Extracto
La exposición a agentes genotóxicos, tales como la irradiación produce daños en el ADN, la toxicidad de los cuales se ve aumentada cuando se deteriora la reparación del ADN. Poli (ADP-ribosa) se encontraron inhibidores de la polimerasa (PARP) para ser "
sintético letal
" en las células deficientes en BRCA1 y BRCA2 que deterioran la recombinación homóloga. Sin embargo, ya que muchos tumores, incluyendo el cáncer de próstata (CaP) rara vez tienen en este tipo de mutaciones, existe un considerable interés en la búsqueda de alternativas determinantes de la sensibilidad inhibidor de PARP. Se evaluó la eficacia de la radiación en combinación con el inhibidor de PARP, rucaparib en células de CaP. El índice de combinación para la supervivencia clonogénica después de los tratamientos de radiación y rucaparib reveló interacciones sinérgicas en un panel de líneas celulares de CaP, siendo más fuerte para las células LNCaP y VCAP que expresan proteínas de fusión gen ETS. Estos resultados se correlacionaron con las interacciones sinérgicas para la activación de la senescencia, como se indica por β - tinción galactosidasa. La ausencia de PTEN y la presencia de fusión de genes ETS modo se facilita la activación de la senescencia, lo que contribuyó a la disminución de la supervivencia clonogénico. El aumento de la radiosensibilidad en presencia de rucaparib se asoció con roturas en el ADN persistentes, como se determina por χ-H2AX, p53BP1, y focos Rad51. VCAP células, que albergan los
TMPRSS2-ERG
células de fusión de genes y PC3 que expresan de forma estable una construcción similar (fusión III) mostraron una mayor sensibilidad hacia rucaparib, que, a su vez, aumenta la radiación respuesta a una medida similar como el ADN-PKcs inhibidor NU7441. Rucaparib radiosensitized células de CaP, con un claro beneficio de la radiación de baja tasa de dosis (LDR) administrada durante un periodo de tiempo más largo que causó daños en el ADN mejorada. LDR braquiterapia imitando, que se utiliza con éxito en la clínica, fue más eficaz cuando se combina con rucaparib mediante la inducción de daño en el ADN persistente y la senescencia, lo que lleva a la disminución de supervivencia clonogénico. Esta combinación fue más eficaz en presencia de la
TMPRSS2-ERG Opiniones y en ausencia de
PTEN
, lo que indica potencial clínico para la braquiterapia en pacientes con CaP de riesgo intermedio y alto.
Visto: P Chatterjee, Choudhary GS, Sharma A, K Singh, Heston WD, Ciezki J, et al. (2013) La inhibición de PARP sensibiliza a menor dosificación de la radiación TMPRSS2-ERG gen de fusión que expresan las células y PTEN-deficientes del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (4): e60408. doi: 10.1371 /journal.pone.0060408
Editor: Philip J. Tofilon, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: Octubre 31, 2012; Aceptado: February 26, 2013; Publicado: April 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Chatterjee et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado principalmente por Pfizer RDG, con apoyo adicional del Instituto Nacional del cáncer (CA127264 a AA) y el Departamento de Estados Premio Entrenamiento post-doctoral de Defensa de los Estados (PC094405 a KS). También fue apoyado en parte por Insitutos Nacionales de Salud de subvención CA43703 P30 para el uso del Fondo para la radiación de los fondos básicos, Case Western Reserve University y el caso Comprehensive Cancer Center. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este trabajo fue apoyado principalmente por Pfizer RDG. Las soluciones madre de rucaparib fueron proporcionados por Pfizer. colegas de los autores en Clovis Oncología proporcionan sugerencias y orientación. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el más frecuentemente diagnosticado de tumor en los hombres, lo que representa solo el 29% de los casos incidentes [1]. Es la segunda causa más común de muerte por cáncer en los hombres después del cáncer de pulmón. La irradiación es una modalidad de tratamiento importante para CaP, con una respuesta clínica logrado de ~ 85%. Se utiliza sobre todo para la enfermedad en estadio temprano, como un adyuvante a la cirugía, y en combinación con quimio-terapéuticos que permiten su uso en dosis más bajas, con mayor eficiencia y con menos efecto citotóxico a los tejidos normales adyacentes.
poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) está representada por una familia de proteínas que se expresan abundantemente, se localizan principalmente en el núcleo, y están implicadas en muchos procesos celulares importantes, tales como la respuesta al daño del ADN, su reparación, y cuando el daño es severo, la muerte celular por apoptosis o necrosis [2]. PARP-1 y -2 son conocidos por tener un papel en diversos mecanismos de reparación del ADN, tales como reparación por escisión de base, la recombinación homóloga (HR) [3], y no homóloga de extremo de unión (NHEJ) [4]. Después de la detección de daños en el ADN, con la ayuda de su dominio de unión a ADN, PARP-1 activa desencadena ribosilación poli-ADP de las histonas y PARP-1 en sí. Es importante destacar que, PARP-1 asegura la regulación de la progresión del tenedor de replicación de ADN mediante HR en el ADN dañado [5]. PARP-1 está implicado principalmente en la reparación de roturas de cadena simple, que, si unrepaired se convierten a roturas de doble cadena (DSBs) durante la replicación del ADN. Los inhibidores de PARP (PARPi) representan una nueva clase de agentes que previenen la síntesis de ribosa poli-ADP por que incide sobre los procesos de reparación del ADN aguas abajo, y como resultado el daño del ADN persiste [2]. PARPi, por lo tanto, puede actuar como agente único en los tumores de recursos humanos deficientes (por ejemplo BRCA1 /2-defectuosa) a través de "
letalidad sintética
" [6]. Desactivación de NHEJ en células de recursos humanos con deficiencia a través de la inhibición de ADN-PKcs puede revertir el efecto de letalidad mediada por PARPi [7]. La radiación induce la actividad de PARP y su inhibición aumenta la muerte de las células y mejora el retraso del crecimiento tumoral en modelos de cáncer de pulmón irradiados [8]. Los niveles de PARP-1 también se incrementan en avanzado, resistente a castrar CaP [9], [10], por lo tanto, su uso en combinación con radiación para mejorar la radioterapia es atractivo.
El "
letalidad sintética
"concepto ha sido eficaz en células de mamífero en modelos de tumores con BRCA1 defectuoso o BRCA2, que, como consecuencia tienen HR defectuoso [3] y por lo tanto son susceptibles de utilizar de PARPi como monoterapia [11]. Sin embargo, para los tumores en los que tales mutaciones son poco frecuentes, como el CaP, existe una necesidad urgente de identificar daño en el ADN y reparación de defectos adicionales que pueden proporcionar una "
sintética letal
" combinación con PARPi. De este modo, se amplía el uso de PARPi más allá de los tumores con mutaciones BRCA1 defectuoso /2 es de gran interés.
En la etapa tardía del CP, eliminación bi-alélica del gen PTEN
(fosfatasa y homólogo de tensina) es un hecho común que se ha sugerido para impactar la reparación del ADN HR. PTEN antagoniza la vía de supervivencia PI3K /AKT por su actividad 3-fosfatasa fosfolípido, que, a su vez, regula la proliferación, la migración y apoptosis. Pérdida total de
PTEN
también estimula una fuerte respuesta de senescencia que actúa como un mecanismo adicional para la supresión de tumores. La senescencia se ha propuesto para funcionar como un mecanismo anti-tumor en respuesta al daño del ADN mediante la inducción de una detención del crecimiento irreversible y la restricción de la duración de la vida replicativa de las células [12]. De manera similar a las células del tumor BRCA1 /2-defectuosos,
se han reportado PTEN
células de CaP-null a ser sensibles a PARPi.
En este estudio, hemos examinado la respuesta a un potente inhibidor de la PARP, rucaparib solo o en combinación con la radiación en un panel de líneas de células de CaP. Nuestros datos apoyan la eficacia de rucaparib como un potente radiosensibilizador PARPi para células de CaP, más eficaz cuando se usa a dosis bajas tasas en las células que albergan el
TMPRSS2-ERG
fusión de genes o son
PTEN
-deficiente
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
CaP humano líneas celulares PC3, LNCaP, DU145, y VCAP se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA).; C4-2 se describió anteriormente [13]. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640, excepto DU145 (DMEM) y VCAP (DMEM modificado) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals), L-glutamina (Invitrogen), y 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO
2. Las soluciones madre de rucaparib, proporcionados por Pfizer, se hicieron en DMSO (Sigma Aldrich).
Para la transfección, las células se sembraron a ~ 80% de confluencia en un medio libre de antibiótico.
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fusión III (el más común) isoforma [14] generosamente proporcionado por el Dr. Michael Ittmann se transfectaron usando Lipofectamine 2000, seguido de la selección para resistencia a la neomicina con 1 mg /ml de G418 (Invitrogen). La eficiencia de la transfección se verificó por Western Blot (Fig. S1 A).
Tratamiento de Radiación
La radiación ionizante se entregó mediante un cesio-137 χ-irradiador convencional (JL Pastor Associates, San Fernando, CA), a una tasa de dosis de 146 cGy /min [15]. experimentos tasa de dosis se llevaron a cabo cambiando la posición de las placas o con el uso de un atenuador. Una fuente de Ir-192 de la radiación, que emite partículas beta, emplea un irradiador de células a medida fabricado, con el diseño del dispositivo tal como se describe [16].
Los ensayos para la formación de colonias y la senescencia
para el ensayo de formación de colonias, 500 células /60 mm placa (o 750 células /60 mm placa de LNCaP) se sembraron el día antes del tratamiento. Rucaparib se administró a las dosis indicadas de forma continua. Dos semanas después del tratamiento con radiación y /o rucaparib, las células se tiñeron con violeta cristal al 0,1%, y las colonias de células con & gt; 50 células se puntuaron por un analizador de imágenes alfa (Alpha Innotech Corp). El ensayo de la senescencia Se llevó a cabo como se describe [17]. Después de seis o doce días, las células se fijaron y el porcentaje de células β-galactosidasa-positivas se determinó contando los campos ≥five diferentes (~ 70 células /muestra).
inmunofluorescencia
Las células se chapada en cubreobjetos en placas de cultivo de 35 mm. Después del tratamiento, las células se fijaron con 2,0% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente, se lavó 3 x durante 5 minutos con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS durante 10 min, y bloqueado en 3 % de FBS en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 durante 1 h. Los cubreobjetos fueron luego a inmunotinción utilizando los anticuerpos contra χ-H2AX (Millipore), 53BP1 (Abcam), o Rad51 (Santa Cruz Biotechnology), seguido de un anticuerpo secundario fluorescente conjugado (Invitrogen), como se describe [17]. La cuantificación se basa en los datos observados de ≥ 70 células.
Análisis estadísticos
Para el análisis de la sinergia, las células fueron tratadas con rucaparib e irradiación, solo o en combinaciones en una proporción que equivale a la relación de su mediana -Efecto dosis, con cada dosis en cada experimento chapada en triplicado, y cada experimento realizaron tres veces. La interacción entre los dos tratamientos en ensayos de supervivencia celular y la senescencia clonogénicas después se determina con base en el método isobolográfico de Chou y Talalay, como se describe anteriormente [18], [19]. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de dos vías y la significación estadística asignada para p. & Lt; 0,05
Los análisis Western Blot
Las células se lisaron y se sometieron a inmunotransferencia, tal como se describe [17], [ ,,,0],20] y probaron con anticuerpos contra la etiqueta V5 (Thermo Scientific), para detectar la
TMPRSS2-ERG
fusión del gen III y β-actina (Sigma Aldrich) como control de carga.
resultados
aumento de la sensibilidad de CaP líneas celulares a la radiación cuando se combina con Rucaparib
la radiación ionizante y los agentes que dañan el ADN inducen significativamente la PARP-1 y los niveles de PARP son más altos en los tumores [9], [10 ], por lo tanto, PARPi podría utilizarse para sensibilizar a que daña el ADN quimio o radioterapia. El éxito clínico de PARPi en una cohorte de pacientes [21] que incluía algunas de ellas con CaP provocó nuestro interés en explorar el uso potencial de rucaparib (CO-338, anteriormente conocido como AG014699 y PF-01367338) como radiosensibilizador. Rucaparib, la primera PARPi que se ha desarrollado [22], [23], y en la actualidad se prueba en ensayos clínicos no se ha utilizado para --previously células de CaP. El examen de su efecto a largo plazo en la supervivencia celular indica una respuesta a la dosis para la radiación y rucaparib para diferentes células de CaP (Fig. 1A). VCAP y LNCaP (concentración rucaparib: 0,25, 0,5, y 0,75 M) mostró la máxima sensibilidad hacia rucaparib, seguido de PC3 y las células C4-2. En combinación con 1,5 Gy χ-irradiación, las células LNCaP mostraron la sensibilidad más alta a un precio tan bajo como 0,75 M de rucaparib (Fig. 1B). cálculos Synergy por análisis de isobolograma (ver Materiales y Métodos) se realizaron para las cuatro dosis de radiación, que van desde 1 hasta 5 Gy en combinación con rucaparib (intervalo de concentración de 0,6 a 3,12 M). Para PC3, una concentración de rucaparib tan bajo como 1,25 M mostró una disminución significativa en el número de colonias con un efecto de radiosensibilización potente. células DU145 fueron los menos sensibles a la radiación y rucaparib, solo y en combinación, con un efecto limitado obtenido sólo a las dosis más altas. células VCAP, sin embargo, mientras que mostraron una respuesta similar a la radiación como DU145, para la combinación con rucaparib mostraron una interacción sinérgica (Fig. 1B y Fig. S2A). El índice de combinación reveló la sinergia más fuerte (CI & lt; 0,2) en células LNCaP después de la combinación de radiación y rucaparib, con dosis de radiación tan bajas como 0,5 Gy y 0,25 M de rucaparib ser eficaz. células PC3 mostraron una sinergia moderada (CI = 0,7) después de la radiación 4 Gy y 2,5 M de rucaparib, mientras que las células C4-2 mostraron un efecto aditivo (IC = 0,9) (Fig. 1B y Fig. S2).
a, la radiación y la respuesta a la dosis rucaparib en las células PC3, C4-2, DU145, LNCaP VCAP y fue establecido por ensayos de supervivencia celular por clonación. paneles de la izquierda indican la respuesta a la radiación, los de la derecha a rucaparib. B, el efecto sinérgico de la combinación de radiación y rucaparib en la supervivencia clonogénico en LNCaP, PC3, C4-2, y las células VCAP, donde CI & lt; 1 representa sinergia y CI & gt; 1 una interacción antagonista entre los dos tratamientos. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
Rucaparib y la radiación inducen la senescencia en células PTEN-deficientes y TMPRSS2-ERG fusión que expresan
La senescencia es conocida para representar una respuesta importante a la radiación y la PARPi que los impactos sobre la proliferación celular y la supervivencia en última instancia clonogénico. Las células tratadas mostraron marcadores característicos de la senescencia después de seis días. Estos morfología celular aplanada incluido con la acumulación de células SA-β-galactosidasa-positivos (Fig. S3A).
PTEN
PC3 null, LNCaP, y líneas de células C4-2 mostraron un aumento dependiente de la dosis de radiación y PARPi en células SA-β-galactosidasa-positiva al tratamiento ya sea con radiación o rucaparib (Fig. 2A y 2B) . LNCaP tuvo el mayor número de células senescentes después de cualquiera de los agentes individuales o la combinación de tratamiento. En contraste, las células DU145 que tienen una de tipo salvaje
PTEN
alelo casi no mostraron células senescentes, incluso a las dosis más altas utilizadas. El índice de combinación para la tinción de la senescencia SA-β-galactosidasa indicaba una sinergia moderada fuerte (CI = 0,5-0,7) en PC3, LNCaP, y las células C4-2 (Fig. 2C y Fig. S2). Las características de senescencia se mantuvieron hasta al menos doce días, con un ligero aumento en el número de células β-galactosidasa-positivas (Fig. 2D y Fig. S3B). Estos datos indican que la senescencia contribuye a la disminución de la supervivencia de
PTEN
células deficientes y que el alcance de la senescencia se correlaciona con la supervivencia clonogénico.
porcentaje de células positivas galactosidasa β- se determinó después de la radiación (A ) y rucaparib (B), el tratamiento de
PTEN
deficiente en LNCaP, C4-2, y las células PC3. El porcentaje de células β-galactosidasa-positivas se determinó contando los campos diferentes ≥five (~ 70 células /muestra). C, Synergy análisis para la senescencia en LNCaP, PC3, y las células C4-2 para el tratamiento de combinación. Ver Figs. S2 y 3 para la tinción de β-galactosidasa y la sinergia análisis adicionales. D, se determinó Porcentaje de células C4-2 positivo β-galactosidasa después de 12 días de tratamiento con radiación ± rucaparib. E, de los padres y
TMPRSS2-ERG
células PC3 fusión de genes que expresan se cuantificaron por tinción SA-β-galactosidasa después de 6 días a partir de 4 Gy de radiación, 2,5 M rucaparib, y los DNA-PKcs inhibidor NU7441 (500 nM ), solo o en combinación. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
células VCAP, que albergan células senescentes la
TMPRSS2-ERG
gen de fusión, adquirida después de la radiación y PARPi (Fig. S4 ). Sin embargo, estas células son dependientes del gen de fusión, por lo tanto, el examen de la senescencia después de knock-down de
TMPRSS2-ERG
no era informativo. Por lo tanto, hemos utilizado células PC3 que expresan la misma isoforma,
TMPRSS2-ERG fusión III
para experimentos adicionales de senescencia. células PC3 que expresan
TMPRSS2-ERG
tenían un mayor número de células SA-β-galactosidasa-positivas después de la radiación (Fig. S4). El efecto de
TMPRSS2-ERG
expresión era comparable a lo que se obtuvo en células PC3 irradiadas en presencia de las DNA-PKcs inhibidor NU7441 (p = 0,0002), mientras que NU7441 solo no indujo la senescencia en cualquiera de las líneas de células . tratamiento Rucaparib en combinación con radiación de manera significativa (p & lt; 0,0001) aumentó el número de células senescentes en
TMPRSS2-ERG
expresando células PC3, que a su vez correlacionadas con células PC3 tratadas con radiación, rucaparib, y NU7441, (p = 0,0009) (Fig. 2E). tratamiento NU7441 no indujo la senescencia en células PC3 que expresan el
TMPRSS2-ERG
fusión después de la radiación, solo o en combinación con rucaparib. Estos datos indican que la actividad de DNA-PKcs es crítica para la senescencia, como se indica por el aumento del número de células senescentes en
TMPRSS2-ERG
expresando células o cuando se inhibe la DNA-PKcs.
Rucaparib aumenta la persistencia del daño del ADN inducido por radiación focos
a continuación examinó si la eficacia de los tratamientos se relaciona con su capacidad para inducir daño en el ADN. χH2AX y p53BP1 se establecen sustitutos para medir ionizante focos de radiación inducida (IRIF) [24]. La irradiación genera un aumento del número de focos χH2AX a los 3 y 6 h, que se disminuye en gran medida por 24 h, indicativo de la reparación del daño del ADN (Fig. 3A). Por el contrario, cuando las células fueron irradiadas en presencia de rucaparib, χH2AX focos persistió en 24 h. Además, los focos de p53BP1, otro marcador establecido para DSBs, eran más prominente a las 24 h después de la irradiación, con el tratamiento combinado con rucaparib que resulta en un mayor número de focos (Fig. 3B). Rad51 es un componente clave de recursos humanos; su expresión no se vio afectada por el
PTEN
estado, de acuerdo con un informe reciente [25]. Sin embargo, la combinación de rucaparib y la radiación mostró persistente focos Rad51 a las 24 h (Fig. 3C), lo que indica que la combinación es más eficaz en infligir daños en el ADN persistente en las células tratadas.
χH2AX (A) y 53BP1 (B) los focos se determinaron por microscopía immunofluoresecence a 24 h después del tratamiento combinado con la radiación y rucaparib en PC3 y las células LNCaP (panel izquierdo), con una cinética que dependen del tiempo que se muestran (panel derecho). C, focos Rad51 se visualizaron y se cuantifiquen en células PC3 de manera similar después de 24 h de tratamiento. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
LDR conduce a un mayor daño del ADN celular y disminución de la supervivencia
La radiación se administra en la clínica, ya sea como radioterapia de haz externo (RHE ) o braquiterapia. La radiación para el tratamiento del CaP mediante braquiterapia utiliza típicamente tasas de & lt; 70 dosis cGy /h en comparación con 200-300 cGy /min que se utilizan comúnmente para la radioterapia de haz externo para
in vitro
estudios de radiación de líneas celulares de cáncer humano con irradiadores convencionales. Para investigar la eficacia de bajas dosis-tarifas, las células fueron expuestas C4-2 y PC3 para dosificar las tasas de 56 a 690 cGy /min, para alcanzar una dosis total de 5Gy. El tiempo de exposición directamente correlacionada con más extenso daño en el ADN, lo que resulta en un menor número de colonias (Fig. 4A) y más χH2AX y 53BP1 focos (Fig. 5A y 6A). La tasa de dosis más baja (56 cGy /min) aumentó el número de focos χH2AX significativamente (p & lt; 0,0002) en comparación con la tasa de dosis convencional (146 cGy /min). La adición de rucaparib significativamente (p & lt; 0,0001) inducida por daño en el ADN tal como se mide por un aumento del número de focos χH2AX (Fig 5B.). Además, hubo un número significativamente (p & lt; 0,0001) aumento del número de focos p53BP1 siguientes del tratamiento de combinación (Fig 6B.). La tasa más baja dosis de radiación (56 Gy /min) inducida significativamente más 53BP1 IRIF (p = 0,004 & amp; 0,0007 para C4-2 y PC3 células respectivamente) en comparación con la tasa de dosis más alta (690 cGy /min)
a, se realizaron ensayos de supervivencia clonogénicos en el CP3 (panel izquierdo) y C4-2 células (panel derecho) a diferentes dosis y tasas de ± 1,25 M rucaparib. B, células C4-2 fueron expuestos a diferentes tasas de dosis de radiación de una fuente de Ir-192 ± 2,5 M rucaparib. Una dosis de radiación total de 5 Gy (panel izquierdo) y 10 Gy (panel derecho) fue entregado; por lo tanto, el tiempo de exposición difería para los diferentes dosis-tasas utilizadas. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
A, confocal inmunotinción para χH2AX focos, enumarated en células PC3 y C4-2 después de la radiación en las dosis indicadas. B, Cuantificación de la formación dependiente de la dosis de γH2AX focos. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
A, confocal inmunotinción de 53BP1 focos en células PC3 y C4-2 después de la radiación en las dosis indicadas. B, la representación gráfica de la generación de 53BP1 IRIF dependiente de la dosis. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3).
Se realizaron experimentos similares con una fuente de radiación LR-192 (dosis total fijo de 5 a 10 Gy) ± rucaparib. Las células que recibieron la dosis más baja (4,34 cGy /h), entregadas en el período más largo de tiempo, forman menos colonias en comparación con los expuestos a dosis moderadas a altas (26,8 cGy /h) de la radiación (Fig. 4B). Rucaparib reducido en gran medida la formación de colonias incluso a la dosis más alta probada LDR (26,8 cGy /h), lo que requiere ~ 18 h para alcanzar 5 Gy.
PARP inhibición Radiosensitizes TMPRSS2-ERG gen de fusión que expresan las células a una medida similar al ADN-PKcs La inhibición de las células parentales
La fusión entre el
TMPRSS2
, un oncogén regulada por andrógenos, y un ETS factor de transcripción de genes regulados por estrógenos, ERG generada por una deleción intersticial en el cromosoma 21 o por translocación recíproca está presente en ~ 50% de CaP etapa temprana [26]. VCAP células que expresan
TMPRSS2-ERG
endógena fueron radiosensitized por rucaparib (Fig. 1B y Fig. S2A). Estas células son dependientes de
TMPRSS2-ERG
ya que dejan de proliferar cuando se agota por siRNA (datos no presentados). Por lo tanto, las células PC3 se transfectaron con el
TMPRSS2-ERG
isoforma de fusión III, el gen de fusión más común CaP. Su expresión estable no tuvo un efecto significativo sobre la radiosensibilidad, estimado por ensayos de supervivencia clonogénicas (Fig. S1B) y por χH2AX y 53BP1 focos. Sin embargo, cuando se administró junto con rucaparib, el número de colonias se redujo significativamente (p = 0,0105) (Fig. 7B). Este efecto era comparable a lo que se obtuvo en células PC3 tratadas con la DNA-PKcs NU7441 inhibidor. La combinación rucaparib radiosensitized aún más estas células (p = 0,0005), en un grado comparable a células que expresan el
TMPRSS2-ERG
gen de fusión tratada con rucaparib (Fig. 7A). Un mayor número de 53BP1 y χH2AX focos eran visibles incluso a la tasa de dosis más baja, lo que demuestra, además, que rucaparib es un potente radiosensibilizador de células de CaP que albergan un gen de fusión (Fig. 7C).
A, ensayo de supervivencia Clonigénicas en las células PC3 siguientes 4 Gy de radiación ± 2,5 M rucaparib y los DNA-PKcs inhibidor NU7441 (500 nM, panel izquierdo). B, ensayos de supervivencia clonogénicos en células PC3 y derivados que expresan la fusión TMPRSS2-ERG III a diferentes dosis-tasas de ± 2,5 M rucaparib. C, La inmunotinción para χH2AX y 53BP1 en células PC3 que expresan el gen de fusión radiación ± tratamiento rucaparib siguiente para 24 h. Las barras de error representan desviación estándar de la media (n = 3) guía empresas
Discusión
Rucaparib (CO-338, anteriormente conocido como AG014699 y PF-01367338)., un PARPi representa una nueva clase de agentes con actividad antitumoral documentada frente a líneas celulares humanas y xenoinjertos con adición de mutado o silenciado epigenetically BRCA1 /2 [4], [27]. El trabajo previo ha establecido que PARP-1 interactúa con TRMPRSS2-ERG, proporcionando así una lógica mecanicista para el uso de PARPi en el gen de fusión ETS-positivo CaP [3]. Aquí se muestra por primera vez su eficacia como un sensibilizador de radiación en un panel de líneas celulares de CaP, con máxima sinergia logra con una tasa de dosis baja (LDR) en lugar de la dosis de radiación convencional. Las dosis utilizadas aquí LDR mimick las empleadas en la práctica clínica para el CP brachythrepay [28]. Creemos que este hallazgo es importante, ya que la braquiterapia es más eficaz que la radioterapia de haz externo para el tratamiento del CaP, y se puede emplear mecanismos moleculares que promueven una mayor radiosensibilidad de las células cancerosas, en nuestro estudio a través de la senescencia mejorada. De hecho, la inhibición química de la actividad de PARP-1 inducida marcada radiosensibilización de varias líneas de células tumorales en crecimiento exponencial en el intervalo de dosis desde 5 hasta 30 cGy. LDR radiosensibilización de dividir activamente células tumorales por PARPi sugiere que pueden tener un papel en la mejora de la eficacia de los regímenes ultra-fraccionadas o LDR [29]. Nuestros estudios indican que rucaparib es un muy potente PARPi que sinergiza con dosis clínicas de radiación logrado durante la braquiterapia. Su uso como rediosensitizer es eficaz incluso cuando la dosis de radiación se reduce en gran medida, una situación que se presenta como "semillas" radioactivas descomposición durante la extensa vez que se utilizan en pacientes con CaP.
Rucaparib, el primero que fue PARPi desarrollado y probado en la clínica (en 2003 bajo el nombre AG014699) [22], [23], también se ha demostrado ser eficaz en xenoinjertos de tumores de mama, pulmón, colon, colorrectal, y cáncer de páncreas [27], [30 ]. Al mismo tiempo, se ha demostrado que es no tóxica en ratones que llevaban al menos una copia funcional del gen BRCA2. Nuestro estudio es el primero que se ha realizado para rucaparib en el CaP. Si bien no hemos realizado estudios de xenoinjertos similares, en base a los informes anteriores con diversos tipos de tumores, todo indica que estos resultados se traducen a los modelos de xenoinjertos CaP.
Rucaparib ha sido examinado en combinación con varios agentes quimioterapéuticos. Se encontró para ser eficaz en combinación con platino en mama y modelos de xenoinjerto de cáncer de ovario [27], [31]. Nuestro estudio es el primero en examinar su eficacia en combinación con radioterapia. Otros PARPi, en combinación con la irradiación, se informó a causar retraso en el crecimiento tumoral significativa en el cáncer de pulmón
in vivo y modelos [8], y para ser sensibilizadores eficaces tanto en pulmón y de células CaP líneas [32]. Sensibilización a la radiación y los agentes alquilantes se ha mejorado en las células de reparación de DSB deficientes en [33], en consonancia con la notable sensibilidad a la inhibición de PARP de BRCA-1 y BRCA células tumorales-2-deficiente [6]. El ABT-888 (veliparib) PARPi se demostró recientemente para potenciar la respuesta de células de CaP y los tumores a la radiación en DU145 y PC3 células [34]. La combinación de ABT-888 con 6 Gy dio como resultado la regeneración del tumor retardado en comparación con cualquier agente solo sólo en tumores de xenoinjertos PC3, mientras que los tumores DU145 continuaron creciendo. Al igual que en nuestros estudios, PC3 pero no células DU145 y los tumores fueron demostrado que contienen células senescentes abundantes que muestran persistente daño en el ADN focos [34]. Se demuestra que es eficaz en rucaparib adicional
PTEN
células deficientes incluidas las que albergan las fusiones de genes ETS. Evidentemente, la eficacia de PARPi puede depender de una respuesta senescencia competente al daño del ADN acumulado, como cuando
PTEN
es deficiente o cuando el
TMPRSS2-ERG
se expresa. Un estudio reciente ha encontrado que radiozensitization rucaparib puede ser también dependiente de NF-kB [35]. En este estudio se muestra que
TMPRSS2-ERG
, además de
PTEN
deficiencia, pueden sensibilizar a PARPi, que un efecto sinérgico con la radioterapia.
Dado que las mutaciones en BRCA1 /2 que proporcionan un "
letalidad sintética
" relación con PARPi son raros en el CaP, existe un interés considerable en la definición de otros marcadores moleculares para la sensibilidad PARPi. De hecho, la sensibilización a PARPi Recientemente se ha demostrado que ser aumentada mediante el bloqueo de la señalización de daños en el ADN, a través de ATM /Chk2 [36], [37] y el complejo MRN través Mre11 [38]. Por el contrario, el bloqueo de DNA NHEJ reparación a través p53BP1 [39], de hecho, puede contrarrestar la exquisita sensibilidad a PARPi causada por deficiencia de BRCA1 [40]. Por otro lado, la expresión de p53 en nuestro panel de células CaP y un informe reciente [39] no hizo una diferencia ya que ambos nula p53 (PC3) o dominio del p53 (LNCaP, C4-2) las células respondió así a PARPi como radiosensibilizador. La respuesta fue más bien depende principalmente de una respuesta senescente competente, que estaba ausente en las células DU145 que tienen un funcional
PTEN
alelo y una truncada, no funcional supresor de tumor retinoblastoma [41].
ETS fusiones de genes se encuentran en la mayoría de los casos de CaP [26]. La expresión del gen de fusión es responsable de la proliferación celular en células de CaP que expresan el
TMPRSS2-ERG
[42]. próstatas de ratones carentes de
pantalla mejorada PTEN
génesis tumoral en presencia de sobreexpresa ERG [43]. Un informe reciente mostró que la expresión del gen de fusión altera radio y quimio-sensibilidad cuando se administra la radiación de rayos X en combinación con paclitaxel [44]. Similar a BRCA1 deficiencia /2, los inhibidores de PARP-1 mejoran el grado de daño en el ADN promovido inicialmente por la sobreexpresión de genes de fusión [3]. Por lo tanto, las células tumorales de próstata que albergan las fusiones de ETS, como
TMPRSS2-ERG ¿Cuáles son más propensos a la sólida respuesta a PARPi, solo en en combinación con LDR. Otro estudio ha, sin embargo, encontró que los
PTEN
deleción en células de CaP no necesariamente asociarse con pérdida de la función RAD51 [25], con una sensibilidad diferente a un PARPi estando asociado lugar con un defecto en la expresión MRE11. Hemos descubierto que la inhibición de la DNA-PKcs por
TMPRSS2-ERG (datos no mostrados)
tiene un papel fundamental para la activación de la senescencia. Sorprendentemente, DNA-PKcs expresión se ha demostrado recientemente para predecir la respuesta a la radioterapia en el CaP [45].
Además de su papel en el daño y reparación del ADN, un papel de la transcripción también se ha atribuido a la PARP-1 [3], lo que indica más recientemente que se requiere para la función de receptor de andrógenos, en particular en modelos resistentes a la castración de CaP [46].