Extracto
El aumento del metabolismo es un requisito para la proliferación de células tumorales. Para comprender la dependencia de las células tumorales en el metabolismo del ácido graso, se evaluaron varios nodos de la vía de síntesis de ácidos grasos. El uso de RNAi hemos demostrado que el agotamiento de la vía de síntesis de ácidos grasos enzimas de SCD1, FASN, o ACC1 en HCT116 células de cáncer de colon resulta en citotoxicidad que es reversible mediante la adición de ácidos grasos exógenos. Este fenotipo condicional es más pronunciado cuando se agota SCD1. Se utilizó esta estrategia de rescate de ácidos grasos para caracterizar varios inhibidores de molécula pequeña de la síntesis de ácidos grasos, incluyendo la identificación de TOFA como un inhibidor potente de SCD1, lo que representa una actividad no descrita previamente para este compuesto. inhibidores de FASN Referencia y ACC muestran citotoxicidad que es menos pronunciada que la de TOFA, y los perfiles de rescate de ácidos grasos coherente con sus objetivos enzimáticos propuestos. Dos inhibidores de referencia SCD1 muestran bajo nanomolar citotoxicidad que se compensa por al menos dos órdenes de magnitud por oleato exógeno. Uno de estos inhibidores disminuye el crecimiento de tumores de xenoinjertos HCT116. Nuestros datos describen una estrategia eficaz para la interrogación de la potencia en el mecanismo y vía de nodo especificidad de inhibidores de la síntesis de ácidos grasos, establecer un vínculo inequívoco entre la síntesis de ácidos grasos y la supervivencia de las células cancerosas, y apuntan hacia SCD1 como un objetivo clave en esta vía.
Visto: Mason P, B Liang, Li L, Fremgen T, E Murphy, Quinn A, et al. (2012) La inhibición de SCD1 cáncer causa la muerte celular por agotamiento del mono-ácidos grasos insaturados. PLoS ONE 7 (3): e33823. doi: 10.1371 /journal.pone.0033823
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 13 Octubre, 2011; Aceptado: February 17, 2012; Publicado: 22 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Mason et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Introducción
El contenido en ácidos grasos de las células en el cuerpo se deriva de la dieta y de la
de novo síntesis. Rápidamente-proliferación de células de cáncer a menudo tienen un sólido programa de síntesis de ácidos grasos acompañada de la expresión de alto nivel de genes asociados, tales como la sintasa de ácidos grasos [1]. Debido a su relativa abundancia en las células cancerosas, la sintasa de ácidos grasos se ha perseguido como objetivo oncología [2]. Sin embargo, no está claro si la sintasa de ácidos grasos representa el componente limitante de la velocidad en la vía de síntesis de ácidos grasos.
ácidos grasos de cadena larga son críticos para la rápida requisito síntesis de la membrana en las células vigorosamente crecimiento y el juego papeles clave en diversos esquemas de señalización [3]. Además, un adecuado equilibrio de la cadena de longitudes y grado de saturación es crítica para el mantenimiento de la fluidez de membrana y la curvatura [4]. Se ha informado de que la inhibición de varios pasos en la vía de síntesis de ácidos grasos provoca la inhibición del crecimiento de células cancerosas, ya sea debido a la deficiencia en ácidos grasos aguas abajo
per se
, o debido a la acumulación de productos intermedios de la vía tóxicos tales como malonil-CoA, o ambos [5].
Usando una combinación de siRNA y los inhibidores de moléculas pequeñas, junto con una estrategia de "ácido graso de complementación", hemos identificado estearoil-CoA desaturasa 1 como una enzima en el graso ruta de síntesis de ácido que es esencial para la viabilidad celular del cáncer. La estrategia de "complementación" permitió la caracterización tanto de SCD1, así como la especificidad de diversos inhibidores de la síntesis de ácidos grasos, y se aclara el mecanismo por el que la inhibición de SCD1 restringe la proliferación de células de cáncer. Nuestros datos describen un vínculo inequívoco entre la síntesis de ácidos grasos y la supervivencia de las células cancerosas.
Resultados
Las células cancerosas son sensibles a la pérdida de la función de SCD1
Para examinar el efecto de la interrupción de síntesis de ácidos grasos en la viabilidad de células de cáncer, se utilizó piscinas siRNA para agotar tres nodos en la ruta para la síntesis de ácidos grasos de cadena larga (Figura 1A). Como se muestra en la Figura 1B, el agotamiento de acetil-CoA carboxilasa (ACC1), la sintasa de ácidos grasos (FASN), o los resultados de estearoil-CoA desaturasa (SCD1) en disminución de la viabilidad (o el metabolismo celular) (medida por los niveles celulares de ATP utilizando Cell- Titer Glo) en células de cáncer de colon HCT116, en un 30%, 30% y 70%, respectivamente, frente a un control siRNA no director, que fue designado como 100% de viabilidad en cada caso, mRNA desmontables se determina por tiempo real RT -PCR a ser aproximadamente 80% (no mostrado). Pensamos que si esta citotoxicidad es verdaderamente gen ligado y en el blanco, y si la interrupción de los resultados vía de síntesis de ácidos grasos en reducción de la viabilidad celular debido a una deficiencia en ácidos grasos aguas abajo en oposición a la acumulación de productos intermedios de la vía tóxicos, a continuación, la citotoxicidad causada por el agotamiento de varios nodos de la vía debe ser rescatable, o prevenir, mediante la adición de ácidos grasos exógenos aguas abajo de dicho nodo. Como se muestra en la Figura 1B, el agotamiento de ACC1 y el agotamiento de FASN son rescatable por palmitato, estearato y oleato, todos los cuales están aguas abajo de ambos ACC1 y FASN. el agotamiento de SCD1 no es rescatable por palmitato o estearato (que están aguas arriba de SCD1), pero el agotamiento de SCD1 es rescatado de manera significativa por oleato (que está aguas abajo de SCD1). la viabilidad celular reducida causada por el agotamiento de los dos genes esenciales del mecanismo no relacionado, PSMD14 y ARN polimerasa II (Pol II) no es rescatado por cualquiera de los tratamientos de ácidos grasos. Esto sugiere que la reducción de la viabilidad celular causada por el tratamiento con estos siRNAs es verdaderamente atribuible al agotamiento del gen diana, y que es causada por una deficiencia en la síntesis de ácidos grasos, en oposición a una acumulación de productos intermedios de la vía tóxicos en la condición de cultivo normal .
de novo síntesis de ácidos grasos monoinsaturados. células B de cáncer de colon HCT116 (ATCC) se cultivaron en RPMI-1640 (Cambrex) que contenía 2% de FBS en placas a una densidad de 4000 células por pocillo en 100 medios de comunicación ul en placas de 96 pocillos se transfectaron con piscinas siRNA (Dharmacon, 50 nM) de orientación tres nodos de ácidos grasos de síntesis de la vía, o dos genes no relacionados, de supervivencia utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 16 horas después de la transfección, las células se trataron con 25 ácidos grasos uM (Sigma, 100 × acciones disueltos en 10% de MeOH /0,9% BSA /PBS) como se indica, y la viabilidad se determinó 72 horas después de la transfección (Cell Titer Glo, Promega). Los resultados se expresan como porcentaje de viabilidad en comparación con las células transfectadas con un control no dirigido siRNA (designado 100% de viabilidad) tratados con el mismo ácido graso. células C DU145 de cáncer de próstata, células de cáncer de colon HCT116 y células de cáncer de páncreas MIA PaCa2 (ATCC) cultivadas en medio RPMI-1640 que contiene FBS al 2% se trataron con siRNAs individuales de orientación SCD1 o PSMD14 (Dharmacon, 25 nM), seguido 16 horas más tarde por tratamiento con oleato como se indica. La viabilidad se determinó 72 horas después de la transfección. Los resultados se expresan como porcentaje de viabilidad en comparación con las células transfectadas con un control no dirigido siRNA (designado 100% de viabilidad) tratados con el mismo ácido graso. células de cáncer de colon HCT116 D colocaron en placas a una densidad de 1000 células por pocillo en 25 medios ul en placas de 384 pocillos fueron tratados con inhibidores de molécula pequeña de ACC1 (CP640186, Pfizer), FASN (# 10v, Merck), o SCD1 (# 7n, Abbott), en medios que contienen ácidos grasos como se indica, 72 horas antes de la Viabilidad determinación. Inibitors se sintetizaron en Genzyme (Waltham, MA).
Para examinar el alcance de la participación de SCD1 en la supervivencia de las células cancerosas, varias líneas celulares de cáncer fueron sometidos a un tratamiento de SCD1 o PSMD14 RNAi, en ambos casos utilizando una siRNA sola. La viabilidad de las células DU145 de cáncer de próstata, células de cáncer de colon HCT116 y células de cáncer de páncreas MIA PaCa2 se reduce (en relación con un control no dirigido siRNA) por el agotamiento de ambos genes, como se muestra en la Figura 1C. En todos los casos, la citotoxicidad SCD1-agotamiento mediada es rescatable por la suplementación de los medios de comunicación con oleato, mientras que en todos los casos el agotamiento PSMD14 no lo es. Esto sugiere que una variedad de células de cáncer depende de
síntesis de ácidos grasos mono-insaturados
para la viabilidad celular, y que SCD1 es un nodo crítico en la vía que puede ser una diana terapéutica adecuada.
la vía de síntesis de ácidos grasos ha sido estudiado en el contexto tanto de enfermedad metabólica [6] y el cáncer [7]. Por lo tanto una variedad de inhibidores de la síntesis de ácidos grasos están disponibles. Nos dispusimos a utilizar la estrategia de rescate de ácidos grasos con varios de estos compuestos, como medio de tanto probar la hipótesis de que la sıntesis de ácidos grasos, y la actividad de SCD1 en particular, son necesarias para la viabilidad de las células del cáncer, y también con el objetivo de comprender mejor las actividades dentro y fuera del mecanismo de la síntesis de ácidos grasos los inhibidores sí mismos. Como se muestra en la Figura 1D, los inhibidores de referencia para ACC1 (Pfizer#CP640186 [8]), FASN (Merck#10v [9]), y SCD1 (Abbott#7n [10]) a todos los perfiles de citotoxicidad y rescate de visualización coherente con la posición vía del objetivo. La toxicidad debida a la inhibición ACC1 y FASN es rescatado por palmitato, estearato y oleato, mientras que la toxicidad debida a la inhibición de SCD1 es rescatado solamente por oleato. También es de destacar que la potencia de estos inhibidores refleja la observación con siRNA. A pesar de que los inhibidores de referencia son de una potencia comparable en los ensayos bioquímicos en sus respectivos objetivos, ACC1 y la inhibición FASN producen una reducción moderada de la viabilidad, mientras que el fenotipo con la inhibición de SCD1 es más pronunciada, lo que sugiere la SCD1 es de manera especialmente útil, tal vez RATE limitación de nodo en esta vía. Estas observaciones también sugieren que los inhibidores de referencia están libres de dominante (no rescatable) toxicidad fuera de mecanismo en este sistema celular. Los ácidos grasos saturados de cadena larga utilizados en el escenario de rescate a sí mismos producen una reducción modesta viabilidad a las concentraciones utilizadas. Es de destacar que estos ácidos grasos saturados son sinérgicos con el inhibidor de SCD1 (Figura 1D). Esto sugiere que mientras la mayor parte del impacto viabilidad visto a la inhibición de SCD1 es debido al agotamiento de ácidos grasos mono-insaturados, la inhibición de SCD1 también reduce la capacidad de las células para mitigar los efectos de los ácidos no naturales, exógenos grasos saturados, presumiblemente por "desintoxicación" de oleato o palmitoleata.
inhibidor de la actividad de la aclaración por complementación
Hemos probado tres inhibidores históricos utilizados ampliamente comerciales de la vía de síntesis de ácidos grasos mediante la estrategia de "rescate de ácidos grasos". Cerulenina y el C75 son inhibidores Fasn [11], [12], y el TOFA es un inhibidor de la ACC1 [13]. Como se muestra en la Figura 2A, la cerulenina y el C75 tanto inhiben la viabilidad celular HCT116 de cáncer de colon como se esperaba. Sin embargo, ninguno de estos inhibidores es sensible a palmitato, estearato, u oleato, lo que sugiere que ambos de estos inhibidores tienen citotoxicidad dominante, no basado en mecanismo en este sistema de células, y que la reducción de la viabilidad celular impulsada por estos compuestos no está relacionada con la inhibición síntesis de ácido graso.
a de colon HCT116 células de cáncer se trataron con molécula pequeña de FASN inhibidores de C75 y cerulenina (Sigma), o el inhibidor de la ACC TOFA (Sigma), en ácidos grasos que contiene los medios de comunicación, como se indica, 72 horas antes de Viabilidad determinación. células HCT116 B se trataron con oleato en varias ocasiones en relación con el momento de la adición TOFA. La viabilidad celular se determinó 72 horas después del tratamiento TOFA. Las células HCT116 C fueron tratados con compuestos en medios que carecen, o contienen, oleato, seguido por determinación de la viabilidad después de 72 horas. células de cáncer de colon HCT116 D cultivadas a una densidad de 1 × 10
6 células por 1 ml de medio por pocillo en placas de 12 pocillos se pre-trataron con TOFA durante una hora, seguido de 13C-palmitato o 13C-estearato o 13C tratamiento acetato (Sigma) durante cuatro horas. Se extrajeron los ácidos grasos etiquetados y ésteres, saponificados, y se analizaron por LC /MS /MS usando un triple espectrómetro de masas cuadrupolo API 5000 o API 4000 (AB Sciex, Forster City, CA) con guión con un 1100 sistema de HPLC Agilent (Agilent, Santa Claire, CA). separación LC se realizó utilizando XBridge fenil columna de 2,1 x 100 mm (Waters, Milford, MA). La fase móvil A consistía en formiato de amonio 5 mM en agua desionizada. La fase móvil B consistía en formiato de amonio 5 mM en metanol. El tampón de carga de muestra consistió en 30% de tampón A y tampón de 70% B. un gradiente lineal se utilizó para la separación (70% a 100% de B en 5 min). Las muestras se ionizan por ESI en el modo de ion negativo y el tiempo de permanencia para el MRM fue de 75 ms.
En este ensayo, la toxicidad TOFA es rescatado eficazmente por oleato, pero no por el palmitato o estearato (Figura 2A), contrariamente a la expectativa de un inhibidor específico de ACC1. Este patrón de rescate de ácidos grasos es consistente con la inhibición de SCD1 TOFA. Alternativamente, la citotoxicidad impulsado por TOFA podría ser por completo fuera del objetivo (unrescuable por palmitato o estearato), y TOFA podría, en principio, interactuar físicamente con oleato en el medio de cultivo tal que oleato simplemente impide TOFA entre en las células. Para probar esta posibilidad, hemos añadido oleato en varias ocasiones en relación con el momento de la adición TOFA, y la viabilidad medido en todos los casos a las 72 horas después del tratamiento TOFA. Como se muestra en la Figura 2B, la adición de oleato de hasta 8 horas después de la adición TOFA se obtiene un grado de "rescate" que es indistinguible de el caso en que se añade el oleato de antes de la adición TOFA. En este caso, TOFA tiene horas para permear la célula e inhibir el objetivo, antes de la introducción de oleato. Esto es incompatible con oleato simplemente la prevención de TOFA entre en las células. Cuando se añade el oleato de 24 horas después de la adición TOFA, la reversión fenotipo se ve comprometida significativamente. Por lo tanto, entre 8 y 24 horas después del tratamiento con TOFA, las células van más allá de un "punto de no retorno", y dejan de responder al oleato cuando se ensaya para la viabilidad a las 72 horas.
Además consideramos que puede ser un oleato promiscuo "citotoxicidad-rescate-agente". Para probar esta posibilidad, hemos probado una variedad de compuestos citotóxicos en el ensayo de oleato de rescate. Como se muestra en la Figura 2C de una variedad de inhibidores de diversos mecanismos de prueba (incluyendo C75 y cerulenina), sólo el TOFA impulsada citotoxicidad es rescatable por oleato. Esto es incompatible con la actuación oleato como general de "rescate-agente".
Para probar la hipótesis de que el "perfil de ácidos grasos de rescate" TOFA realmente refleja la inhibición de SCD1 TOFA, que supervisó la conversión de isótopos estables marcado con ácidos grasos por LC /MS /MS para el flujo de ácidos grasos en la ausencia o presencia de TOFA. Se examinó la desaturación SCD1 mediada de 13C-palmitato o estearato de 13C-a palmitoleato u oleato, respectivamente, y la elongación de 13C-palmitato de estearato después de una exposición TOFA 1-hora. Además, para medir la inhibición ACC1, que supervisó la incorporación de 13C-acetato en palmitato. Como se muestra en la Figura 2D, TOFA inhibe ambos eventos de desaturación SCD1 mediada a una potencia comparable a su EC50 la viabilidad celular, y comparable a su potencia en ACC1. Por el contrario, se requieren niveles sustancialmente más altos de TOFA para efectuar la (no SCD1-driven) elongación de palmitato de estearato. Por lo tanto, basándose en el perfil de rescate de ácidos grasos y la medición directa de la inhibición de SCD1 en las células vivas, TOFA inhibe SCD1, que es una actividad no descrita previamente para TOFA.
En el caso tanto de TOFA y el inhibidor de SCD1#7n (Figuras 1D y 2A), palmitato exógena aumenta el impacto de la inhibición de SCD1. Más allá del hecho de que en este palmitato de ajuste de ensayo muestra cierta inhibición de la viabilidad celular intrínseca, palmitato también quedan turnos de la EC50 para el TOFA y#7n, lo que sugiere que la combinación de palmitato de manera poco natural elevada, y la incapacidad para procesar en oleato, potencia la inhibición de la viabilidad de las células cancerosas.
pistas de inhibición de la viabilidad celular del cáncer con la potencia y el inhibidor de SCD1 representa la ruta desaturación esencial única
Para probar la fidelidad y la correlación de nuestros estudios de viabilidad en ácidos grasos de rescate y el celular SCD1 de inhibición de ensayo LC /MS /MS, hemos examinado tres moléculas inhibidoras de SCD1: TOFA, Abbott#7N, y Abbott#28c [14]. Como se muestra en la Figura 3A,#7N es varias veces más potente que el TOFA, y más-oleato rescatable, en el ensayo de la viabilidad celular, y de manera similar es más potente que el TOFA en el ensayo de inhibición de SCD1 celular directo. Del mismo modo,#28 quater es sustancialmente más potente que el#7 N en el ensayo directo inhibición de SCD1 celular, y también en el ensayo de viabilidad celular, mientras que conserva completamente oleato-rescuability.
A las células HCT116 se trataron y analizaron para la viabilidad celular o la inhibición de SCD1 celular (LC /MS /MS) como se describe anteriormente. B HCT116 se trataron con DMSO o SCD1 inhibidor#28 quater en presencia de varios ácidos grasos (25 uM) (Biomol,#2803) durante 72 horas, y se analizaron para la viabilidad celular. Los datos se muestran como un mapa de calor continuo que va desde (células vivas) (verdes para las células muertas) de color rojo. células HCT116 C fueron tratados durante 36 horas con diversas dosis de los inhibidores de SCD1 como se indica. Las células se lisaron en LDS colorante de carga (Invitrogen) y se analizaron por transferencia de Western para la escisión de PARP (Señalización Celular). La estaurosporina, un inhibidor de quinasa de amplio espectro, se incluyó como control positivo para la escisión de PARP. Las células HCT116 D se trataron como en C, en presencia o ausencia de oleato exógeno, seguido de un análisis de la escisión de PARP.
consideró que otros eventos de insaturación pueden estar disponibles para apoyar la viabilidad de las células del cáncer, a través de desaturasas distinta de SCD1, si se dan las células suministro suficiente de sustrato saturado. Para explorar esta posibilidad, así como para caracterizar adicionalmente la especificidad de la#28 quater SCD1 inhibidor examinamos un panel de ácidos grasos de diferente longitud de cadena y los estados de saturación por su capacidad para "complementar" (evitar el efecto de) SCD1-Inhibidor la reducción de la viabilidad mediada. Como se muestra en la Figura 3B, mientras que no todos los ácidos grasos insaturados complementan, todos los "complementarios" ácidos grasos contenían al menos un enlace insaturado. Por otra parte, todos los ácidos grasos saturados fracasaron para complementar, lo que sugiere que la insaturación es absolutamente necesario para la complementación, y que las actividades de desaturasa alternativas no puede ser empleado.
Examinamos TOFA,#7N, y#28 quater para la inducción de la cascada de la apoptosis. HCT116 células fueron tratadas con dosis de compuestos equivalentes a, o diez veces por encima, su citotoxicidad IC50. Como se muestra en la Figura 3C, los tres inhibidores de la síntesis de ácidos grasos inducen la escisión de PARP en una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere que la interrupción de la síntesis de ácidos grasos en estas células provoca apoptosis. La inducción de la escisión de PARP se correlaciona con la muerte celular en que es reversible con oleato exógeno (Figura 3D). PARP división es un marcador de la apoptosis [15].
inhibición de SCD1 ralentiza el crecimiento del tumor y no es tóxico
universalmente
El impacto del agotamiento de SCD1 en varias líneas celulares de cáncer plantea la posibilidad de que la inhibición de SCD1 se universalmente tóxico. Hemos probado la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 para la sensibilidad a un inhibidor de SCD1 referencia. Como se muestra en la Figura 4A, el inhibidor de SCD1 ha impacto sobre la viabilidad celular SKOV3 limitado, frente HCT116, a pesar de tener efecto inhibidor comparable en la conversión celular de estearato de oleato (actividad de SCD1). Consideramos que SKOV3 puede ser generalmente insensibles a diversos agentes tóxicos. Como se muestra en la Figura 4B, SKOV3 y HCT116 son comparativamente sensibles a una variedad de compuestos tóxicos mecánicamente-distintas, tales como dimetilesfingosina y daunorrubicina, mientras que en el caso de los inhibidores de SCD1, SKOV3 es bastante insensible con relación a HCT116. Esto sugiere que SKOV3 tiene cierta insensibilidad a la inhibición específica de ácidos grasos-síntesis, y que la inhibición de SCD1 no será universalmente tóxico.
A HCT116 o células SKOV3 fueron tratados y analizados para la viabilidad celular o la inhibición de SCD1 celular (LC /MS /MS) como se describe anteriormente. células B HCT116 o SKOV3 se trataron y analizaron para la viabilidad celular. Tabla expresa la relación de SKOV3 EC50 contra HCT116 EC50. C, ratones desnudos D albergar paso cinco 200 mm3 tumores HCT116 (a pases como fragmentos de trocar) (n = 10 por grupo) se dosificaron mediante sonda oral dos veces al día con 160 mg /kg#28 quater durante 20 días o con CPT11 intravenosa en tres días consecutivos comenzando cuando los tumores alcanzaron 200 mm3. El crecimiento del tumor (C) y el peso corporal (D) se monitorizaron y se representaron como media +/- desviación estándar.
inhibidor de SCD1#28 quater, se ha descrito recientemente por Abbott [14] como un potente, orally- disponibles inhibidor de SCD1 con propiedades farmacocinéticas favorables. Por lo tanto esta molécula proporciona una herramienta para
in vivo
SCD1 validación de dianas para el cáncer. Nos trataron ratones portadores de tumores HCT116 200 mm3 dos veces al día con#28 quater por sonda oral (frente IV CPT11 en un régimen de dosificación optimizada) durante 20 días y se controló el crecimiento del tumor y el peso corporal. Al igual que en la figura 4C,#28 quater mostró un retraso moderado crecimiento de los tumores HCT116. Mientras que el inhibidor de SCD1 hizo reducir el contenido de oleato de los tumores extirpados (no mostrado), oleato sustancial permaneció en el tejido tumoral, el aumento de la posibilidad de que el oleato de la dieta puede ser limitante para la eficacia del inhibidor de SCD1. El tratamiento con el inhibidor de SCD1 fue acompañada por pérdida de peso se aproxima al 20%, o la reducción de 20 g a aproximadamente 16 g, en dosificación día 10 (día de estudio 26) (Figura 4D) que se recuperó después de la interrupción de la dosificación (estudio de día 36). No está claro si esta pérdida de peso es el mecanismo para este inhibidor (como podría esperarse de un inhibidor de la síntesis de lípidos), o no relacionado con la inhibición de SCD1.
Discusión
Las células cancerosas son distintos a partir de células no malignas basados en parte en su estado metabólico único, uno de cuyos elementos es un requisito inusual para la síntesis de ácidos grasos [16]. Así, la vía de síntesis de ácidos grasos ha sido un objetivo atractivo para el cáncer de algún tiempo, y la atención primaria se ha centrado en la sintasa de ácidos grasos, que marca el punto de producción de ácidos grasos de cadena larga [17]. Nuestros experimentos y otros [18] sugieren, sin embargo, que el paso determinante de la velocidad en la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados está en el punto de de-saturación (por SCD1), y que SCD1 representa un nodo particularmente vulnerables en esta vía. El uso de ambos inhibidores de referencia siRNA y, hemos demostrado que la pérdida de rendimientos de actividad de SCD1 pronunciadas inhibición viabilidad de varias células cancerosas
in vitro
. El hecho de que esta inhibición viabilidad es reversible cuando oleato se añade al medio de cultivo celular sostiene que el fenotipo es el mecanismo, y se puede atribuir a una deficiencia de oleato mediada por SCD1-inhibición, en oposición a la acumulación de la vía corriente arriba palmitato u otro intracelular componentes. Proponemos que esta estrategia de rescate de ácido graso es un mecanismo simple, ampliamente útil para la caracterización de la especificidad de ácido graso inhibidor de la síntesis, como se evidencia por nuestra caracterización de la actividad inhibidora de SCD1 de TOFA.
crecimiento del tumor HCT116 se retrasa en el tratamiento con un inhibidor potente, oralmente disponible SCD1 referencia. Sin embargo, el retraso del crecimiento del tumor es moderado, cayendo considerablemente por debajo de la observada con CPT11, que sirvió como control positivo. Es de destacar, sin embargo, que un régimen de dosificación optimizada no se estableció para el inhibidor de SCD1. retraso del crecimiento tumoral fue acompañada por pérdida de peso y disminución del peso corporal se mantuvo durante el transcurso de la dosificación. SCD1 se investigó originalmente como un objetivo para los trastornos metabólicos, y no sería sorprendente que una parte de la pérdida de peso observada se debió a la amplia inhibición de
síntesis de ácidos grasos mono-insaturados
. Además, mientras que los ratones knockout son SCD1 [19], los ratones tienen varias isoformas de SCD viables, que pueden ser redundante. Si la toxicidad (pérdida de peso) que se observa en el estudio actual se debe a la inhibición de la síntesis de ácidos grasos, esto puede ser atribuible al inhibidor de SCD1 focalización múltiple murinos isoformas de SCD. Esto no fue probado. No obstante, en principio, esto podría diferenciar el perfil de toxicidad inhibidor impulsada desde el golpe de gracia SCD1 genética. Alternativamente, la pérdida de peso observada podría ser el efecto neto de la adiposidad reducida impulsado por SCD1-inhibición y mayor gasto de energía, comparable a la observada en el knockout SCD1 [19], [20].
Graso
monoinsaturados ácido maduración y transformación, después de la producción de SCD1, es una red compleja que conduce a una gran cantidad de diferentes longitudes de cadena, estados de saturación, y los destinos de distribución subcelular. Puede ser que mientras SCD1 representa un limitante de la velocidad "punto de constricción" final, en la vía, un objetivo de la enzima aguas abajo, a lo largo de una de una variedad de ácidos grasos de procesamiento de sub-vías mono-insaturados, puede representar un nodo lo que se requiere específicamente para la viabilidad de las células del cáncer, y prescindible para la función celular normal. También puede darse el caso de que la inhibición de SCD1 podría ser productiva en un escenario de co-tratamiento, a dosis bajas en combinación con un agente tradicional.
Materiales y Métodos
Cell Culture
HCT116, células de cáncer DU145, y MIA PaCa2 de la ATCC y se mantuvieron en RPMI1640 (Cambrex) complementado con penn-strep (ATCC) y 5% de FBS (Hyclone). Para los ensayos, las células se colocaron en placas en RPMI 1640 carente de penn-strep y que contiene 2% de FBS a una densidad de 4000 células /100 ul /pocillo en placas de 96 pocillos para el tratamiento de siRNA y determinación de la viabilidad, o a una densidad de 1000 células /25 ul /bien en placas de 384 pocillos para el tratamiento de compuesto y determinación de la viabilidad, o una densidad de 1 × 10
6 células /1 ml /pocillo en placas de 12 pocillos para el tratamiento de compuesto y análisis LC /MS /MS de flujo de ácidos grasos etiquetados . Todas las células fueron cultivadas como una monocapa en el 95% de aire /5% de CO
2, y se usó un solo lote de FBS no sin lípidos para todos los experimentos
Preparación de ácido graso
grasos ácidos (Sigma) se disolvieron en metanol a una concentración de 25 mM. stocks 25 mM se diluyeron diez veces en PBS (Cambrex) que contenía 0,9% de BSA (A9576, Sigma). Estos mM (100X) las existencias de 2,5 se mezclaron a fondo y se incubaron en un baño de agua de 37 grados durante una hora antes de la división en alícuotas y congelar a -20 grados. El panel de ácido graso de Biomol (# 2803) se disolvió en DMSO.
LC /MS /MS Analysis
Todos los experimentos se realizaron utilizando un espectrómetro de triple cuadrupolo API masa 5000 o API 4000 ( AB /MDS Sciex, Concord, Canadá) y una bomba de HPLC Agilent 1100 (Agilent, Andover, MA). Las columnas se XBridge fenil 2,1 × 100 mm (Waters, Milford, MA). El tampón A era agua con formato de amonio 5 mM; tampón B fue metanol formiato de amonio 5 mM; y tampón de carga fue de 30% de tampón A más 70% de tampón B). Un gradiente de 5-min (70% a 100% de tampón B, lineal) se utilizó con el tiempo de adquisición MRM de 75 mseg utilizando el modo negativo. se expresaron grasos determinaciones de síntesis de ácido, ya sea como producto /(producto + sustrato) (en el caso de estearato, palmitoleato, y la síntesis de oleato), o como producto bruto normalizado a ácido linoleico no marcado (en el caso de la síntesis de palmitato).
siRNA transfección
en-blanco-PLUS o siRNAs siGENOME de valores (gen-específica o no orientar los controles) fueron adquiridos de Dharmacon, y se transfectaron (50 nM (12,5 nm por cada una de las cuatro siRNAs) en el caso de las piscinas siRNA (SmartPools), o 25 nM en el caso de siRNAs individuales utilizando Lipofectamine 2000. la secuencia único SCD1 siRNA fue:. GAACAGUGCUGCCCACCUC 5'-3 'la secuencia PSMD14 sola siRNA era: 5'-3-GGCAUUAAUUCAUGGACUA '. Dieciséis horas después de la transfección,
TH volumen de ácido 100 × complejado-BSA grasos (palmitato, estearato, oleato o) (100X = 2,5 mM) o vehículo solo, se añadió 1/100. Setenta y dos horas después de la transfección, se añadió 25 ul Cell-título Glo y las placas se analizaron para la viabilidad celular de acuerdo con el fabricante recomendación (Promega). Todos los análisis se realizaron por duplicado o triplicado, en múltiples ocasiones con resultados similares, y se representan como la media ± desviación estándar de un solo experimento representativo.
pequeña molécula inhibidor de tratamiento
C75, cerulenina y TOFA se adquirieron de Sigma. ACC inhibidor CP640186 (Pfizer), inhibidor de FASN#10v (Merck), y los inhibidores de SCD1#7N y#28 quater (Abbott) se sintetizaron en Genzyme (Waltham, MA). Los compuestos se disolvieron en DMSO y se almacenaron a -20 grados. En el caso de tanto el ácido complejado-BSA graso (o vehículo) y los inhibidores de molécula pequeña (o DMSO), agentes fueron pre-diluido en medio de cultivo de ensayo a 7 × concentración final. 5 ul cada uno de 7 × existencias de dos agentes apropiados esta en medio de 25 ul, de 35 ul volumen final. 72 a 96 horas más tarde, se añadió 7,3 ul Cell-título Glo, y las placas se analizaron para la viabilidad celular. Todos los análisis se realizaron por duplicado o triplicado, en múltiples ocasiones con resultados similares, y se representan como la media ± SEM de un solo experimento representativo.
HCT116 xenoinjerto
Los estudios en animales (# GENZ100507- 20) se llevaron a cabo tras la aprobación de Genzyme Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). tumores HCT116 se hicieron pasar como fragmentos de trocar en
nu /nu
ratones. Los animales que lleven paso cinco tumores se trataron con#28 quater (160 mg /kg dos veces al día la dosis oral durante 20 días) o CPT11 (dosificación intravenosa una vez al día durante tres días consecutivos) cuando los tumores alcanzaron 200 mm3.