Extracto
El tratamiento de primera línea de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) implica sobre todo la administración de la quimioterapia con docetaxel. Desafortunadamente, la resistencia a la terapia de docetaxel es un hecho definitivo. Las alteraciones en los receptores de andrógenos (AR) la expresión y la señalización están asociados mecanismos de resistencia al tratamiento docetaxel en CRPC subyacentes. proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular, que regula la activación, maduración y estabilidad de las proteínas de señalización críticos implicados en el cáncer de próstata, incluyendo la AR. Este conocimiento y los avances recientes en el diseño y desarrollo de compuestos han puesto de relieve la Hsp90 como una atractiva diana terapéutica para el tratamiento del CRPC. Recientemente hemos informado del desarrollo de una resistencia (MYC-CAP /CR) modelo de tumor de trasplante de castración MYC-PAC, que expresa amplifica AR de tipo salvaje. Dentro, nos informan de que una segunda generación de inhibidores de Hsp90, NVP-AUY922, inhibe el crecimiento celular e induce significativamente la muerte celular en MYC-CAP /CR y líneas celulares /CE2 PTEN-Cap. NVP-AUY922 inducida por la degradación del proteasoma de AR, aunque curiosamente no requiere la pérdida de proteína AR para inhibir la actividad transcripcional de AR. Además, NVP-AUY922 aumentó la toxicidad de docetaxel en MYC-CAP /CR y líneas celulares /CE2 PTEN-cap
in vitro
. Finalmente, NVP-AUY922 /docetaxel terapia de combinación en ratones portadores de MYC-CaP /tumores CR resultó en una mayor actividad antitumoral en comparación con un solo tratamiento. Este estudio demuestra que NVP-AUY922 provoca una potente actividad hacia AR señalización y aumenta la respuesta a la quimioterapia en un modelo de ratón de CRPC, establecer el fundamento para el desarrollo clínico continuado de los inhibidores de Hsp90 en los ensayos clínicos para el tratamiento de pacientes CRPC.
Visto : S Ku, Lasorsa E, Adelaiye R, S Ramakrishnan, Ellis L, Pili R (2014) La inhibición de la Hsp90 Augments tratamiento con docetaxel en cáncer de próstata resistente a la castre. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10.1371 /journal.pone.0103680
Editor: Bandana Chatterjee, de la Universidad de Texas Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2013; Aceptado: July 6, 2014; Publicado: July 29, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ku et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Departamento de Defensa - PC094159 (LE) y el Instituto Nacional del cáncer - P50 CA58236 (RP). Los donantes tienen ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores desean declarar los siguientes conflictos: Roberto Pili ha sido un consultor pagado y recibió fondos de investigación de Novartis. Como tal, esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer de próstata resistente
castre (CRPC) es un cáncer de próstata incurable y agresiva (CaP) fenotipo. Desde hace varios años, la principal opción de tratamiento del CRPC se ha limitado a la quimioterapia con docetaxel, la cual se extiende la supervivencia, aunque por un tiempo limitado [1]. Mientras que el tratamiento de la CRPC ha sido extremadamente difícil, los últimos 2 años se ha visto un cambio dramático en las opciones terapéuticas para esta enfermedad. El segundo cabazitaxel línea [2], la inmunoterapia sipuluecel-T [3], el acetato de síntesis de andrógenos inhibidor de abiraterona [4], la Enzalutamida antagonista de AR [5], y el radio-223 [6] todos han recibido la aprobación reciente de la FDA para el tratamiento de la CRPC. Aunque estas nuevas terapias se han ampliado las opciones de tratamientos para los pacientes, la supresión del crecimiento sostenible CRPC sigue siendo todavía se requieren un desafío primario y nuevas estrategias de tratamiento.
Debido a docetaxel es una terapia eficaz, sigue siendo un componente crítico para estrategia de tratamiento de primera línea del CRPC. La superación de ambos adquiridos e intrínseca resistencia a docetaxel ha sido un reto clínico y mejorar los resultados del tratamiento para los pacientes con resistencia a docetaxel es de alta prioridad. Con una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes de la resistencia a los medicamentos, están surgiendo nuevas oportunidades terapéuticas. Esto puede crear vías para el tratamiento de monoterapia de docetaxel CRPC resistencia o potencialmente volver a sensibilizar a los pacientes a tratamiento con docetaxel CRPC con nuevas estrategias de combinación.
Orientación del eje andrógeno-AR con acetato de abiraterona [4] y Enzalutamida [5], como monoterapia, en pacientes con docetaxel resistente CRPC ha demostrado beneficio clínico. Si bien se desea principalmente ataques directos de la acción AR, la focalización indirecta, a través de la inhibición de las proteínas asociadas AR es un enfoque atractivo. La chaperona molecular Hsp90 es un miembro de la familia de proteínas de choque térmico [7] y se encontró que se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, incluyendo el CaP. Hsp90 tiene documentados más de 200 clientes, incluyendo la AR, donde Hsp90 evita la degradación del proteasoma y estabiliza la conformación AR preparada para la activación del ligando [7]. Debido a que la Hsp90 interactúa con varias proteínas cliente, se percibe que la inhibición de Hsp90 podría potenciar un mayor efecto antitumoral catastrófico si se compara con las terapias dirigidas más directos. En estudios preclínicos, la inhibición de Hsp90 por sí solas [8], [9], o más recientemente, en combinación [10], [11] producido resultados prometedores en el tratamiento de células de CaP. Desafortunadamente, los inhibidores de Hsp90 primera generación no dieron como resultado una eficacia significativa en los ensayos clínicos [12] - [14]. Estos inhibidores de Hsp90 iniciales conocidos como análogos de geldanamicina, 17-alilamino-17 demetoxigeldanamicina (17-AAG) y 17- (dimethylaminotheyl-amino) -17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) se atribuyeron a un error en la clínica debido a la mala solubilidad y farmacocinética , hepatotoxicidad, la susceptibilidad a flujo de salida de la glicoproteína P y la falta de metabolismo por enzimas NQO1 /DT-diaforasa [15].
NVP-AUY922 (AUY922) es una amida de isoxazol resorcinlyic (Fig. 1A) demostrado ser una potente inhibidor de la Hsp90 [16]. AUY922 es un análogo no geldanamicina, y no presenta las limitaciones de los análogos de geldanamicina, para ello hacer de este agente más prometedor para los ensayos clínicos. AUY922 media su efecto por la unión al dominio ATPasa de la Hsp90 N-terminal para inhibir la función chaperona de Hsp90. Esta acción lleva a la degradación proteosomal de varias proteínas del cáncer relevante del cliente [16], que incluyen rinitis alérgica [17]. AUY922 ha demostrado actividad anti-tumor en una variedad de modelos de ratón pre-clínicos de tumores sólidos, incluyendo células PC3 de próstata y cáncer de xenoinjertos [16], [18]. Más recientemente, se han descrito nuevos inhibidores de Hsp90 generación, incluyendo AUY922 para lograr respuestas biológicas en líneas celulares de cáncer de próstata y tejido de cáncer de próstata humano, en comparación con el análogo de geldanamicina 17-AAG [17]. Fase I y II de los estudios en neoplasias hematológicas y tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama y mieloma múltiple, están en curso con AUY922.
(A) Estructura química de NVP-AUY922. (B) castrar líneas celulares resistentes (MYC-CAP /CR y PTEN-CAP /CE2) fueron tratados con concentraciones indicadas de AUY922 durante 48 h. Las células adherentes se fijaron con 70% EtOH. El crecimiento celular se evaluó por tinción de células fijadas con violeta cristal y midiendo la absorbancia a 570 nm. Cada punto se normalizó a los controles no tratados (0) y está representado por 3 experimentos independientes, media ± SE. células (C) MYC-CAP /CR y PTEN-CAP /CE2 se trataron con las concentraciones indicadas de AUY922 durante 48 h. Se recogieron las células adherentes y no adherentes y se lavaron en 1 x PBS. Las células se incubaron con yoduro de propidio y la muerte celular se evaluó mediante citometría de flujo. Cada punto representa la media ± SE de 3 experimentos independientes. * Indica p & lt; 0,05 comparado con el control sin tratar (0), por dos colas t-test
El objetivo de este estudio fue analizar la capacidad de AUY922 para antagonizar la transcripción y /o proteína. la estabilidad de la AR en la castración resistente MYC-CAP /CR y /CE2 líneas celulares de cáncer de próstata PTEN-CAP, así como un modelo de ratón de trasplante recientemente desarrollado en nuestro laboratorio [19], [20]. Además, hemos querido investigar la eficacia terapéutica antitumoral y de AUY922 como agente único y en combinación con quimioterapia con docetaxel.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
El Instituto de Animales Cuidado y el empleo Comisión (IACUC) en el Roswell Park Cancer Institute (RPCI) aprobó todos los protocolos de ratones utilizados en este estudio. Nuestra identificación de aprobación /protocolo es 1137M.
Cultivo de células y reactivos
El aislamiento de una línea celular MYC-tapa a prueba de castración.
La línea celular MYC-CAP /CR era generado a partir de nuestra MYC-CaP castración trasplante resistente al modelo de tumor se informó anteriormente [19]. MYC-CAP /piezas de tumor CR (~ 4 mm
2) se colocaron en una placa de cultivo de 6 pocillos y se retira después de haber sido cultivadas durante 24 horas en medio DMEM rico en glucosa suplementado (FBS al 10%; 1% de penicilina /estreptomicina). Las células adherentes fueron una población mixta de células tumorales y fibroblastos MYC-CAP /CR. Estas células se cultivaron hasta aproximadamente el 80% de confluencia. Se llevó a cabo pasos en serie de estas culturas heterogéneas, hasta que una monocapa homogénea de MYC-CAP /CR células estaba presente. líneas de células /CR MYC-Cap fueron posteriormente cultivadas en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO
2. PTEN-CAP /células cE2cE2 fuera una especie de regalo del Dr. Roy-Burman (Universidad de California, Los Ángeles) y se cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO
2. células PC3 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO
2.
en
in vitro
en experimentos, NVP-AUY922 (Novartis) se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) para la preparación de las soluciones madre (10 mM). El andrógeno sintético, metiltrienolona (R1881; Sigma-Aldrich), se disolvió en etanol para la preparación de soluciones madre (10 mM). El inhibidor del proteasoma, MG132 (Sigma-Aldrich), se disolvió en DMSO para la preparación de soluciones madre (10 mM). El inhibidor de la traducción, cicloheximida (Sigma-Aldrich), se disolvió en etanol para la preparación de las soluciones madre (5 mg /ml). Los anticuerpos utilizados para inmunotransferencia y /o inmunohistoquímica (IHC) fueron anti-receptor de andrógenos (Santa Cruz), GAPDH (Señalización Celular), c-MYC (Epitomics) y activado caspasa 3 (Señalización Celular). Para
in vivo
estudios, se obtuvo docetaxel de la farmacia Roswell Park Cancer Institute y se diluyeron a 1 mg /ml en PBS antes de la administración a los animales. NVP-AUY922 se disolvió en dextrosa al 5% en agua destilada (D5W) a una concentración de 4 mg /ml.
crecimiento celular y la muerte celular ensayos
MYC-CAP /CR o Pten- células de CaP /CE2 (4 × 10
4 /ml) se dejaron adherir durante la noche en placas de 24 pocillos (BD Biosciences) y se incubaron con las concentraciones indicadas de NVP-AUY922 de 24 y 48 horas. El crecimiento celular se midió mediante la fijación y la tinción de células adherentes con 10% de metanol en cristal violeta durante 30 minutos. Se hicieron células teñidas soluble en metanol absoluto y se detectó la absorbancia a una longitud de emisión de 570 nm. Viabilidad (muerte celular) se midió mediante la incubación de las células adherentes y no adherentes con 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) y se cuantificó la captación con un FACS Calibre citómetro de flujo.
Western blot
células MYC-CAP /CR o PTEN-CAP /CE2 se lavaron en PBS y se lisaron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich) que contiene 1 × inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (Sigma-Aldrich). Igual cantidad de proteínas se separaron por electroforesis usando 4-15% de geles de gradiente de SDS-PAGE (Bio-Rad) y la proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Biometra). Secundaria anticuerpos conjugados HRP eran de Dako. La detección se llevó a cabo utilizando reactivos de quimioluminiscencia (PerkinElmer).
actividad de transcripción del receptor de andrógenos
El estado de la capacidad de respuesta de las células andrógeno-MYC CAP /CR se determinó usando un kit de luciferasa reportado basado en lentiviral disponible en el mercado (Cignal Lenti AR Reportero (Luc) kit; SABioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
cuantitativo PCR en tiempo real
ARN total fue extraído por TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.. Un microgramo de RNA se utilizó para realizar la síntesis de ADNc por kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad). a continuación, un microlitro de reacción de síntesis de cDNA se sometió a amplificación por PCR mediante el uso de iQ SYBR kit verde (Bio-Rad). señales de PCR se registraron y analizaron por Bio-Rad CFX Connect-tiempo real sistema de detección de PCR. Las secuencias de los cebadores son: FKBP5 hacia adelante, 5 'GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3', e inverso, 5 'CACAATACGCACTTGGGAGA 3'; GAPDH hacia delante, 5 'GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3', y marcha atrás, 5'CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 '. ΔΔCt valores se calcularon y se utilizan para determinar los cambios veces de ARNm.
Histología La inmunohistoquímica
Los ratones fueron sacrificados por CO
2 asfixia en los puntos de tiempo definidos. El tejido tumoral se fijó en formalina tamponada al 10% durante la noche seguido por 24 horas adicionales en 70% de etanol. Para la recuperación de antígenos, los portaobjetos se hirvieron durante 10 minutos en solución 10 mM de citrato de sodio pH 6 para todos los anticuerpos. se utilizó ImmPRESS sistema de detección (Vector Laboratories) para la detección de todos los anticuerpos primarios. La tinción se visualizaron utilizando 3,3 'diaminobencidina (DAB) (Sigma, St Louis, MO, FAST 3,3'-diamino bencidina) y las diapositivas se counterstained con hematoxilina. Para la cuantificación de la tinción IHC imágenes representativas (3-6) se obtuvieron utilizando un microscopio óptico Zeiss (Zeiss). tinción nuclear positiva para c-myc y activar la caspasa 3 se cuantificó por Aperio ImageScope (v11.1.2.760).
En vivo
estudios en animales
El Instituto de Cuidado de Animales y uso Comité en el Roswell Park Cancer Institute aprobó todos los protocolos de ratones utilizados en este estudio. Los animales fueron alojados en una instalación para animales se mantuvieron en un ciclo de 12 h de luz /oscuridad, a una temperatura constante (22 ± 2 ° C) y humedad relativa (55 ± 15%). El agua del grifo y la comida estaban disponibles
ad libitum
. ratones machos FVB (4-6 semanas de edad) se adquirieron de NCI Frederick (Maryland, EE.UU.). Los ratones SCID fueron adquiridos de una casa en la colonia mantenida en el Roswell Park Cancer Institute. Todos los ratones fueron castrados quirúrgica hasta 10 días antes de la inoculación del tumor. La castración quirúrgica se realizó por el afeitado de la zona quirúrgica. Se realizó una incisión en el escroto y en la túnica de los testículos con unas tijeras. La almohadilla de testículos, los conductos deferentes y grasa de testículo adjunta se retiraron a través del sitio de la incisión. El sitio de la incisión se cierra con grapas quirúrgicas. El LuCaP23 independientes de andrógenos (AI) modelo de xenoinjerto [21] es un generoso regalo del Dr. Robert Vessella (Universidad de Washington, Seattle, WA). Este modelo se mantuvo por pasos en serie de tejido tumoral de ratones macho SCID pre-castrados.
estudios de Terapia.
Pre-castrado ratones machos FVB machos fueron inoculados con células CR-MYC CAP /( 1 × 10
6) suspendido en PBS mediante inyección subcutánea. Del mismo modo, los ratones SCID machos castrados pre-fueron inoculados con PC3 (1 × 10
6) células en suspensión en PBS mediante inyección subcutánea, o implantados con un pedazo del tumor LuCaP 23 AI (4 mm
2) por vía subcutánea. Para los estudios de docetaxel solo tratamiento, los ratones portadores de tumores recibieron tratamiento con docetaxel (10 a 50 mg /kg una vez por semana; inyección i.p.). Para los estudios de combinación, los animales portadores de tumores recibieron vehículo (D5W), docetaxel (10 mg /kg, una vez por semana; inyección i.p.), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 días en 2 días de descanso; inyección i.p.) o de combinación. En todos los estudios, los ratones se pesaron semanalmente para monitorizar la toxicidad. El crecimiento del tumor se evaluó mediante mediciones de la pinza de serie dos veces por semana.
Análisis estadístico
Los datos se muestran como la media ± SE. Las diferencias se determinaron utilizando uno o ANOVA de dos vías y dos colas pruebas t pareadas donde se indica, utilizando el software GraphPad Prism. Los valores de p inferior a 0,05 se asigna estadísticamente significativa.
Resultados
Respuesta de las células de cáncer de próstata resistente a la castración al tratamiento AUY922
in vitro
MYC-CaP castran células resistentes (MYC-CAP /CR) y la castración PTEN-tapón a prueba (PTEN-CAP /CE2) se expusieron durante 48 horas a concentraciones crecientes de AUY922. Como se muestra en la Fig. 1B, bajas concentraciones nanomolares de AUY922 fueron suficientes para inhibir el crecimiento de MYC-CAP /CR y las células /CE2 PTEN-Cap. Además, AUY922 indujo un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular de MYC-CAP /CR y CE2 células a concentraciones de 50-500 nM basados en el análisis de captación de PI PTEN-CAP /(p & lt; 0,05; Fig. 1C).
AUY922 induce la degradación del proteasoma de AR y AR inhibe la actividad transcripcional en MYC-CAP /CR y las células PTEN-CAP /cE2Pten-CAP /CE2
está documentado que la inhibición de Hsp90 a menudo resulta en la degradación del proteasoma de su proteínas cliente [16]. Nos ello quisimos determinar la estabilidad de proteínas AR y /o la actividad transcripcional fue atenuada por AUY922 en nuestros modelos resistentes de castración. MYC-CAP /CR y PTEN-CAP /CE2 células tratadas con concentraciones crecientes de AUY922 durante 48 horas demostraron una pérdida dependiente de la dosis de la proteína AR, más notable en concentraciones de 100 nM y 500 nM (Fig. 2A y 2C). El tratamiento concomitante con AUY922 y el inhibidor de proteasoma, MG132 (0,5 M), confirmó que AUY922 pérdida mediada por proteína de AR fue por la degradación del proteasoma (Fig. 2A). El efecto de AUY922 sobre la actividad transcripcional de AR se evaluó mediante el uso de células CR MYC-CaP /con la expresión estable de un informador de luciferasa impulsado por elementos de respuesta a andrógenos (ARE-Luc). MYC-CaP /células CR /ARE-Luc se incubaron con concentraciones crecientes de AUY922 y 1 nM R1881 simultáneamente durante la noche o previamente con 1 nM R1881 durante 4 horas, seguido de concentraciones crecientes de AUY922 durante la noche. Debido a la expresión constitutiva de la luciferasa en células PTEN-CAP /CE2, se evaluó el nivel de expresión de ARNm del gen AR aguas abajo, FKBP5, para investigar el efecto de AUY922 en la actividad transcripcional de AR. Nuestros resultados demuestran que AUY922 inhibe la actividad transcripcional de AR a bajas concentraciones nanomolares en tanto castrar líneas celulares resistentes (Fig. 2B y 2C). Además, estos resultados también indican que no se requiere la degradación de proteínas AR para AUY922 para antagonizar la transcripción AR. Además, se utilizó la cicloheximida para bloquear la síntesis de proteínas nuevas que sugieren, además, que bajo AUY922 nanomolar es capaz de reducir la actividad transcripcional de AR sin afectar el nivel de proteína de AR (Fig. 2D).
(A) MYC-CaP resistente a la castración células se trataron durante 48 h con concentraciones crecientes de AUY922 o concentraciones crecientes de AUY922 simultáneamente con el inhibidor del proteasoma MG132 [0,5 M]. Expresión de la proteína AR se evaluó mediante Western blot. líneas celulares (B) MYC-CaP /CR con la transfección estable de un plásmido reportero AR (ARE-Luc) se incubaron en andrógenos empobrecido condiciones de cultivo celular durante 6 horas. Las células se trataron simultáneamente con 1 nM R1881 e indicaron concentraciones de AUY922 durante la noche o pre-tratadas con 1 nM R1881 durante 4 horas antes de la adición de las concentraciones indicadas de intensidad AUY992 luminiscencia se midió y se cuantificó. Las columnas representan 3 experimentos independientes; media ± SE. células (C) PTEN-CAP /CE2 se trataron con concentraciones crecientes de AUY922 durante 48 horas. Expresión de la proteína AR se evaluó mediante Western blot. actividad transcripcional de AR se realizó mediante la medición de nivel de expresión FKBP5 mRNA. Las células se incubaron en condiciones de cultivo celular agotado andrógenos durante 6 horas, y después se trataron simultáneamente con 1 nM R1881 e indicaron concentraciones de AUY922 durante la noche. Los experimentos representan 3 experimentos independientes, media ± SE. células (D) MYC-CAP /CR y PTEN-CAP /CE2 fueron tratados de forma concurrente con 5 mg cicloheximida /ml y concentraciones crecientes de AUY922. Expresión de la proteína AR se evaluó mediante Western blot. GAPDH sirvió como control de carga de proteínas. La densitometría se realizó por análisis de imagen j. Los números se muestran a continuación las bandas en relación con las células control.
Co-tratamiento de AUY922 y docetaxel aumenta la muerte celular de MYC-CAP /CR y las células PTEN-CAP /CE2
En primer lugar, se investigó la sensibilidad de MYC-CAP /CR y las células /CE2 PTEN-CAP a las capacidades de inhibición del crecimiento de docetaxel. El tratamiento farmacológico mostró la capacidad de inhibir el crecimiento celular a bajas concentraciones nanomolares en ambas líneas celulares (Fig. 3A-B).
Castrada líneas celulares resistentes se trataron con las concentraciones indicadas de docetaxel y /o AUY922 para 48 h. líneas celulares MYC-CAP /CR (A) y PTEN-CAP /CE2 (B) fueron tratados con concentraciones indicadas de docetaxel durante 48 h. Las células adherentes se fijaron con 70% EtOH. El crecimiento celular se evaluó por tinción de células fijadas con violeta cristal y midiendo la absorbancia a 570 nm. MYC-CAP /CR (C) y PTEN-CAP /CE2 células (D) se trataron con las concentraciones indicadas de AUY922 y /o docetaxel durante 48 h. Las células se trypinized y lavaron en 1 x PBS y se incubaron con yoduro de propidio (PI). Los porcentajes de células muertas (células positivas PI) se determinaron por citometría de flujo. Las columnas representan la media ± SE, * indica significativamente mayor en la combinación en comparación con el tratamiento con cada fármaco por separado (p = 0,03 según lo determinado por ANOVA de una vía).
selecciona para tratar MYC-CaP /células CR durante 48 horas con 10 nM AUY922 (una concentración, donde la proteína AR no se degrada pero AR actividad transcripcional se inhibe) y 100 nM AUY922 (una concentración en proteína de AR se degrada y Ar actividad transcripcional es inhibida) con 500 nM docetaxel. Higo. 3C muestra que la combinación de 10 nM AUY922 con docetaxel aumenta significativamente la muerte celular en comparación con el tratamiento con cualquiera de los fármacos solos. Combinación de 100 nM AUY922 con docetaxel todavía una mayor muerte celular en comparación con cada tratamiento individual aunque no fue significativa. Además, las células tratadas CE2 PTEN-CAP /con 30 y 40 nM AUY922 (concentraciones de AUY922 que no afectan drásticamente la expresión de proteínas AR) con 500 nM de docetaxel, demostrando que estos tratamientos de combinación de AUY922 y docetaxel son capaces de inducir una mayor muerte celular en comparación con cada tratamiento solo (Fig. 3D). Estos datos indican que la Hsp90 es potencialmente implicadas en la actividad transcripcional de AR y que la interrupción de la interacción AR con Hsp90 a través de su inhibición antagoniza significativamente la actividad de la AR en CR y PTEN-CAP /células MYC-CAP /CE2 independientes de la expresión de la proteína AR, permitiendo una mayor la inducción de muerte celular en combinación con docetaxel.
MYC-CAP /CR tumores son resistentes a la terapia con docetaxel
in vivo
para evaluar la capacidad de la actividad antitumoral de docetaxel
in vivo
hacia tumores /CR MYC-Cap, ratones FVB castrados que llevan MYC-CAP /CR tumores fueron tratados con diferentes dosis de docetaxel. Como controles, también se trataron los ratones SCID castrados que llevan xenoinjertos de tumores humanos, LuCaP23.1 AI y PC3, que se sabe que responden a la terapia con docetaxel
in vivo
. Higo. 4B y 4C demuestran que LuCaP23.1 AI y tumores PC3 eran sensibles a tratamiento con docetaxel. Además, cada dosis no generó una toxicidad significativa durante el tratamiento (Fig. 4E y 4F). Por el contrario, MYC-Cap tumores /CR fueron resistentes a todas las dosis de tratamiento con docetaxel (Fig. 4A), y la toxicidad se indicó en los ratones tratados con 50 mg /kg de docetaxel (Fig. 4D).
(A (CR células) MYC-CAP /5 × 10
6), (B) trozo del tumor LuCaP23.1 AI (~ 5 mm
2) y células PC3 (C) (5 × 10
6) fueron inyectados o colocado por vía subcutánea en el flanco de la FVB macho castrado (MYC-CAP /CR) o SCID (LuCaP23.1 AI y PC3) ratones. El tratamiento se inició cuando los tumores miden aproximadamente 50 mm
2. Docetaxel se recibió de la farmacia en RPCI como una solución acuosa (20 mg /ml) y se diluyó a 1 mg /ml en 1 x PBS diariamente. Los ratones fueron tratados con dosis de docetaxel de 10, 25 y 50 mg /kg semanalmente por inyección intra-peritoneal (i.p.) de duración de 2 ciclos (MYC-CaP /CR) o 3 ciclos (LuCaP23.1 AI y PC3). El crecimiento tumoral se controló mediante medidas en serie de calibre dos veces por semana. El tamaño del tumor se calculó por L × W. Todos los grupos de tratamiento consistían en 3-4 ratones. Cada grupo de tratamiento se normalizó a las medidas de pretratamiento y se convierte en el crecimiento del tumor por ciento. Cada punto representa el tamaño del tumor media ± SE. (D-F) Todos los ratones se pesaron 2 veces /semana para monitorizar la toxicidad de docetaxel. La toxicidad se considera que se produce cuando el peso corporal del ratón se redujo ≥20%. Cada columna está representada por 3-4 ratones /tratamiento individual y representado como porcentaje de cambio de peso corporal en comparación con los valores previos al tratamiento, la media ± SE.
AUY922 disminuye AR expresión en tumores MYC-CAP /CR y combina con docetaxel para aumentar la eficacia terapéutica
La actividad antitumoral de AUY922 y docetaxel
in vivo
se investigó mediante el tratamiento de ratones FVB castrados con tumores CR-MYC /la gorra. Tumor ratones portadores fueron tratados con vehículo (D5W; 5d en 2d off), AUY922 (40 mg /kg ip: 5d en 2d off), docetaxel (10 mg /kg ip: una vez por semana) o una combinación de 2 ciclos (14 días) . No se observó toxicidad significativa en todos los grupos de terapia, como se muestra por las mediciones de peso corporal (Fig. 5B). Como se ve en la Fig. 5A, en comparación con el tratamiento con vehículo, un tratamiento de dos semanas con AUY922 o docetaxel solo no redujo significativamente el crecimiento del tumor. En particular, la combinación de la terapia con AUY922 docetaxel abrogada significativamente el crecimiento de tumores MYC-CAP /CR en comparación con cada tratamiento individual (AUY922, p = 0,002; docetaxel, p = 0,009). Además, el análisis histoquímico del tratado MYC-CAP /CR tejido tumoral para la expresión AR reveló que los tumores tratados con docetaxel tanto el vehículo como muestran fuerte tinción nuclear de AR (Fig. 5C). Curiosamente, AUY922 como tratamiento único y en combinación con docetaxel mostraron que la inhibición de Hsp90 tuvo un efecto sobre la expresión heterogénea general AR tumor. Higo. 5D y 5E muestran inmunotinción representante de las secciones del tumor /CR MYC-Cap, que demuestran cortes de tumores thatremained positivos para la expresión nuclear de AR, mientras que las secciones adyacentes de tumores pérdida de AR expresión nuclear exhiben.
(A) Myc células de CaP /CR (5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones FVB machos castrados. El tratamiento se inició cuando los tumores miden aproximadamente 50 mm
2 (L x W). Los ratones fueron tratados con vehículo (D5W, ip,
n = 6
), docetaxel (10 mg /kg, semanal, ip,
n = 7
), AUY922 (40 mg /kg, 5d en 2d fuera, ip,
n = 5
) o la combinación (
n = 6
) durante 2 semanas. El tamaño del tumor se monitorizó mediante serial mediciones de calibre cada dos semanas. El tamaño del tumor se calculó por L × W. Cada grupo de tratamiento se normalizó a las medidas de pretratamiento y se convierte en el crecimiento del tumor por ciento. Cada punto representa el tamaño del tumor media ± SE. ANOVA de dos vías: ** p = 0,009 docetaxel frente a la combinación, p = 0,002 frente AUY922 combinación. (B) las mediciones de peso corporal semanales indican que la terapia no era tóxico. Cada punto representa la media ± SE. se recogió (C-E) El tejido tumoral a la conclusión de la terapia, se fijaron en 10% de formalina tamponada normal y embebido en parafina. Cuatro secciones micras (4 M) de tejido tumoral se evaluaron por inmunohistoquímica para la expresión del receptor de andrógenos. Ampliación (x40), barra de escala = 500 mM. tinción positiva nuclear de AR se cuantificó mediante análisis aperio imagescope de 6 campos aleatorios con un aumento de x40. Barra de escala = 500 mM. t-test con corrección de Welch no pareada de dos colas:; 0,0001 combinación frente a docetaxel **** p & lt; ** P = 0,0016 docetaxel frente a AUY922.
AUY922 disminuye la actividad transcripcional de AR en los tumores MYC-CAP /CR y se combina con docetaxel para aumentar la muerte celular del tumor
Para evaluar la actividad de AUY922 en la atenuación de la actividad transcripcional
in vivo
, se utilizó la inmunotinción para determinar la expresión del transgén c-MYC, que en este modelo de tumor es impulsado por la transcripción AR a través de un promotor de probasina [22], [23 ]. el tratamiento con docetaxel no indujo una pérdida de la expresión de c-myc (42,3%) en comparación con los tumores tratados con vehículo (41,2%; la Fig. 6A), que era consistente con AR expresión en los tejidos tumorales. En contraste, los tumores tratados con AUY922, muestran una reducción significativa de la expresión de c-myc en comparación con el tratamiento con vehículo (42,3% verso 24,6%; p & lt; 0,0001) y tratamiento con docetaxel (41,2% verso 24,6%; p = 0,006). Además, el tratamiento de combinación mostró una pérdida similar de la expresión de c-myc en comparación con AUY922 tratamiento único, y fue significativa en comparación con docetaxel solo tratamiento (28,7% verso 41,2%; p = 0,03; Fig. 6A).
( A) inmunotinción c-myc Representante. tinción nuclear positiva para c-MYC se cuantificó mediante análisis imagescope aperio de 6 campos aleatorios con un aumento de x40. Barra de escala = 500 mM. Dos colas t-test: **** p & lt; 0,0001 AUY922 frente al vehículo; ** P = 0,006 AUY922 frente a docetaxel; * P = 0,03 combinación frente a docetaxel. (B) Representante escinde la caspasa-3 inmunotinción. tinción nuclear positiva para la caspasa-3 escinde se cuantificó mediante análisis imagescope aperio de 6 campos aleatorios con un aumento de x20. Barra de escala = 500 mM. prueba t de dos colas: **** p & lt; 0,0001 combinación frente a los tratamientos individuales
Los tejidos fueron evaluados al lado para la inducción de muerte celular por immunstaining para exfoliados caspasa-3.. Se observó un bajo nivel de muerte celular en el tejido tratado con vehículo (3,3%) sin un aumento significativo en la muerte celular después de docetaxel (2,1%) o AUY922 (4,4%) los tratamientos individuales. Sin embargo, el tratamiento combinado aumentó significativamente el número de células tumorales positivas de caspasa-3 escindidos en comparación con docetaxel (14,5% verso 2,1%; p & lt; 0,0001) y AUY922 (14,5% verso 4,4%; p & lt; 0,0001) tratamientos individuales (Fig. 6B) .
Discusión
quimioterapia docetaxel sigue siendo un patrón primario para la atención de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración. Por desgracia, la enfermedad progresa a pesar del tratamiento con docetaxel o no responde en absoluto. Por lo tanto, la identificación de nuevos fármacos, que pueden mejorar o sensibilizar a los pacientes a la quimioterapia docetaxel, es muy necesaria. Mecanismos de resistencia a docetaxel subyacentes se han demostrado para ser multifactorial en líneas celulares y muestras clínicas de diferentes tipos de tumores [24]. mecanismos identificados incluyen la disminución de la acumulación celular debido a las proteínas de eflujo, incluyendo P-glicoproteína (P-gp) /MDR1 y MDR2 [25] y las mutaciones que inhiben directamente docetaxel de unión β-tubulina [26]. En este estudio, hemos demostrado que la segunda generación Hsp90 inhibidor AUY922 induce una potente inhibición de la transcripción AR asociada con la actividad antitumoral, y aumenta la muerte celular en combinación con docetaxel en líneas celulares de cáncer de próstata resistente a la castración. Además, se muestra que los resultados de la terapia de combinación AUY922 /docetaxel en la actividad antitumoral significativa.