Extracto
inhibidores de HSP90 están actualmente en evaluación clínica en combinación con fármacos antimitóticos en la no cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC), pero se sabe poco sobre los efectos celulares de esta nueva combinación de fármacos. Por lo tanto, se investigó el mecanismo molecular de acción de IPI-504 (retaspimycin HCl), un inhibidor potente y selectivo de HSP90, en combinación con el docetaxel agente microtúbulos orientación (MTA), en modelos preclínicos de NSCLC. Se identificaron un subconjunto de líneas celulares de NSCLC en los que estos fármacos actúan en sinergia para mejorar la muerte celular. modelos de xenoinjertos de NSCLC demostraron la inhibición del crecimiento del tumor, y en algunos casos, la regresión en respuesta al tratamiento de combinación. El tratamiento con IPI-504 mejora los efectos antimitóticos de docetaxel que conducen a la hipótesis de que se requiere que el punto de control mitótico para la respuesta a la combinación de fármacos. En apoyo de esta hipótesis, anulando el punto de control con un inhibidor de quinasa Aurora disminuido la sinergia muerte de las células del IPI-504 y docetaxel. Para investigar la base molecular de la sinergia, una imparcial etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular se empleó (SILAC) aproximación proteómica. Varios reguladores mitótico, incluidos los componentes de la ubiquitina ligasa, promoción de complejos anafase (APC /C), fueron específicamente regulados hacia abajo en respuesta al tratamiento combinado. La pérdida de la APC /C de RNAi células a docetaxel sensibilizado y mejoró sus efectos antimicóticos. El tratamiento con un inhibidor de Plk1 (BI2536) también sensibiliza las células para IPI-504, lo que indica que los efectos de combinación pueden ser ampliamente aplicable a otras clases de inhibidores de la mitosis. Nuestros datos proporcionan un fundamento para el ensayo preclínico la combinación de IPI-504 y docetaxel en el CPNM
Visto:. O'Connell aC, O'Callaghan K, B Tillotson, Douglas M, N Hafeez, West KA, et Alabama. (2014) La inhibición de HSP90 Mejora anti-mitótica inducida por medicamentos mitótico detención y muerte celular en modelos preclínicos de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10.1371 /journal.pone.0115228
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2014; Aceptado: noviembre 20, 2014; Publicado: December 26, 2014
Derechos de Autor © 2014 O'Connell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses: Los autores desean más aclarar que en el momento en que el trabajo fue hecho los autores eran empleados y accionistas de Infinity Pharmaceuticals, Inc. Esto no altera su adhesión a las políticas de PLoS ONE datos y materiales de uso compartido.
Introducción
el mitótico, o husillo de montaje puesto de control ayuda a mantener la integridad genómica mediante la prevención de la missegregation de cromosomas. Un sistema de vigilancia altamente orquestada compuesta de numerosas proteínas detecta cinetocoros no unidas, o falta de tensión apropiada a través del huso mitótico, provocando el denominado "respuesta de punto de control", que conduce a la detención mitótica. La división celular normal requiere exitoso paso por el puesto de control mitótico. El incumplimiento de requisitos de punto de control dentro de un plazo relativamente corto (1-2 días) puede dar lugar a aneuploidía, la catástrofe mitótica, o deslizamiento mitótico seguido de una variedad de destinos celulares, incluyendo la muerte celular, la senescencia, o endorreduplicación [1]. Si bien los mecanismos por los que prolongan la mitosis conduce a la muerte celular no están claros, un papel para los miembros de la familia BCL2 anti-apoptóticos ha informado [2]. Durante un paro prolongado mitótico, la quinasa dependiente de ciclinas (CDK), las proteínas ciclina ciclina fosforilan
BCL2 Buscar miembros de la familia incluyendo BCL2, BCL-XL, y MCL 1. La fosforilación de BCL2 y BCL-XL da como resultado la liberación de proteínas pro-apoptóticas BAX /BAK; mientras que la fosforilación de MCL1 crea un sitio de reconocimiento para la ligasa E3, APC /CDC20, la orientación para la degradación proteasomal. redundancia funcional es probable que existan entre los
BCL2 Buscar miembros de la familia en la mediación de la respuesta de muerte celular a la mitosis prolongada.
Medicamentos antimitóticos que se dirigen a la dinámica de microtúbulos (MTA) son ampliamente utilizados en la clínica para el tratamiento de una amplia gama de tipos de cáncer. Estos incluyen agentes estabilizantes de microtúbulos, (taxanos, incluidos docetaxel y paclitaxel, y las epotilonas) y agentes de microtúbulos desestabilizar (incluyendo alcaloides de la vinca tales como vincristina y vinblastina) [3]. Además, Maytansines (DM1, DM4) y auristatinas (MMAE, MMAF) interactúan con el sitio de unión de la vinca en tubulina y se utilizan comúnmente como la toxina unida a conjugados de fármacos de anticuerpos [4]. Mientras que las células tumorales en división son susceptibles a la MTA, también se interrumpen otros procesos celulares dependiente de microtúbulos tales como el tráfico de vesículas, transporte neuronal, y la integridad del citoesqueleto, resultando en efectos secundarios no deseados incluso la neurotoxicidad y la toxicidad mieloide [5]. En un esfuerzo por superar estos efectos secundarios, fármacos antimicóticos que se dirigen a las proteínas de motor del husillo (KSP, Eg5) o quinasas mitóticas (Plk1, Aurora quinasa A, Aurora quinasa B) se están desarrollando, pero han tenido un éxito limitado hasta ahora en el clínica [6]. HSP90 es una chaperona molecular que es responsable de la plegamiento apropiado de numerosas proteínas de cliente, incluyendo muchos oncogenes y supresores de tumores mutados [7]. El inhibidor de la HSP90 IPI-504 ha demostrado una actividad antineoplásica en varios modelos preclínicos de cáncer, establecer el fundamento de su desarrollo clínico [7], [8], [9], [10], [11]. Curiosamente, la actividad sinérgica entre la inhibición y taxanos HSP90 se ha observado en modelos preclínicos de NSCLC [12] y los inhibidores de HSP90 se han evaluado en combinación con docetaxel en los estudios clínicos de NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Se identificaron un subconjunto de líneas celulares de NSCLC en los que IPI-504 y actuar en sinergia para docetaxel mejoran la muerte celular in vitro e inhiben el crecimiento del tumor in vivo. Debido a que la base molecular exacta para esta sinergia no se ha determinado, se investigó el mecanismo molecular de acción (MOA) de IPI-504 en combinación con docetaxel y otros antimitóticos. Nuestros estudios revelaron un MOA que implica un alargamiento dependiente de punto de control de la mitosis. Además, hemos identificado los componentes de APC /C como potencial de las nuevas proteínas cliente de HSP90, parcialmente responsables de la sinergia de drogas.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio se realizó en de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio impresos por el Consejo Nacional de Investigación de los Académicos Nacional. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Infinity Pharmaceuticals, Inc. Los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación de acuerdo con las directrices del IACUC. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer humano H292, A549, H522, H1993, H1793 obtenido de la American Type Culture Collection se mantuvieron durante varios pasajes por debajo del 5% CO
2 a 37 ° C en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich).
Los estudios en animales
de cinco a seis semanas de edad de sexo masculino NCR nu /nu atímicos fueron adquiridos de Taconic Farms. Los xenoinjertos se generaron mediante la implantación subcutánea de 1 a 5 × 10
6 células en el flanco derecho de los ratones, y el tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 120 a 300 mm
3. IPI-504 se administró intraperitonealmente dos veces por semana a una dosis de 50 mg /kg. Docetaxel (McKeeson Pharmaceuticals) se dosificó una vez por semana a 15 mg /kg (H1993, A549 y modelos de xenoinjerto H292) o 5 mg /kg (H292 modelo de xenoinjerto) por inyección intraperitoneal.
Los tumores se midieron tres veces por semana usando calibradores digitales y el volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: (longitud x anchura
2) /2. Los resultados se presentan como el volumen medio del tumor ± error estándar de la media (SEM).
La proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células /pocillo 24 h antes al tratamiento con combinaciones de IPI-504 y docetaxel como se indica. La proliferación celular se midió por Alamar Blue (Life Technologies) o Cell Titer Glo (Promega). La muerte celular se mide por el porcentaje de células positivas 7AAD (Guava ViaCount Flex) o por el porcentaje de la caspasa 3 células positivas escindidos en un ensayo basado en luminiscencia (Promega; caspasa-Glo3 /7)
estudios Synergy
los índices de combinación (IC) se determinaron por el método de Chou y Talalay [13] usando relaciones de drogas fijos y no fijos y software Calcusyn (Biosoft). valores & lt CI; 1 indican sinergia, con valores & lt;. 0.5 que indican sinergia robusto
Immunoblotting /inmunoprecipitación
Para la inmunotransferencia, las células se lisaron en tampón de lisis RIPA (Sigma-Aldrich), complementado con proteasa inhibidores (Roche) e inhibidores de fosfatasa (HALT; Thermo Fisher Scientific). Para las inmunoprecipitaciones HSP90, sedimentos de células se cosecharon de tratamiento de drogas mensaje en tampón de lisis no detergente (50 mM Tris pH 7,4, NaCl 20 mM, MgCl 2 mM
2, EDTA 1 mM, 10% de glicerol, comprimido inhibidor de proteasa (Roche) y inhibidores de la fosfatasa (Thermo Fisher Scientific)) seguido por tres ciclos de congelación descongelación secuenciales para lisis. Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo durante la noche a 4 ° C utilizando un anticuerpo monoclonal HSP90 (Santa Cruz) y perlas de sefarosa GammaBind G (GE Healthcare).
isótopos estables de etiquetado de aminoácidos en cultivo (SILAC) el etiquetado y la espectrometría de masas
el marcaje metabólico de las células H292 se llevó a cabo con arginina normal y lisina o variantes isotópicas más pesados de los dos aminoácidos L-lisina-HCl [
13C
6], L-arginina-HCl [
13C
6
15 N
4] con SILAC-Flex Media kit y arginina pesada comprado de Thermo Fisher Scientific Invitrogen de. Para reducir la complejidad de la muestra, inmunoprecipitaciones HSP90 se realizaron en células tratadas con fármaco y las proteínas se separaron por 1D-SDS-PAGE. Las proteínas de los cortes de gel se digirieron con tripsina porcina y se analizaron por LC-MS /MS. Los péptidos se limpiaron y se concentraron utilizando puntas etapa C18 (Proxeon) y se separaron mediante línea C18 de fase inversa nanoescala espectrometría de masa de cromatografía líquida tándem en una bomba Surveyor MS conectada a un gradiente lineal de 2 h LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) utilizando . La fragmentación de los 10 péptidos en cada muestra se realizó mediante la disociación inducida por colisión. MS archivos en bruto de LTQ-Orbitrap se analizaron mediante MaxQuant (versión 1.2.2.4) [14]. MS /MS espectros se registraron en contra de la versión de la base de datos señuelo IPI-humana 3.68 usando el motor de búsqueda de Andrómeda. Se utilizó una tasa de falso descubrimiento de 0,01 en ambos los niveles de péptidos y proteínas.
estudios de RNAi
H292 células fueron transfectadas con 30 nM siRNA utilizando RNAimax (Invitrogen). siRNAs fueron adquiridos de Thermo Fisher Scientific como en el blanco, más piscinas SMART (mezcla de 4 siRNAs individuales por gen). secuencias de SMART piscina siRNA son: no director (codificados) de control: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA; ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG; y ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Cuatro horas después de la transfección, las células se sembraron en placas de 96 pocillos, se trató con un ajuste de la dosis de docetaxel y cosechada por citometría de flujo (pH 3) o la proliferación celular (7AAD) 30 h o tratamiento posterior de drogas 72 h, respectivamente.
citometría de flujo
Los sedimentos celulares se recogieron por tripsinización, se fijaron en paraformaldehído al 4% a 37 ° C durante 15 min, se coloca en hielo durante 5 min, y después se sedimentaron y se resuspendieron en metanol enfriado en hielo durante 30 min en hielo. A continuación, los sedimentos celulares se lavaron en 1% de suero de albúmina bovina (BSA) en PBS dos veces seguido de incubación con un anticuerpo conjugado con FITC pH 3 por 2 h RT. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces con 1% BSA /PBS y se resuspendieron en 2 mg /ml de Hoechst (Molecular Probes) /PBS a 37 ° C durante 15 min. Se analizaron las células teñidas utilizando un flujo BD LSRII Fortessa citómetro. Se midieron las células positivas FITC a una longitud de onda de 488 nm, y el contenido de ADN se midió por tinción con Hoechst utilizando un láser UV. El análisis de datos se realizó utilizando el software FlowJo (V7.6.3).
Microscopía
imágenes de contraste de fase fueron capturados utilizando un software de punto Nikon Eclipse TE2000-S microscopio y para la adquisición de imágenes (V4.7) .
mitótico agitar-off
las células mitóticas fueron cosechadas por golpeteo manual de la matraz para separar las células mitóticas en suspensión. Se aislaron células mitóticas de los medios de comunicación por centrifugación (1500 rpm, 5 min), se lisaron en tampón RIPA y se incubaron en presencia o ausencia de fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich).
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos para HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), ciclina B (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), Aurora quinasa B (Bethyl Laboratories), MCL 1 ( Señalización celular Tecnología), GAPDH (Cell Signaling Technology), receptor de glucocorticoides (Cell Signaling Technology), y FITC-S10 fosfo-histona H3 (Cell Signaling Technology) se utilizaron para la inmunoprecipitación, inmunotransferencia y citometría de flujo. Aurora Un inhibidor /B (ZM447439) se adquirió de Merck Millipore y el inhibidor de Plk1 (BI2536) se adquirió de SelleckChem. IPI-504 se sintetizó en Infinity Pharmaceuticals, Inc.
Resultados
IPI-504 y docetaxel en el crecimiento del tumor reprimir combinación con CPNM en modelos de xenoinjertos de tumores
Para identificar las líneas celulares de cáncer demostrando en la sensibilidad in vivo a la combinación de IPI-504 y docetaxel, los ratones portadores de tumores de xenoinjertos (H1993, A549, H522 y H292) se trataron con vehículo, 50 mg /kg IPI-504 solo, 5 o 15 mg /docetaxel kg solo, o una combinación de 50 mg /kg IPI-504 y 5 o 15 mg /kg de docetaxel. El tratamiento con IPI-504 por sí solo inhibió el crecimiento tumoral con relación al vehículo en xenoinjertos H1993, A549, y H292 (22-48%), pero no tenía actividad en H522 xenoinjertos (Fig. 1). se observó una actividad de un solo agente en el tratamiento con docetaxel, lo que resulta en la inhibición del crecimiento en comparación con el vehículo en H1993, A549 y H292 xenoinjertos (56-69%) (Fig. 1A-C). En contraste con la actividad de agente único, se observó regresión del tumor en respuesta a combinada IPI-504 y docetaxel en H1993 y A549 modelos de xenoinjerto (Fig.s. 1A y B). la inhibición del crecimiento del tumor se ve reforzada por la combinación en comparación con cualquiera de los agentes solo solo en xenoinjertos de tumores H292 (Fig. 1C). Debido a la fuerte actividad de un solo agente en el modelo de xenoinjerto de H522, docetaxel se redujo la dosis de 15 a 5 mg /kg para el estudio de combinación. La combinación de 5 mg /kg de docetaxel y 50 mg /kg IPI-504 dio como resultado la inhibición del crecimiento del tumor 71% en comparación con vehículo (Fig. 1D). Estos datos indican posibles efectos sinérgicos de IPI-504 y docetaxel en la inhibición del crecimiento en modelos preclínicos de NSCLC.
NCR nu /nu ratones macho homocigotos se implantaron subcutáneamente con (A) H1993, (B) A549, (C ) H292 y H522 (D) y células tratadas con vehículo DMSO (círculos negros), IPI-504 (cuadrados verdes), DTX (diamantes azules), o la combinación de IPI-504 y DTX (triángulos rojos). IPI-504 se administró por inyección IP a una dosis de 50 mg /kg, dos veces a la semana para un total de 6 dosis. DTX se administró a 5 mg /kg (H522) o 15 mg /kg (H1993, A549, H292) por inyección IP, a la semana durante un total de 3 dosis. Los números en gráficos representan porcentaje medio de inhibición del crecimiento tumoral en relación con el brazo tratado con vehículo. Donde se indique, * denota significación estadística (p & lt; 0,05) entre el tratamiento combinado y los brazos de tratamiento DTX medidos en el día 30 (H1993, H549, H522) mediante la prueba t de Student
IPI-504 y docetaxel. en combinación espectáculo en sinergia in vitro en líneas celulares NSCLC
Para investigar el Ministerio de Agricultura de mejora en la inhibición de tumores in vivo con combinado IPI-504 y docetaxel, se determinó el efecto de la combinación sobre la muerte celular y la proliferación celular in vitro. Para los estudios de muerte celular en células H292, los índices de combinación se calcularon utilizando el método de la relación fármaco no fijo de Chou y Talalay, con valores de CI & lt; 1,0 indicativo de sinergia [13]. Las dosis de IPI-504 (75-125 nM) eficaz para la inhibición del crecimiento (S1A Fig.) Eran en gran medida ineficaz en produciendo una respuesta citotóxica por encima del control en las células H292 (la Fig. 2A, panel izquierdo). Sin embargo, la combinación de IPI-504 (75 a 125 nM) con 50 nM de docetaxel aumentó la muerte celular H292 del 24% (docetaxel solo) al 61-68% (combinación) con valores de CI indicativos de una fuerte sinergia (CI & lt; 0,2). Del mismo modo, la combinación de docetaxel (1-4 nM) con 2 M IPI-504 aumentó la muerte celular H292 de 37% (IPI-504 solo) a 63 a 71% (combinación) con valores de CI indicativos de sinergia (CI & lt; 0,5) ( Fig. 2A, panel derecho).
(muerte A) celular se midió 48 h post-tratamiento con combinaciones no fijadas relación fármaco de IPI-504 y docetaxel (DTX) por 7AAD en células H292. Índices de valores de combinación (IC) se calcularon usando el software Calcusyn (Biosoft) con valores & lt; 0,5 indicativo de una fuerte sinergia. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 4). Los valores para todos los tratamientos de combinación fueron estadísticamente significativas en comparación con los tratamientos con un único agente según lo determinado por la prueba t de Student (p & lt; 0,01). la muerte (B) celular se midió 30 h post-tratamiento de drogas en las células H1993 usando el ensayo de luminiscencia caspasa-Glo3 /7. Se muestran datos representativos (n = 2). (C) Las células fueron tratadas con relaciones de drogas fijos de IPI-504 y DTX durante 72 h; la proliferación celular se midió con Alamar Blue. Se muestra son isobologramas normalizados. D = dosis, ED
50 = dosis requerida para alcanzar la inhibición del crecimiento del 50%. Puntos en el gráfico se refieren a la relación de D /ED
50 para DTX en el eje x vs D /ED
50 para IPI-504 en el eje y. Los puntos de datos que caen en la diagonal representan aditividad; por encima de la diagonal, el antagonismo; debajo de la diagonal, la sinergia. (D) El tratamiento con inhibidor de Plk1 (BI2436) sensibiliza a las células H292 de IPI-504. células H292 se trataron durante 72 h con un ajuste de la dosis de IPI-504 solo (diamantes azules) o en combinación con 5 nM BI2536 (cuadrados rojos), seguido por el ensayo de muerte celular (7AAD). Las barras de error representan la desviación estándar (n = 2).
En las células H1993, combinaciones de (20 nm) dosis bajas (2 nM) o altas de docetaxel con dosis de IPI-504 que representa la CE
20 (14 nM), EC
50 (59 nM), o CE
80 (255 nM) para la inhibición del crecimiento (S1A Fig.) se examinaron para la muerte celular usando un ensayo de caspasa-Glo3 /7. Se observaron aumentos de 2 a 4 veces en la actividad de la caspasa con la combinación de fármacos con respecto a las respuestas de agente único para todo pero la combinación de menor dosis de 14 nM IPI-504 y 2 nM docetaxel (Fig. 2B).
Para los estudios de proliferación celular, un panel de líneas de células se trató con proporciones de medicamentos fijos. Se observó una respuesta sinérgica de la combinación de fármacos en las cuatro líneas celulares para los que se han observado con anterioridad efectos de combinación in vivo (Figura 2C;. A549, H1993, H292, H522 y). No había indicación de un efecto sinérgico de la combinación de fármacos en las células H1793, lo que sugiere que ciertas líneas celulares pueden no ser sensibles a esta combinación específica (Fig. 2C). Desafortunadamente, los estudios de xenoinjertos de confirmación no eran posibles con H1793, como las células no crecen en cualquiera de los ratones nu /nu o NOD /SCID inmunocomprometidos NCR. Se eligieron células H292 para la mayoría de los estudios mecanísticos posteriores, ya que muestran la respuesta sinérgica más fuerte y más consistente para la combinación de fármacos in vitro, sin embargo, otras líneas celulares se estudiaron también en casos específicos. En general, estos resultados indican que algunas líneas celulares de cáncer muestran una marcada disminución en la proliferación celular y el aumento de la muerte celular por apoptosis combinada con el IPI-504 y el tratamiento con docetaxel en comparación con los agentes individuales por sí solos.
Los inhibidores diseñados para apuntar quinasas mitóticas, como Plk1, representan una clase alternativa de antimitóticos al MTA. Plk1 es un importante regulador de la mitosis y una proteína HSP90 interactuar conocido [15]. Un inhibidor de PLK (BI2536) que presenta 10 veces mayor selectividad para Plk1 en comparación con PLK2 o PLK3 se utilizó para investigar los efectos de combinación con IPI-504. El tratamiento de células H292 con una CE
50 dosis de IPI-504 para la inhibición de crecimiento (175 nM) aumentó la muerte celular de 24% cuando se combina con vehículo a 45% cuando se combina con un EC
50 dosis de BI2536 para el crecimiento inhibición (5 nM) (Fig. 2D y S1B Fig.). Estos datos son consistentes con la hipótesis de que IPI-504 se combina con diferentes clases de antimitóticos para promover la muerte celular por mecanismos independientes.
IPI-504 y de la combinación docetaxel tratamiento da como resultado la acumulación de células mitóticas
Dado que los efectos antimitóticos de docetaxel son la base molecular para su toxicidad, probamos la predicción de que IPI-504 mejora los efectos antimitóticos de docetaxel. La población mitótico, también conocido como índice mitótico, se midió en células tratadas H292 en diversos puntos temporales y la dosis combinaciones de IPI-504 y docetaxel. La combinación de dosis baja (2 nM) docetaxel con IPI-504 dio como resultado un aumento transitorio en el índice mitótico (10% en 8 h a 26% en 30 h) antes de regresar a los niveles basales (4% a 48 h) (Fig. 3A). En contraste, el índice mitótico no subiera por encima de la línea de base en toda la duración del experimento en las células tratadas con cualquiera de IPI-504 o docetaxel como agentes individuales (Fig. 3A). Se observó un aumento transitorio similar en el índice mitótico seguido de un descenso en el tratamiento de las células H292 con una alta dosis de docetaxel (20 nM) como agente único (Fig. 3B, panel izquierdo). La adición de IPI-504 a docetaxel de alta dosis aumenta la amplitud y la duración de la detención de la mitosis (Fig. 3B, panel izquierdo). En contraste con las células H292, un aumento del índice mitótico no se observó en el tratamiento de células A549 con la dosis baja (2 nM) docetaxel y IPI-504 de combinación (datos no mostrados), indicando que la respuesta a esta combinación de fármacos puede ser de células tipo específico. Sin embargo, se observó un aumento en la amplitud y la duración de la detención mitótica en las células A549 tratadas con el docetaxel dosis alta (20 nM) y IPI-504 combinación en relación con docetaxel solo, comparable a la observada en las células H292 (Fig. 3B, a la derecha panel). Dado que los efectos observados de la mitosis en combinación con IPI-504 fueron consistentes a través de múltiples tipos de células, altas dosis de docetaxel fue elegido para estudios posteriores MOA.
EC
50 dosis de IPI-504 se determinaron por 72 h Titulación celular Glo (S1 A la Fig.). H292 (A, panel izquierdo B) y A549 (B, panel derecho) las células fueron tratadas con DMSO (diamantes azules), IPI-504 (cuadrados rojos), DTX (triángulos verdes) o IPI-504 /combinación DTX (círculos de color púrpura) y cosechado en los puntos de tiempo indicados para la presencia del marcador mitótico, pH 3. Se muestran datos representativos (n = 2).
El puesto de control mitótico es parcialmente responsable de los efectos de muerte celular de IPI-504 y docetaxel
La detención de la mitosis celular precede a la muerte en el IPI -504 y las células tratadas con docetaxel sugerido que la activación del puesto de control mitótico es un determinante importante de la respuesta de la muerte celular. Para probar esta hipótesis, se utilizó un inhibidor de quinasa Aurora A /Aurora B selectivo (ZM447439) para anular el control mitótico en las células H292 tratadas con la combinación de docetaxel IPI-504 y. El tratamiento de células H292 con ZM447439 resultó en la supresión de la IPI-504 y arresto mitótico puesto de control docetaxel inducida como se determina por una disminución marcada en el índice mitótico (Fig. 4A, panel izquierdo). imágenes de fase de contraste proporcionan una confirmación visual de las células redondeado (mitosis), prominente destacados en cultivos de células tratadas con docetaxel IPI-504 y en comparación con la morfología más aplanada de IPI-504, docetaxel, y ZM447439 células tratadas (Fig. 4A, derecha panel). Para evaluar el efecto de anulación de control mitótico, la muerte celular se midió después de tratamiento de las células H292 con IPI-504 y docetaxel en presencia o ausencia de ZM447439 (Fig. 4B). Si bien los efectos de la inhibición de la quinasa Aurora en la muerte celular mostraron efectos variables cuando se combina con cualquiera de IPI-504 o docetaxel como agentes únicos (S2 Fig.), El tratamiento con ZM447439 rescató parcialmente la sinergia muerte celular de IPI-504 y docetaxel, disminuyendo el porcentaje de las células muertas de 40% a 22% (Fig. 4B). Esto es consistente con la hipótesis de que el puesto de control mitótico es parcialmente responsable de este efecto sinérgico.
H292 células fueron tratadas durante 30 h (A, C) o 48 h (B) con combinaciones de dosis indicadas de IPI-504 (175 nM), DTX (20 nM) y el inhibidor de quinasa Aurora ZM447439 (9 M). Las células se recogieron para (A) la citometría de flujo (pH 3) y las imágenes de contraste de fases, (B) la muerte celular (7AAD), y (C) análisis de inmunotransferencia. Una flecha indica una migración lenta, la forma fosforilada de Securin. Las barras de error para el índice mitótico y la muerte celular representan la desviación típica de las réplicas de dos experimentos independientes.
concomitante con detención de la mitosis, IPI-504 y combinaciones de dosis de docetaxel dio lugar a una acumulación de las proteínas mitótico Securin, ciclina B y AURKB (Fig. 4C). La aparición de una forma de migración lenta de Securin, se cree que representa la forma activa, fosforilados [16] se observó específicamente en las células tratadas con el IPI-504 y docetaxel combinación (Fig. 4C, flecha). La forma de migración lenta se convierte en la forma de migrar rápidamente sobre el tratamiento con fosfatasa, lo que confirma que la forma de migración lenta representa la forma fosforilada (S3 Fig.). Abrogación del IPI-504 y docetaxel inducida sobre regulación de las proteínas mitótico Securin, ciclina B, y AURKB se observó a co-tratamiento con ZM447439 (Fig. 4C). Por el contrario, el co-tratamiento con ZM447439 no abroga IPI-504 inducida sobre regulación de HSP70, un marcador sustituto para la inhibición de HSP90 [17], lo que indica que el IPI-504 todavía está activo en estas células.
se ha informado de que durante la detención mitótica prolongada, la fosforilación de la proteína anti-apoptótica MCL1 por ciclina B-CDK1 inicia su destrucción APC /C-dependiente, lo que lleva a la muerte celular durante la mitosis [18]. Curiosamente, se observó la baja regulación de la proteína MCL1 específicamente en células H292 tratadas con la combinación de docetaxel, IPI-504 y, un efecto que fue abrogada a co-tratamiento con el inhibidor de quinasa Aurora (Fig. 4C).
promoción de complejos anafase (a /C) de APC componentes están agotadas específicamente de la interactoma HSP90 en las células tratadas con docetaxel
Tras la inhibición de HSP90, proteínas mal plegadas cliente se disocian de HSP90 y, posteriormente, IPI-504 y están dirigidos para la degradación mediada por el proteosoma [19]. Para identificar potenciales proteínas cliente que contribuyen a la sinergia de IPI-504 y docetaxel, SILAC se realizó y HSP90 interactuar proteínas que comprenden el "interactome" fueron identificados en condiciones de tratamiento de drogas por espectrometría de masas. El interactoma HSP90 para el experimento hacia adelante en el que H292 células marcadas con isótopos pesados de lisina y arginina fueron tratados con la combinación de IPI-504 y las células de docetaxel y H292 marcado con lisina normal y arginina fueron tratados con vehículo solo se examinó y se comparó con los datos obtenido a partir del experimento inverso en el que H292 células marcadas con isótopos pesados se trataron con vehículo solo y células H292 marcados con los isótopos normales fueron tratados con la combinación de IPI-504 y docetaxel (Fig. 5A). Como era de esperar, la Hsp70 era fuertemente regulados hasta en el interactoma HSP90 sobre IPI-504 y el tratamiento con docetaxel (Fig. 5B) [17]. Del mismo modo, Glucocortocoid Receptor (GR), un conocido de proteínas cliente de HSP90, era fuertemente el regulado de la interactome HSP90 en el tratamiento de combinación (Fig. 5B) [20]. Se identificaron varias proteínas potenciales clientes novela HSP90 que se redujeron reguladas en respuesta a la combinación, algunos de los cuales juegan un papel en la respuesta de control mitótico (S1 Tabla). Estos incluyen dos componentes de la APC /C, ANAPC3 y ANAPC4 (Fig. 5B). Para confirmar los datos SILAC, la abundancia de proteínas se determinó mediante análisis de transferencia Western de lisados obtenidos de células tratadas con H292 IPI-504 y docetaxel en combinación (Fig 5C;.. S4 figura). De manera similar a los recursos genéticos, la baja regulación de ambos ANAPC3 y ANAPC4 se observó tras el tratamiento de H292 con la combinación de IPI-504 y docetaxel en comparación con vehículo (Fig. 5C). La sobre regulación de Hsp70 se confirmó tras el tratamiento con IPI-504 solo o en combinación con docetaxel (Fig. 5C) .La contribución de APC /C a la celda sinergia muerte con la combinación de IPI-504 y docetaxel se evaluó mediante el examen de si pérdida de los componentes de APC /C podría reemplazar IPI-504 en la sensibilización de las células con docetaxel. El APC /C componentes ANAPC3 y ANAPC4 fueron derribados con siRNA individualmente o en combinación, y se midieron los efectos sobre la proliferación celular después del tratamiento con docetaxel. A concentraciones de docetaxel mayor que 5 nM, la meseta de la muerte celular aumentó de 63% en el control siRNA revueltos, a 73% a la caída ANAPC4, y 80% a la ANAPC3 desmontables solo o en combinación con caída ANAPC4 (Fig. 5D, dejó panel). La pérdida de los componentes de APC /C aumentó los efectos antimitóticos de docetaxel, aumentando el índice mitótico de 17% con docetaxel (10 nM) por sí solo a 33% cuando se combina con la pérdida de ANAPC3 /ANAPC4 (Fig. 5D, panel derecho). Western blot confirmó caída eficiente de los componentes de APC /C (Fig. 5E).
(A) de isótopos estables de etiquetado de aminoácidos en cultivo (SILAC) esquemática. Marcadas metabólicamente H292 células se trataron durante 24 h con la combinación de 300 nM IPI-504 y 10 nM DTX o vehículo (DMSO), seguido de la identificación de la interactome HSP90 por espectrometría de masas. (B) Los datos en bruto a partir del estudio de SILAC. Los puntos de datos en la parte superior derecha e inferior izquierda cuadrantes representan las proteínas que son regulados hacia arriba y hacia abajo-regulados, respectivamente, en el interactoma HSP90 tras el tratamiento con la combinación en comparación con el vehículo. Las dos flechas en el cuadrante superior derecho representan fragmentos de péptidos independientes con secuencias únicas de segmentación HSP70. (C) El análisis por inmunotransferencia verifica el agotamiento de ANAPC3 y ANAPC4 tras 24 h de tratamiento de las células H292 con 300 nM IPI-504 y 10 nM DTX combinación. GR = receptor de glucocorticoides. (D) La pérdida de los componentes de APC /C de RNAi sensibiliza a las células H292 a la muerte celular mediada por DTX (72 h, 7AAD) (panel izquierdo) y aumenta el índice mitótico (30 h, pH 3) (panel derecho). H292 fueron transfectadas con nontargeting revueltos siRNA (diamantes azules) o ANAPC3 de siRNA dirigidos (cuadrados rojos), ANAPC4 (triángulos verdes), o ANAPC3 /combinación ANAPC4 (círculos de color púrpura).