Extracto
El carcinoma de células renales (CCR) es el sexto cáncer más común en los EE.UU.. Mientras que el CCR es altamente metastásico, hay opciones terapéuticas disponibles para algunos pacientes con CCR metastásico, y la supervivencia libre de progresión de los pacientes, incluso con las terapias dirigidas más reciente es sólo hasta dos años. Por lo tanto, se necesitan desesperadamente nuevas dianas terapéuticas para esta enfermedad. En base a los estudios previos que muestran la metabolómica alteración de α proliferadores de peroxisomas (PPAR receptor activado) eventos relacionados en el paciente RCC y materiales de xenoinjerto en ratones, esta vía se examinó en el estudio actual en el entorno de CCR. PPAR es una proteína de receptor nuclear que funciona como un factor de transcripción de genes, incluyendo los que codifican enzimas implicadas en el metabolismo de energía; mientras que PPAR ha sido reportado para regular el crecimiento de tumores en varios tipos de cáncer, no ha sido evaluado en RCC. Un antagonista específico de PPAR, GW6471, inducida tanto la apoptosis y detención del ciclo celular en G0 /G1 en la BVS (+) y VHL (-) las líneas celulares de RCC (786-O y Caki-1) asociado con la atenuación del ciclo celular proteínas reguladoras c myc, ciclina D1 y CDK4; estos datos se confirmó como específico para PPAR antagonismo por métodos siRNA. Curiosamente, cuando la glucólisis fue bloqueado por varios métodos, la citotoxicidad de GW6471 se incrementó de forma sinérgica, lo que sugiere un cambio a la oxidación de ácidos grasos de la glucólisis y proporcionar un enfoque terapéutico totalmente nuevo para el CCR
Visto:. Abu Aboud O, Wettersten HI, Weiss RH (2013) la inhibición de PPAR induce la detención del ciclo celular y apoptosis, y sinergia con la glucólisis inhibición en células de cáncer de riñón. PLoS ONE 8 (8): e71115. doi: 10.1371 /journal.pone.0071115
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: April 9, 2013; Aceptado: June 26, 2013; Publicado: 7 Agosto, 2013
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Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R01CA135401-01A1 y 1R01DK082690-01A1 (a RHW) y el Servicio Médico de los EE.UU. Departamento de Asuntos de Veteranos (a RHW). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma de células renales (CCR) es globalmente el cáncer más común 13, y uno de los pocos cánceres cuya incidencia está aumentando por razones que no están del todo claras, pero pueden estar relacionados con el tabaquismo y la obesidad (revisado en [1 ] y [2]). En los últimos años, las terapias dirigidas se han vuelto cada vez más disponibles y han mostrado una promesa considerable para el tratamiento de RCC y otros tumores malignos; Sin embargo, incluso con tales terapias esperanza de vida en general, sólo se extendió por menos de un año, debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos [3]. En vista del creciente número de pacientes que se presentan con enfermedad en etapa tardía y la prevalencia de la resistencia a los fármacos disponibles en la actualidad, se necesitan desesperadamente nuevas dianas terapéuticas. La identificación de estos objetivos podría conducir tanto al diseño de nuevos fármacos y /o para la reevaluación de los medicamentos existentes para su uso en pacientes con CCR.
El peroxisoma α del receptor activado por el proliferador (PPAR) pertenece al receptor de hormonas esteroideas superfamilia [4]. Hasta la fecha, tres subtipos de PPAR (α, ß, y γ) se han identificado en muchas especies, incluyendo los seres humanos [5]. Como ocurre con otros receptores de hormonas esteroideas, tras la activación del ligando, los PPARs heterodimerizan con el receptor de retinoide X (RXR), se unen a la secuencia del promotor específico (el elemento de peroxisomas respuesta proliferador o PPRE), y como resultado desencadenan la expresión de una variedad de los genes diana [6] incluidos los que participan en la glucosa, lípidos y metabolismo de los aminoácidos [7].
Los receptores PPAR tener un importante, aunque probablemente pleiotrópicos dado sus múltiples funciones, el papel de malignidad. Si funcionan como supresores tumorales o inductores de cáncer es todavía incierto; tales funciones pueden estar relacionadas con el tipo de cáncer y /o microambiente específico del tumor. Mientras que la supresión tumoral por PPAR se ha informado en algunos tipos de cáncer incluyendo melanoma [8] y glioblastoma [9], PPAR también se ha encontrado para dar lugar a la progresión del crecimiento tumoral en otros tipos de cáncer incluyendo el carcinoma hepatocelular [10] y el cáncer de mama [11]. En nuestro estudio continuo de cáncer de riñón utilizando métodos metabolómica, encontramos firmas metabólicas de modulación de PPAR en una célula RCC humano (Caki-1) modelo de xenoinjerto en los tres "matrices" (tejido, suero y orina) [12]. Si este resultado se debe a la causalidad de la activación de PPAR en la oncogénesis o si se trata simplemente de un cáncer "firma" no se determinó en este estudio. Sin embargo, este hallazgo nos llevó a evaluar los agonistas y antagonistas de PPAR, por primera vez, como posibles terapias de RCC.
Ahora demuestran, utilizando un antagonista específico PPAR, así como métodos de siRNA, que PPAR antagonismo resultados específicos en detención del ciclo celular temprana, así como la apoptosis en líneas celulares de RCC. Por otra parte, aportar pruebas de que cuando las células de RCC se ven privados del sustrato de la glucólisis, se vuelven más sensibles a los antagonistas de PPAR, lo que sugiere que las células RCC alteran sus vías de metabolismo energético en estas condiciones, y que apunta a la viabilidad de la combinación de antagonistas de PPAR y inhibidor de la glucólisis la terapia de esta enfermedad.
Materiales y Métodos
líneas celulares
líneas celulares de RCC, Caki-1 y 786-O se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville , MD, EE.UU.), y el "riñón humano normal" (NHK línea celular) se obtuvieron de Lonza (Basilea, Suiza). 786-O y las células Caki-1 se mantuvieron en las células RPMI y NHK se mantuvieron en DMEM, tanto suplementado con 10% FBS, 100 unidades /ml de estreptomicina, y 100 mg /ml de penicilina. Las células se mantuvieron en 5% de CO
2 y a 37 ° C
Materiales
diapositivas incluidas en parafina fijadas con formalina (hematoxilina eosina [H & amp; E] manchas y sin manchas). de los tejidos archivados RCC fueron obtenidos del Departamento de Patología de la Universidad de California en Davis después de la aprobación del IRB apropiado. El agonista de PPAR, WY14,643 (WY) y el antagonista, GW6471 (GW) se disolvieron en DMSO. WY, GW, DMSO, 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), anticuerpo solución de MTT, y monoclonal de ratón anti-ß-actina se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). 2-DG se disolvió en agua. anticuerpo policlonal de conejo anti-PARP, anticuerpo anti-CDK4 monoclonal de ratón, anticuerpo anti-ciclina D1 policlonal de conejo, y anticuerpo anti-c-Myc policlonal de conejo se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EE.UU.). anticuerpo anti-PPAR policlonal de conejo se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Cabra anti-ratón de cabra HRP anti-conejo conjugado IgG se obtuvieron de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.). Vectashield y DAB sustrato de peroxidasa Kit, 3,3'-diaminobencidina se adquirieron de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE.UU.). solución ECL Plus se obtuvo de Thermo Fisher Scientific (Waltham MA, EE.UU.). El PPAR y siRNA control mezclado se obtuvieron de QIAGEN (Gaithersburg, MD, EE.UU.). Lipofectamina RNAiMAX se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.).
La inmunohistoquímica
RCC humano (grados 1 y 4) y se deparaffinized tejidos normales adyacentes, tratado previamente en tampón de citrato de sodio, y se bloquearon en el tampón de bloqueo (suero de cabra normal al 5% y 0,3% de Triton X-100 en PBS) durante una hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-PPAR monoclonal de ratón de Millipore (Billerica, MA) durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron con TBST y se incubaron con peróxido de hidrógeno 0,3% en TBST durante 15 minutos. Los portaobjetos se lavaron con TBST, se incubaron con HRP de cabra anti-ratón conjugado IgG durante dos horas a temperatura ambiente. Después del lavado, sustrato de peroxidasa DAB Kit, 3,3'-diaminobencidina se aplicó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hematoxilina se utilizó para la tinción de contador. Los portaobjetos se cubrieron con Vectashield.
Ensayo MTT
ensayo de viabilidad celular se realizó como se describe anteriormente [13]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos, y después de los tratamientos indicados, las células se incubaron en mezcla de solución /media MTT. Entonces, la solución de MTT se eliminó y el precipitado cristalino azul en cada pocillo se disolvió en DMSO. absorbancia visible de cada pocillo a 540 nm se cuantificó usando un lector de microplacas.
se realizó Análisis de Ciclo Celular
Análisis del ciclo celular utilizando el Analizador de la célula Muse ™ de Millipore (Billerica, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante . En pocas palabras, después de los tratamientos indicados, las células se lavaron con PBS y se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Después de la tinción, las células fueron procesadas para el análisis del ciclo celular
Ensayo de apóptosis
Anexina V & amp.; Ensayo de células muertas se realizó utilizando el Analizador de la célula Muse ™ de Millipore (Billerica, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, después de los tratamientos indicados, las células se incubaron con anexina V y el reactivo Dead Cell (7-AAD) y los eventos de las células muertas, a finales de la apoptosis, a principios de apoptosis, y en vivo fueron contados.
Immunoblotting
La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [13]. En pocas palabras, después de los tratamientos indicados, las células se lavaron con PBS, se lisaron en tampón de lisis, y se inmunotransfirieron los lisados celulares. Las membranas se bloquearon en leche en polvo sin grasa al 5% durante una hora a temperatura ambiente, se incubaron con los anticuerpos indicados, y después se sondaron con peroxidasa de rábano etiquetados anti-ratón o anticuerpos IgG anti-conejo. La señal se detectó utilizando soluciones ECL Plus.
siRNA transfección
Las células indicadas se sembraron en una placa de seis pocillos para inmunotransferencia o frascos T25 para el análisis del ciclo celular y ensayos de apoptosis. Después de 24 horas, las monocapas de células en aproximadamente 75% de confluencia fueron sometidos a siRNA transfección. La mezcla de transfección se preparó en medio Opti-MEM GlutaMAX de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) con siRNA y Lipofectamine RNAiMAX de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración final de siRNA añadió a las células fueron 100 nM. Las células se cultivaron en presencia de mezcla de transfección durante 24 h y el día siguiente, la mezcla de transfección se reemplazó por medio RPMI fresco, y el cultivo de células se siguió durante 48 horas adicionales. Después de la transfección, se recogieron las células para inmunotransferencia, análisis del ciclo celular o apoptosis ensayo.
Análisis estadístico
Las comparaciones de los valores medios se realizaron con las muestras independientes t-test. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
PPAR muestra el aumento de expresión en alto grado en comparación con el grado RCC bajo
Para comenzar a determinar la relevancia. de PPAR en el RCC, evaluados por primera vez sus niveles de proteína en los tejidos de grado 1 y grado 4 RCC mediante técnicas de inmunohistoquímica. tejidos de RCC archivados tomadas a partir de muestras de nefrectomía se evaluaron por inmunohistoquímica con un anticuerpo específico PPAR. tejidos de RCC con un diagnóstico histológico de Fuhrman grado 4 mostraron tinción pronunciada de PPAR mientras que no hubo tinción mínima de 1 grado tejidos (Fig. 1). De interés, la mayor parte del citoplasma en las células de grado 1 se compone si un constituyente "claro", se sabe que es el glucógeno y lípidos, que no se tiñe con el PPAR anticuerpos [14].
tejidos tumorales de diferente RCC grados Fuhrman se prepararon para inmunohistoquímica, como se describe en Materiales y Métodos y se sondaron con anticuerpo PPAR. Las microfotografías mostrados son representativos de al menos tres pacientes de cada grupo. Bar = 50 micras.
Una específico PPAR antagonista, pero no un agonista, atenuada viabilidad celular RCC
El aumento de los niveles de PPAR observaron en los tejidos de alta ley proporciona poca información relativa a la funcional estatus o propiedades de señalización de este receptor. Para comenzar a responder a esta pregunta, se evaluó el papel funcional de PPAR sobre la viabilidad celular RCC mediante el ensayo de MTT. Tanto Caki-1 (VHL tipo salvaje) y 786-O (VHL mutado), las células se incubaron por separado con un agonista específico PPAR, WY14,643 [15], o un antagonista específico PPAR, GW6471 [16] a concentraciones 12,5-100 se evaluó mu M durante 72 horas, y la viabilidad celular. Mientras que no había efecto en, o ligeramente mayor, la viabilidad celular, RCC WY14,643 ya sea GW6471 de manera significativa y dependiente de la dosis la viabilidad celular inhibida (hasta aproximadamente 80%) en ambas líneas celulares (Fig. 2).
células (Caki-1 y 786-o) fueron tratados con DMSO, WY14,643 (WY), o GW6471 (GW) a las dosis indicadas de 12,5 a 100 mM durante 72 horas y un ensayo de viabilidad celular se realizó como se describe en Materiales &erio; Métodos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres repeticiones. * P & lt; 0,05 en comparación con DMSO. Las barras de error indican la desviación estándar.
El PPAR Antagonista causó Tanto la detención del ciclo celular y la apoptosis en ambas líneas celulares
La disminución de la viabilidad celular observada después de la incubación de ambas líneas celulares de RCC con el PPAR antagonista GW6471 podría ocurrir como resultado de cualquiera de disminución de la proliferación, la inducción de apoptosis, o ambos. Para comenzar a responder a esta pregunta, primero se evaluó la proliferación celular mediante citometría de flujo métodos. Ambos tipos de células se incubaron con GW6471 o DMSO vehículo durante 24 horas después de lo cual se realizó el análisis del ciclo celular. GW6471 detenido el ciclo celular en la fase G0 /G1 en las células Caki-1 y 786-O (Fig. 3), lo que sugiere que el ensayo de MTT es, al menos en parte, lo que indica la detención del ciclo celular.
células de RCC (Caki-1 y 786-o) fueron tratados con DMSO (Cont) o GW6471 (GW) 25 mM durante 24 horas y el análisis del ciclo celular se realizó como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres repeticiones.
Para determinar si PPAR antagonismo dio lugar a la apoptosis, además de la detención del ciclo celular, el próximo evaluó la tinción de anexina V en condiciones similares a las anteriores. Después del tratamiento de ambas líneas celulares con GW6471 o DMSO durante 24 horas se sometieron las células a análisis de flujo citometría después de la tinción con anexina V como se describe en Materiales y Métodos. Según la evaluación de la clasificación de células, GW6471 aumentó la cantidad del total de células apoptóticas en ambas líneas celulares Caki-1 y 786-O (Fig. 4A). Para confirmar la apoptosis en estas condiciones, también se evaluó la escisión de PARP en las células tratadas con GW6471 en comparación con DMSO (Fig. 4B). Tomados en conjunto, estos datos indican que la señal reducida visto en el ensayo MTT después de la incubación de las células con GW6471 se debe tanto a la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis.
A. células de RCC (Caki-1 y 786-O) se trataron con DMSO o GW6471 (GW) a las dosis indicadas durante 24 horas y se realizó un ensayo de apoptosis basado en V anexina como se describe en Materiales y Métodos. células B. RCC (Caki-1 y 786-O) se trataron con DMSO o GW6471 (GW) a las dosis indicadas durante 24 horas y se realizó la inmunotransferencia como se describe en Materiales y Métodos. ß-actina se inmunotransferencia como control de carga. Los datos mostrados son representativos de al menos tres repeticiones.
Para evaluar más a fondo el mecanismo de la detención del ciclo celular y la inducción de apoptosis por GW6471, que mide los niveles de ciclo celular y la apoptosis proteínas de señalización relevantes que intervienen en la regulación de la puesto de control de G0 /G1. Ambas líneas celulares fueron tratadas durante 24 horas con GW6471, a continuación, el lisado de células se sometieron a inmunotransferencia con CDK4, ciclina D1, y los anticuerpos c-Myc; todas estas proteínas fueron marcadamente disminuida por el antagonista de PPAR, apoyando la detención G0 /G1 observado y lo que sugiere un mecanismo para la misma (Fig. 5).
fueron tratados células de RCC (Caki-1 y 786-O) con DMSO (Cont) o GW6471 (GW) 25 mM durante 24 horas y la inmunotransferencia se realizó tal como se describe en Materiales y Métodos. Las imágenes que se muestran son representativos de al menos tres pacientes de cada grupo.
siRNA transfecciones confirmar la especificidad del inhibidor de PPAR
Para confirmar que los efectos observados con la inhibición GW6471 son específicos de PPAR inhibición, se utilizó un enfoque de siRNA. células Caki-1 se transfectaron transitoriamente con un PPAR siRNA o revueltos control de secuencia de siRNA como se describe en Materiales y Métodos. En comparación con el control de siRNA, PPAR siRNA atenuada niveles de proteína de PPAR (Fig. 6A) similares a lo que se observó con GW6471 en esta línea celular (comparar la Fig. 6A a la Fig. 5 panel de la izquierda), confirmando tanto la eficacia del ARNsi y especificidad de GW6471 hacia PPAR. Se hicieron varios intentos para transfectar células 786-O con el siRNA idénticos pero estos no tuvieron éxito.
células Caki-1 se transfectaron con ARNsi de control o PPAR siRNA a 100 nM durante 72 horas y se procesaron para la inmunotransferencia, célula El análisis del ciclo, y ensayo de apoptosis como se describe en Materiales y Métodos. nivel de proteína A. PPAR fue atenuada en las células transfectadas con PPAR siRNA. B. PPAR siRNA transfección detenido ciclo celular en la fase G0 /G1. C. CDK4, ciclina D1, y c-Myc los niveles de proteína fueron atenuados en las células transfectadas con PPAR siRNA. D. PPAR siRNA transfección indujo apoptosis. Los datos que se muestran son representativos de al menos tres repeticiones.
Para confirmar que el ciclo celular y la apoptosis eventos observados con GW6471 de incubación fueron de hecho, debido a la inhibición de PPAR y no fuera de objetivo efectos de la antagonista, se evaluaron las células en condiciones de siRNA transfección paralela a GW6471 incubación. siRNA transfección de células Caki-1 detenido el ciclo celular en G0 /G1 (Fig. 6B), los niveles de proteína atenuadas de CDK4, ciclina D1, y c-Myc (Fig. 6C), y la apoptosis inducida (Fig. 6D) en una de manera idéntica a lo que se observó con el tratamiento GW6471, lo que indica que la detención del ciclo celular y la atenuación de estas proteínas por GW6471 era de hecho debido a PPAR antagonismo. Por lo tanto, los efectos de GW6471 en el ciclo celular, sus proteínas reguladoras, y la apoptosis resultado de antagonismo PPAR específica.
PPAR antagonismo y glucólisis Inhibición sinérgica Atenúa RCC viabilidad celular
Desde PPAR ha sido conocida para activar la oxidación de ácidos grasos (FAO) y para disminuir la utilización de la glucosa [17], la hipótesis de que el antagonismo PPAR podría causar que las células para disminuir su dependencia de la FAO y por lo tanto dependen de la glucólisis exquisitamente por su fuente de energía; tal hallazgo sugiere un enfoque novedoso para la utilidad clínica de los antagonistas de PPAR, especialmente con respecto a la terapia RCC. Para evaluar esta hipótesis, las células tratadas con GW6471 RCC y /o la glucólisis inhibidor 2-DG y la viabilidad celular se mide a continuación. En estas condiciones, había una atenuación sinérgica de la viabilidad celular con GW6471 y 2-DG. Para confirmar que 2-DG, que compite con la glucosa y por lo tanto atenúa la glucólisis celular, estaba causando las células para disminuir la utilización de la glucosa, se trataron las células con GW6471 cultivadas en medio de glucosa empobrecido. Tanto el tratamiento como glucosa agotamiento sensibilizado células RCC 2-DG de PPAR antagonismo (Fig. 7), lo que sugiere la dependencia basal de las células RCC en inducida por PPAR FAO de tal manera que las células cambian a la glucosa dependencia cuando la FAO se atenúa con la inhibición de PPAR. Para evaluar las diferencias potenciales en RCC en comparación con líneas de células "normales" listos para el consumo, hemos realizado experimentos paralelos en una línea celular de riñón "normal" humana (NHK) obtenido comercialmente y encontramos cambios similares (Figura S1). Estos datos sugieren que la inhibición dual de PPAR y la glucólisis es un novedoso enfoque terapéutico potencial y poderosa combinación para el CCR.
A. células de RCC (Caki-1 y 786-O) fueron tratados con DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 mM, y /o 2-DG (5 mM) durante 72 horas y la viabilidad celular ensayo se realizó como se describe en Materiales y métodos. B. Las células RCC (Caki-1 y 786-O) fueron tratados con DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 mM, medios bajos niveles de glucosa (Glu Mín), o GW6471 en el bajo nivel de glucosa durante 72 horas y la viabilidad celular se determinó mediante análisis un ensayo de MTT como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados son representativos de al menos tres repeticiones. ** Efecto sinérgico en comparación con cada tratamiento por separado. Las barras de error indican la desviación estándar
Discusión
CCR es el sexto cáncer más común en los EE.UU., y es uno de los pocos cánceres cuya incidencia está aumentando actualmente.; la 5-y supervivencia de los pacientes con CCR metastásico es un triste 26% (TNM Etapa IV sobre la base de las estadísticas de 2005) [18]. Para los aproximadamente un tercio de los pacientes que se presentan con enfermedad metastásica, hay varios medicamentos aprobados por la FDA disponibles, entre ellos los inhibidores de la multi-quinasa (por ejemplo sorafenib y sunitinib) [19] y la diana de la rapamicina inhibidores (mTOR) [ ,,,0],20]. Dado que la supervivencia libre de progresión a pesar de estos nuevos medicamentos es un ínfimo de dos años, y debido a que casi todos los pacientes que inicialmente se presentan con sucumben cáncer metastásico de su enfermedad [21], es esencial para explorar nuevos enfoques terapéuticos para los pacientes con CCR metastásico.
PPAR es un factor de transcripción activados por ligando que pertenece a la superfamilia de receptores hormonales nucleares [22]. Este receptor se ha demostrado que estimula el metabolismo de ácido graso [17], para atenuar la glucólisis [17], y para regular la tumorigénesis a través de la promoción de la transcripción de sus genes diana [23] - [28]. A pesar de un amplio conocimiento de los diversos objetivos de PPAR, el papel preciso de este receptor en la regulación de cáncer es todavía incierto
.
PPAR agonistas han demostrado disminuir el crecimiento de melanoma, glioblastoma, y fibrosarcoma, y estos efectos se han asociado con la inhibición inducida por PPAR de la proliferación celular endotelial, así como PPAR dependiente de la regulación por disminución del citocromo P450, lo que resulta en la inhibición de la neoangiogénesis [29], [30]. Por otra parte, la activación de PPAR se ha demostrado que aumenta la proliferación en líneas celulares de cáncer de mama [11]. Por otra parte, la administración a largo plazo de los agonistas PPAR causado cáncer de hígado en roedores [31], y
Pparα-
nula ratones eran resistentes a los efectos de los agonistas PPAR hepatocarcinogénica [31], [32]. Estos datos muestran que PPAR juega un papel pleiotrópico en el cáncer, sino si funciona como un supresor de tumor o una oncoproteína parece depender del tipo de cáncer, o incluso tipo de célula altamente.
Como base para este estudio, se descubierto recientemente una firma metabólica de RCC en ratones xenoinjertados con RCC humano (Caki-1) células [12]. Nuestro estudio es apoyado por otro en los cánceres genitourinarios comparan mRNA y de perfiles de miARN, que mostró evidencia de una vía PPAR enriquecido en RCC, pero no en el cáncer de vejiga [33]. Si bien estos estudios apoyan un efecto oncogénico de PPAR en el RCC, no se han evaluado los mecanismos moleculares de la tumorigénesis por PPAR y un enfoque terapéutico potencial de inhibición de PPAR en el CCR. En el presente estudio se muestra por primera vez que el PPAR antagonismo atenúa el crecimiento celular RCC a través detención del ciclo celular /fase G1 G0 y la inducción de la apoptosis asociada con una disminución de CDK4, ciclina D1, y los niveles de c-Myc.
Si bien se han realizado estudios que muestran alteración de la regulación de los metabolitos relacionados PPAR [12] y los genes [33] en el RCC, ningún estudio ha demostrado de los niveles reales de proteína PPAR asociados con la tumorigénesis. En este estudio, se muestran un aumento de los niveles de PPAR en alto grado los tejidos de RCC en comparación con los tejidos de baja calidad, lo que sugiere que los niveles de proteína PPAR se asocia con la agresividad del CCR. Debido a PPAR regula la oxidación de ácidos grasos (FAO) a través de su transcripción de genes diana [34], ya la luz del hecho de que las alteraciones dependientes de grado de las vías de energía (incluida la FAO), las proteínas se ha informado [35], es posible que PPAR al menos parcialmente juega un papel en las diferencias de agresividad y el metabolismo de la energía en función de su grado en el CCR. Esta posibilidad es apoyada por el hallazgo de que las células RCC de bajo grado tienen más extensa citosol claro, que consiste en lípidos y glucógeno, que las células de grado superior [14], [36].
Para evaluar si es un PPAR potencial diana terapéutica viable para el CCR avanzado, se analizó la eficacia de PPAR antagonismo utilizando un antagonista específico de PPAR, GW6471, en líneas celulares de RCC. Nuestros datos muestran, por primera vez que tal manipulación causó la detención del ciclo celular G0 /G1, así como la inducción de la apoptosis. Es posible que estos eventos están relacionados con alteraciones del metabolismo de la energía que han sido bien estudiados en células normales y en muchas enfermedades, incluyendo las enfermedades cardiovasculares y el cáncer, en el que PPAR se ha sugerido como una diana terapéutica [10], [17], [ ,,,0],37], [38]. A nuestro entender, el nuestro es el primer estudio que demuestra la detención del ciclo celular mediante la inhibición de PPAR en el CCR.
PPAR antagonismo por tanto GW6471 y un siRNA presenta descensos para c-Myc, ciclina D1 y CDK4. Estos resultados están apoyados por un estudio que mostró aumentos PPAR-dependientes de c-Myc, ciclina D1, y la proteína CDK4 [39] por el agonista PPAR WY-14643 en células de hígado de ratón de tipo salvaje, pero no en las células nulas PPAR. El proto-oncogén celular,
c-myc, España se asocia con una variedad de cánceres humanos y está fuertemente implicado en el control de la proliferación celular, la muerte celular programada, y la diferenciación [40]. PPAR se ha demostrado para estabilizar la proteína c-Myc través de la represión de la let-7c miARN [41]. Por lo tanto, es posible que la atenuación de la proteína c-Myc en células de RCC por PPAR antagonismo era mediante el aumento de let-7c que resulta en la estabilidad disminuida de c-Myc. El complejo de ciclina D1 /CDK4 promueve la progresión del ciclo celular a través de la fosforilación de su sustrato incluyendo pRb (revisado en [42]). La atenuación de c-Myc reprime la expresión de ciclina D1 /CDK4 y la actividad en la transición G1 /S [43], [44]. Estos hallazgos sugieren que nuestra observación de que PPAR inhibición resultados en los niveles de c-Myc se redujo pueden ser responsables de la disminución de la ciclina D1 /CDK4 y de ese modo causar la detención del ciclo celular observado en G0 /G1 en células de RCC.
A significativa la búsqueda de nuestro estudio fue que la inhibición de PPAR no sólo detenido ciclo celular, pero también causó la apoptosis en células de RCC. Curiosamente, la inhibición de CDK4 Se ha informado de inducir la apoptosis [45], causando translocación de de RelA, el componente principal de NFkB, desde el citoplasma al nucleoplasma y luego a la nucleolo que resulta en la represión de la producción de la proteína anti-apoptótica incluyendo survivin. Debido a que se observó la inhibición de CDK4 profunda después de PPAR antagonismo, es posible que la apoptosis inducida por la inhibición de PPAR fue el resultado de CDK4 atenuación por lo menos en células de RCC.
Para ampliar aún más el potencial de inhibición de PPAR como un enfoque terapéutico, se buscó la combinación de tratamientos que aumentan la eficacia del antagonista PPAR. Dado que una de las funciones de PPAR consiste en el aumento de la FAO [10], así como la disminución de la glucólisis en la transcripción y niveles funcionales que conducen a una disminución de la piruvato y la producción de lactato [17], la hipótesis de que PPAR antagonismo puede resultar en una mayor dependencia de las células la glucólisis debido a la atenuación de la FAO. Nuestro hallazgo de que la eficacia de GW6471 fue significativamente mayor en los medios de comunicación de la glucosa-agotado de los medios de comunicación regulares confirmó además esta suposición y además sugirió que el efecto sinérgico del antagonista de PPAR y el tratamiento de combinación 2-DG fue específicamente debido a la inhibición de la glicólisis y no a efectos fuera de la meta de 2-DG. Además, este hallazgo apoya la futura evaluación de la terapéutica dual que podría ser utilizado simultáneamente con ello atacar RCC en su talón de Aquiles del metabolismo energético.
Nuestros hallazgos de que las células NHK mostraron cambios similares en estas condiciones deben ser moderadas por varios temas . En primer lugar, el comportamiento de todas las líneas celulares, especialmente las células afirma que es "normal", necesitan ser evaluadas en su contexto in vivo antes de sacar conclusiones se pueden sacar de su comportamiento, debido a problemas tales como la influencia de células del estroma, así como citoquinas liberar y otras influencias autocrinos. En segundo lugar, la administración de GW6471 en un modelo de conejo (4 mg /kg como una inyección de bolo IV) [46] resultó en cambios brutos en el riñón o alteraciones en la producción de orina, en comparación con los animales control después de 5 horas (Christopher Lotz, comunicación personal ).
en conclusión, se muestra aquí por primera vez que (1) PPAR está regulada positivamente en los tejidos de RCC de alto grado en comparación con los tejidos de baja calidad, (2) la inhibición de PPAR atenúa la viabilidad celular RCC a través de c-Myc, CDK4 y ciclina D1 disminución mediada detención del ciclo celular y la inducción de apoptosis, y (3) la inhibición de la glicólisis sinergia con PPAR contra la viabilidad celular. Tomados en conjunto, estos datos sugieren la inhibición de PPAR como un nuevo enfoque terapéutico para el CCR avanzado.
Apoyo a la Información
Figura S1.
glucosa agotamiento sinergia con el antagonista de PPAR se produce en células primarias epiteliales normales de riñón humano (NHK). células NHK se trataron con 2-DG y se sometieron a ningún soporte de glucosa como se describe en la Fig. 7. Los datos mostrados son representativos de al menos tres repeticiones. ** Efecto sinérgico en comparación con cada tratamiento por separado. Las barras de error indican la desviación estándar
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