. El día siguiente, se diluyeron los fármacos en los medios de comunicación y 6 l de estas diluciones a los pocillos apropiados utilizando una estación de pipeteado automática. Cuatro pocillos replicados se utilizaron para cada concentración de fármaco. Las células se incubaron con el fármaco durante 120 horas, en cuyo momento, se añadió 5 l de reactivo CellTiter-Blue (Promega Corp., Madison, WI). La viabilidad celular se evaluó por la capacidad de las células tratadas restantes para bioreduce resazurina a resorufina (579 nm Ex /584 nm Em). Se leyó la fluorescencia con un lector de microplacas Synergy HT (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). IC
50 se determinaron usando un sigmoidal de regresión modelo de equilibrio usando XLfit versión 4.3.2 (ID Business Solutions Ltd.) y se define como la concentración de fármaco requerida para una reducción de 50% en el crecimiento /viabilidad. Para 3- (2-il-4,5-dimetiltiazol) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS) ensayos de viabilidad celular, se añadió CellTiter 96 Una solución acuosa de Promega según las instrucciones de los proveedores a las células durante 2 horas después del tratamiento con el fármaco a la dosis observado durante 72 horas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
índices de combinación
El IC
se utilizaron 50 valores obtenidos a partir de ensayos de viabilidad celular de drogas individuales para diseñar experimentos de combinación. Para 6474 combinaciones con cisplatino, gemcitabina y paclitaxel estas relaciones fueron de 1:01, y 500:1 4000:1, respectivamente. Para los experimentos de combinación de fármacos, se realizaron los ensayos de viabilidad celular y los resultados se analizaron para sinérgicos, aditivos o efectos antagonistas utilizando el método del índice de combinación (IC) desarrollado por Chou y Talalay [43]. Combinación de índices CI & lt; 1, CI = 1, y CI & gt; 1 indican sinergia, efecto aditivo y antagonismo, respectivamente
Los anticuerpos y Western Blot
Las transferencias Western se realizaron como se describe anteriormente [36. ], [44], [45]. Brevemente, los lisados de células enteras se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. La detección de las proteínas se realizó utilizando anticuerpos secundarios de rábano picante conjugada con peroxidasa de y aumento de quimioluminiscencia (ECL) de Amersham o Thermo Scientific. Varios anticuerpos utilizados incluyen E2F1 (C-20, sc-193, Santa Cruz), E2F3 (C-18, sc-878, Santa Cruz), PARP (# 9542L, Cell Signaling Technology), y monoclonal β-actina (clon AC -15, gato no: A5441, Sigma). Adobe Photoshop CS se utilizó para cuantificar las lecturas de intensidad de la banda de transferencia Western directamente de las películas expuestas utilizando la imagen invertida de la película escaneada herramienta Marco rectangular /histograma y. Este mismo cuadrado se utilizó para todas las lecturas de la banda más con el fin de asegurar que la misma zona se analizó para cada banda. Las lecturas fueron ajustados para dar cuenta de actina y de fondo y de forma arbitraria normalizado a la línea de células H23 (asignado un valor de 1).
En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
El ARN se extrae de las células usando el kit RNeasy Mini de Qiagen. a continuación, reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR) se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). Después, este ADNc se utilizó en PCR en tiempo real utilizando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) o Perfecta SYBR Green Supermix (Quanta Biosciences, VWR). E2F1, E2F3, E2F4, tubulina, MCM2, MCM10, CCNE2, y GAPDH primers recibieron la orden de Integrated DNA Technologies. Las secuencias de cebador son los siguientes: E2F1 F (5'-GCTGGACCACCTGATGAATATC-3 '), E2F1 R (5'-TCTGCAATGCTACGAAGGTCCTG-3'), E2F3a /b F (5'-CGTCTCTTGGTCTGCTCAC-3 '), E2F3a /b R (5 '-CACTTCTGCTGCCTTGTTC-3'), E2F4 F (5'-CTGAAGAGTGTGAGTGGTC -3 '), E2F4 R (5'-GCAGAGGTGGAGGTGTAG -3'), tubulina F (5'-GGGGCTGGGTAAATGGCAAA-3 '), tubulina R (5' TGGCACTGGCTCTGGGTTCG-3 '), MCM2 F (5'-CTGTGTGTGGTGAGGGACAC-3'), MCM2 R (5'-CTTGTCCTGGTCCATCTGGT-3 '), MCM10 F (5'-CGTCAGTGAGCAGCATGAAT-3'), MCM10 R (5'-TCCCGTTCCCATTTGTAGAG- 3 '), CCNE2 F (5'-CAGGTTTGGAGTGGGACAGT-3'), CCNE2 R (5'-ACTTCCTCCAGCATAGCCAA-3 '), GAPDH F (5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'), y GAPDH R (5'-3-TTGATTTTGGAGGGATCTCG ').
el análisis estadístico
para el análisis en tiempo real PCR para el experimento punto de tiempo, la diferencia entre la expresión de cada gen experimental (E2F1, E2F3, E2F4, CCNE2, MCM2, y MCM10) y la expresión del gen de control (tubulina) se calculó para cada línea celular en cada punto de tiempo. La diferencia entre cada uno de los no-0 puntos temporales hora y las lecturas de punto de tiempo 0 hora para cada gen en cada línea celular se calculó mediante pruebas t con corrección de Welch. Los paclitaxel IC
50 años fueron log-transformados para mejorar la normalidad. La correlación de E2F3 ARNm y la expresión de proteínas con paclitaxel registro IC
50 años se calculó mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Wilcoxon pruebas de suma de rangos se utilizaron para explorar la diferencia de la viabilidad celular en el tratamiento de siRNA de control, ya sea con o tratamiento E2F3a E2F3b siRNA.
Resultados
HLM006474 tiene una amplia actividad antiproliferativa
para examinar el potencial de 6474 en el tratamiento de cáncer de pulmón, se determinó el IC 6474
50 en diecisiete líneas celulares de cáncer de pulmón (Tabla 1). Este análisis incluyó ocho no pequeñas líneas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y nueve pequeñas líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). En este ensayo de viabilidad, las células se colocaron en placas a baja densidad en el día cero y se cultivaron en presencia de diversas concentraciones 6474 durante cinco días. Después de cinco días, la viabilidad relativa de células se determinó por tinción con CT-Blue (Promega). Los resultados revelan que los 6474 IC
50 intervalos de ~ 15 ~ 75 a M a través de las líneas celulares de diecisiete. El IC biológica promedio
50 de todas las líneas de células fue 31,4 (6,1) micras, que es esencialmente idéntica a la bioquímica IC
50 de 29,8 (± 7,6 M, se informó anteriormente [36]. No hubo estadísticamente diferencia significativa entre SCLC y NSCLC.
tratamientos cortos con plomo HLM006474 a una mayor expresión de varios genes regulados por E2F conocidos
Como un componente de nuestro análisis de HLM006474, hemos examinado la expresión de miembros de la familia E2F después del tratamiento por transferencia de Western. líneas celulares de NSCLC H292 y H1299 se trataron con 60 mM HLM006474 de 0, 3, 6, 9, 12, y 24 horas y se analizaron mediante transferencia Western (Figura 1 a). Sorprendentemente, la proteína los niveles de ambas isoformas E2F3a y B aumentaron en puntos de tiempo (por lo general alrededor de 6-9 horas). los niveles de la proteína E2F1 aumentaron más modestamente después del tratamiento, con un pico entre 6 y 12 horas y regresando a los niveles basales después de 24 horas. en real análisis PCR en tiempo con la tubulina como control, los niveles de E2F3 mRNA aumentó significativamente después de 3 horas de tratamiento y luego se redujo en cada punto de tiempo posterior (Figura 1B), mientras que E2F1 mRNA niveles de expresión se incrementaron significativamente después de tiempos de tratamiento cortos en H292 sola (Figura 1C ) y los niveles de E2F4 se mantuvo constante o disminuido en cada punto de tiempo (Figura 1D). También se observó que algunos genes comúnmente regulados por E2Fs; MCM10 (Figura 1E), MCM2 (Figura 1F), y CCNE2 (Figura 1G); fueron más altamente expresado en puntos de tiempo tempranos de una manera comparable a los cambios observados en la expresión de E2F3 mRNA. Los resultados mostrados en la Figura 1 sugieren que el tratamiento con un inhibidor de la unión puede resultar en la activación de los objetivos regulados por E2F, incluyendo miembros de la familia E2F de auto-regulado E2F-DNA. La familia E2F es conocido para reprimir activamente la transcripción [46] - [49], y por lo tanto, proponemos que el tratamiento con HLM006474 puede desplazar complejos de E2F-represivas y de ese modo activar la transcripción de genes que son predominantemente reprimidos por complejos de E2F E2F-regular. Para explorar esta posibilidad, hemos utilizado siRNA específicamente contra E2F1, E2F3a, E2F3b, E2F4 y Rb para agotar dos líneas celulares de cáncer de varios complejos de E2F. Microarray se realizó para examinar el efecto de estos siRNAs en la expresión de una firma E2F previamente definido sobre la base de E2F3 sobreexpresión [50]. Los resultados, que serán publicados en otro lugar, demuestran que el agotamiento de los resultados individuales en muchos E2Fs firma genes E2F de ser activado, como se podría esperar de un modelo de la represión.
Un
. Las líneas celulares de cáncer H1299 y H292 se trataron con 60 HLM006474 M durante 0, 3, 6, 9, 12, y 24 horas, después se recogieron y examinados a través de transferencias de Western. Los aumentos modestos en E2F1 y más dramáticos incrementos en los niveles de proteína E2F3a y B se observaron en el punto de tiempo temprano en ambas líneas celulares.
B-D
. ARNm se extrae de células que fueron tratadas como se describe en 1A, convertido a cDNA utilizando RT-PCR, y se analizó para los niveles de expresión de E3F3 (
B
), E2F1 (
C
), y E2F4 (
D
) usando PCR en tiempo real y la tubulina como control. tratamientos cortos con 6474 niveles alterados de expresión de ARNm de E2F3 y E2F1, E2F4, pero no.
E-G.
La expresión de ARNm de genes conocidos comúnmente regulados por E2Fs se analizaron de una manera similar a la descripción anterior en 1B-D. Los niveles de expresión de MCM10 (
E
), MCM2 (
F
), y CCNE2 (
G
) mRNA se analizaron con la tubulina como control y se observó que todos más altamente expresado después de los tratamientos cortos con 6474. Notas: ns representa no significativa, * representa p & lt; 0,05, ** p representa. & lt; 0,01
HLM006474 sinergia con paclitaxel
Una vez establecido que 6474 tiene efectos antiproliferativos sobre líneas celulares de cáncer de pulmón , pero puede influir en los genes regulados por E2F de una manera compleja, hemos tratado de determinar si 6474 habría sinergia con los fármacos quimioterapéuticos utilizados comúnmente en el tratamiento del cáncer de pulmón. células H1299 fueron tratados con 6474 solo y en combinación con cisplatino, gemcitabina y paclitaxel. Las combinaciones se eligieron con base en el CI
50 de las células a los compuestos individuales y los índices combinados se calcularon [43]. La Figura 2 revela que hay antagonismo entre 6474 y cisplatino (panel 2A, CI promedio 1,40) y gemcitabina (panel 2B, CI promedio 1,39). Por el contrario, 6474 sinergiza débilmente con paclitaxel (panel 2C, CI promedio de 0,98). Para estudiar más a fondo la naturaleza de la sinergia entre 6474 y paclitaxel, H1299 células fueron tratadas con dosis moderadas de cada fármaco solo o en combinación y utilizados en análisis de transferencia Western. La aparición de PARP escindida en las células tratadas con la combinación de fármacos confirma que la combinación de 6474 y paclitaxel induce más apoptosis que cualquier fármaco solo (Figura 2D). Para explorar si esta sinergia se observó en líneas celulares adicionales, que también examinó la línea celular de NSCLC H292. Como en el caso de las células H1299, 6474 sinérgicos con paclitaxel (panel 2G, CI promedio 0,96), pero no mostró sinergia con cisplatino (panel 2E, CI promedio 1,51) o gemcitabina (panel 2F, CI promedio 1,46).
a-C.
H1299 células fueron sometidas a ensayos de viabilidad en presencia de 6474 (HLM) en combinación con cisplatino (
Un
, CisPt), gemcitabina (
B
, Gem) y paclitaxel (
C
, Pac), tal como se indica (ver métodos). Los resultados revelan sinergia con paclitaxel (CI promedio 0,98) y el antagonismo con cisplatino y gemcitabina (CI promedio 1,40 y 1,39, respectivamente).
D
. transferencia de Western revela que en las células H1299 tratadas durante 72 horas con 20 M 6474 solo, 5 nM paclitaxel solo, o la combinación de los dos, 6474 y paclitaxel sinergia en la inducción de la escisión de PARP.
E CD -
G
. H292 fueron probados en ensayos de viabilidad similares para determinar la eficacia de 6474 (HLM) en combinación con cisplatino (
E
, CisPt), gemcitabina (
F
, Gem) y paclitaxel (
G
, Pac). Como se ve en las células H1299, 6474 sinergia con paclitaxel (CI promedio 0,96), pero es antagónica con cisplatino (CI promedio de 1,51) y gemcitabina (CI promedio de 1,46).
E2F3 niveles de sensibilidad a paclitaxel impacto
las observaciones de que un inhibidor de la E2F podría sinergia con paclitaxel y el aumento discutido previamente en los niveles de E2F3 después de los tratamientos de puntos de tiempo tempranos con HLM006474 sugerido que la actividad E2F3 podría desempeñar un papel en la sensibilidad a paclitaxel. PCR en tiempo real se utilizó para analizar la expresión endógena de E2F3 (con GAPDH que sirve como un control interno), y a continuación, estos valores se correlacionaron con la lógica paclitaxel
50 de cada línea celular (Figura 3A). Los lisados de diez líneas celulares de NSCLC se realizaron en transferencias de Western (Figura 3B) y densitométricamente analizaron utilizando β-actina como control. Estos niveles de E2F A continuación se representan frente a los correspondientes valores de la lógica paclitaxel
50 (Figura 3C). Tanto en la PCR en tiempo real y análisis de Western blot, una fuerte correlación inversa entre E2F3 y paclitaxel IC
50 se observó. Para probar más formalmente esta hipótesis, se utilizó siRNA para agotar las células H1299 de E2F3a y E2F3b y luego determina su sensibilidad a paclitaxel tal como se mide en ensayos de MTS. transferencia de Western revela una caída casi completa de los E2Fs específicas en las células H1299 (Fig 4A). Control de siRNAs no afectó la expresión de E2F. Como era de esperar, la figura 4B revela que las células con niveles disminuidos E2F3 fueron menos sensibles a paclitaxel.
Un
. ADNc a partir de diez líneas celulares de NSCLC se utilizaron en PCR en tiempo real para detectar los niveles de expresión endógenos E2F3 (en comparación con GAPDH como control). Los niveles de expresión se compararon con la lógica paclitaxel
50 de cada línea y se representan como se muestra.
B Opiniones. Los lisados de diez líneas celulares de cáncer se prepararon y se corrieron en un Western blot para detectar los niveles endógenos E2F3.
C
. Los valores de los niveles de expresión de proteínas analizadas densitométrica (en comparación con ß-actina como control) y luego se graficaron contra la lógica paclitaxel
50 por cada línea como se muestra.
. células H1299 se transfectaron transitoriamente con 200 pmol de control, E2F3a, o E2F3b siRNA y se recogieron después de 24 horas. Western blots de lisados de estas demuestran el grado de E2F caída.
B Opiniones. Se utilizaron ensayos de MTS para determinar la sensibilidad de cada línea celular a 50 nM paclitaxel. Las células con niveles disminuidos E2F3 eran más viable en presencia de paclitaxel que las células de control. Notas: * representa p & lt; 0,05, ** representa p & lt; 0,01
Conclusiones
La vía de CDK /Rb /E2F representa un buen objetivo para el tratamiento de diversos tumores sólidos.. A pesar de que el desarrollo ha sido lento debido a la toxicidad de los compuestos tempranas, inhibidores de CDK están comenzando a ganar tracción en los ensayos clínicos [33], [51], [52]. Proponemos que la orientación de la vía de CDK /Rb /E2F aún más aguas abajo, a nivel de E2F, también puede ser de valor. Por lo tanto, hemos examinado el potencial de un inhibidor de pan-E2F, HLM006474, en el tratamiento de cáncer de pulmón.
Proponemos el modelo de la Figura 5 para explicar nuestros resultados. En primer lugar, se observa que el tratamiento con 6474 lleva a un aumento transitorio de la proteína no sólo E2F3 y los niveles de expresión de ARNm, sino también un aumento en muchas otras transcripciones regulados por E2F. Estas observaciones contra-intuitivas se basan en la observación razonable de duración conocida que E2Fs son represores activos de la transcripción [46] - [49]; Sin embargo, ellos no plantean preocupaciones de que la inhibición complejo pan-E2F puede tener consecuencias no deseadas. Por lo tanto, los futuros compuestos dirigidos-E2F deben bloquear selectivamente la transcripción activando complejos de E2F y de la transcripción de repuesto reprimir complejos de E2F. En segundo lugar, creemos que los mayores niveles de E2F3 (y probablemente otros genes regulados por E2F) aumentan la sensibilidad de las células a paclitaxel. Basamos esta conclusión sobre la correlación observada entre los niveles normales y E2F3 sensibilidad paclitaxel, así como los resultados de los experimentos E2F3 siRNA. Esto documenta la primera relación entre los niveles de E2F3 y paclitaxel en NSCLC, a pesar de una relación entre los altos niveles de actividad E2F3 y aumento de la sensibilidad a paclitaxel se ha observado previamente en de ovario [23] y ER-negativo cáncer de mama [24]. El mecanismo por el cual E2F3 genera sensibilidad a paclitaxel es desconocida. Una posibilidad es que se relaciona directamente con el papel de E2F3 en el ciclo celular. Por ejemplo, en las células con altos niveles de E2F3, sería de esperar que las células proliferarían más, dando así las células una mayor oportunidad de entrar en la fase M (donde paclitaxel sería más eficaz). Sin embargo, esta explicación solo sugiere que estas células deben ser más sensibles a la gemcitabina, así debido a entrar en la fase S con más frecuencia. Puede ser que sea más probable que una mayor sensibilidad a paclitaxel se debe a genes reguladores de la apoptosis convertirse en altamente expresado debido al aumento de E2F3. Además, se ha observado previamente que la sobreexpresión de E2F3 conduce a un enriquecimiento de los genes que son [23] relacionados con microtúbulos, por lo que este podría quizás explicar las correlaciones entre los niveles que vemos E2F3 y la sensibilidad paclitaxel. Del mismo modo, como se ha mencionado anteriormente, E2F3 se ha observado que tienen un papel en la G2 /M puesto de control a través de su regulación de la expresión de Aurora quinasa A [14], CDC2 [15], y ciclina B1 [15], [16], que también puede apuntar a niveles más altos de E2F3 que conduce a un aumento de las células que entran en que fase del ciclo celular y tal vez entonces aumentar la sensibilidad a paclitaxel.
en las células no tratadas, E2F pareja /dimerización (DP) /complejos de Rb predominan, y por lo tanto, los niveles de E2F3 son relativamente bajo (así como muchos otros genes regulados por E2F). El tratamiento con HLM006474 interrumpe los complejos E2F /DP /Rb represivas de unión al ADN, lo que resulta en aumento de la transcripción de E2F3 (así como muchos otros genes regulados por E2F). En este modelo, los niveles elevados de E2F3 sensibilizar a las células al tratamiento con taxanos, como se ha demostrado anteriormente, a través de un mecanismo desconocido.
Hemos demostrado que HLM006474 es eficaz en líneas celulares de cáncer de pulmón. Además, hemos demostrado que 6.474 sinergiza bien con paclitaxel, potencialmente debido a los efectos de 6474 sobre los niveles de E2F3. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la inhibición potente, activador específico E2F puede ser útil en el tratamiento de NSCLC en el futuro (especialmente en combinación con otros agentes), y que los niveles de E2F3 puede ser un buen indicador de la sensibilidad paclitaxel en NSCLC.
Reconocimientos
las muchas donaciones generosas de los reactivos se reconoció en los Materiales y Métodos.
Dr. Fumi Kinose de SPORE de Moffitt en las instalaciones de la célula del cáncer de pulmón Core proporcionado validado líneas celulares, incluidas las que amablemente donado por el laboratorio de John D. Minna en la Universidad de Texas Southwestern en Dallas. El Dr. estiércol-Tsa Chen y Jimmy Fulp de Moffitt de Bioestadística Core realizó el análisis estadístico. Drs. Christopher L. Cubitt y Shumin Zhang, de Terapéutica Experimental de Moffitt Core realizaron ensayos de viabilidad y análisis de datos.