Extracto
epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) se expresa ampliamente en el cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, la terapia EGFR tiene sólo una eficacia modesta en el cáncer de cabeza y cuello, a través de mecanismos que no se comprenden totalmente. Aquí, se encontró que la inhibición de EGFR por erlotinib estimuló la fosforilación y la activación de STAT3 conduce a una mayor expresión Bcl2 /Bcl-XL en la cabeza y células de cáncer de cuello, que puede amortiguar la eficacia terapéutica de erlotinib contra el cáncer de cabeza y cuello. Erlotinib-mejorada resultados de fosforilación de STAT3, al menos en parte, de la supresión de su fosfatasa fisiológica, PTPMeg2. caída específica de STAT3 por la interferencia de ARN sensibiliza las células significativamente cáncer de cabeza y cuello a erlotinib tratamiento. La inhibición farmacológica de STAT3 por niclosamida no sólo bloqueado fosforilación de STAT3 estimulada erlotinib sino también reprimida de forma sinérgica el crecimiento del cáncer de cabeza y cuello
in vitro
y
in vivo
. la inhibición combinada de EGFR y STAT3 por erlotinib y niclosamida induce apoptosis de manera más eficaz en los tejidos tumorales sin toxicidad para los tejidos normales. En base a los resultados, el tratamiento con erlotinib en combinación con niclosamida puede ofrecer un enfoque terapéutico eficaz para mejorar el pronóstico de cáncer de cabeza y cuello
Visto:. Li R, S, Z Hu, Chen ZG, Sica GL, Khuri FR, et al. (2013) La inhibición de la STAT3 por Niclosamida sinergia con erlotinib en contra de cabeza y cuello. PLoS ONE 8 (9): e74670. doi: 10.1371 /journal.pone.0074670
Editor: Xiaolin Zi, Universidad de California Irvine, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado: 5 Agosto 2013; Publicado: 3 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por R01CA136534 (XD), NCI P50 CA128613 (DMS) y R33 CA161873 (ZGC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cánceres de cabeza y cuello alinean constantemente entre los seis tipos de cáncer diagnosticados con mayor frecuencia en el mundo [1]. Más del 90% de los cánceres de cabeza y cuello son carcinomas de células escamosas del tracto digestivo superior, incluyendo la cavidad oral, faringe, laringe y senos paranasales (1). El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CECC) constituye un estimado de 2,5% de los diagnósticos de cáncer en los Estados Unidos, con 41,380 nuevos casos diagnosticados y un estimado de 7.890 muertes en 2013 [2]. A pesar de los avances en las terapias convencionales, incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, la tasa de supervivencia general de CECC no se ha mejorado significativamente en los últimos decenios. Factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) se expresa ampliamente en SCCHN y se ha utilizado como un objetivo fundamental para el tratamiento de esta enfermedad [3]. Erlotinib, un inhibidor EGFR de tirosina quinasa (TKI), se ha utilizado para el tratamiento de SCCHN pero su eficacia es modesto [5]. El mecanismo de cuenta de la limitada eficacia de erlotinib en la cabeza y la terapia del cáncer de cuello no se entiende completamente. Es posible que la inhibición de EGFR por erlotinib puede inducir la activación de algunos de señalización de supervivencia vía (s) que inhibe la eficacia de erlotinib contra SCCHN.
STAT3, un miembro de la familia STAT de factores de transcripción, se activa en cánceres de varios, y recientemente ha sido validado como una atractiva diana terapéutica en el tratamiento del cáncer, incluyendo cáncer de cabeza y cuello [6-10]. Además, las muestras de SCCHN también tienen mayores niveles de STAT3 que el tejido normal [11]. Latent STAT3 citoplásmica se activa a través de la fosforilación en el residuo Tyr705 de Janus quinasa asociada (JAK) o factor de crecimiento de tirosina quinasa asociada al receptor (Src) [12]. Fosforilada STAT3 dimeriza a través de un Src homología interacción 2-fosfo-tirosina recíproca y se acumula en el núcleo, donde activa la transcripción de una amplia variedad de genes, incluyendo Bcl2 /Bcl-XL, ciclina D1, c-Myc, etc [13, 14]. Además de las quinasas JAK STAT3 (es decir), la fosforilación de STAT3 también se estrechamente regulada por un proceso de desfosforilación, que está mediada por la proteína tirosina fosfatasa PTPMeg2 [15]. PTPMeg2 se ha identificado recientemente como un nuevo fosfatasa STAT3 fisiológica que desfosforila directamente STAT3 en el residuo Tyr705 [15]. la administración intratumoral de STAT3 señuelo inhibió el crecimiento de tumores de xenoinjertos SCCHN
in vivo
[16], lo que sugiere que STAT3 es una posible diana terapéutica para el CECC. A pesar de la promesa de una serie de enfoques racionales para orientar la función de STAT3, ningún inhibidor de molécula pequeña STAT3 parece estar listo para el desarrollo clínico hasta la fecha [17].
Niclosamida Recientemente se ha descrito como un inhibidor de la STAT3 potente contra el cáncer las células [18]. En este informe, muestran que el erlotinib mejora la fosforilación de STAT3 por regulación a la baja de su fosfatasa PTPMeg2 que conduce a niveles elevados de Bcl2 /Bcl-XL, que reduce la sensibilidad del CECC a erlotinib tratamiento. Niclosamida, como un inhibidor de STAT3, puede bloquear la fosforilación inducida por erlotinib de STAT3 conduce a la supresión sinérgica de cáncer de cabeza y cuello.
Materiales y Métodos
Materiales
Niclosamida fue comprado de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Erlotinib se obtuvo de LC Laboratories (Woburn, MA). Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-STAT3 (Tyr705), fosfo-JAK2 (Tyr1007 /1008), caspasa 3 activa y survivin anticuerpos fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). β-actina y anticuerpos MCL-1, PTPMeg2 shRNA y su control shRNA se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). anticuerpo PTPMeg2 se obtuvo de amp I +; D Systems (R & amp; D Systems, MN). Bcl2 se obtuvo de Calbiochem (Darmstadt, Alemania). Bcl-XL se adquirió de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA). QD605 cabra conjugado IgG anti-conejo (rojo), QD705 de cabra anti-IgG de ratón conjugado (verde) y reactivo antifade ProLong® oro con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se adquirieron de Invitrogen Life Technologies Inc (Carlsbad , CA). Todos los demás reactivos utilizados se obtuvieron de fuentes comerciales a menos que se indique lo contrario.
Líneas celulares y cultivo celular
líneas celulares de SCCHN humano Tu212 y Tu686 se establecieron a partir HNSCCs primarias y mantenidos en DMEM /F12 (1 : 1) medio con suero bovino fetal al 10% como se describe anteriormente [19]. Se emplearon Estas líneas celulares para los experimentos descritos sin más autenticación.
Preparación de lisados de células y de transferencia de Western
Las células se lavaron con PBS frío y se resuspendió en tampón EBC enfriado con hielo (0,5% Nonidet P-40, Tris 50 mM, pH 7,6, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, y 1 mm- β-mercaptoetanol) que contiene mezcla de inhibidor de la proteasa establece I. Después de la lisis celular mediante sonicación y centrifugación a 14.000 xg durante 15 min a 4 ° C , el sobrenadante resultante se recogió como el lisado celular total. La expresión de proteínas se analizó por Western blot como se describe anteriormente [20].
transcripción inversa PCR cuantitativa (RT-PCR)
Por RT-PCR cuantitativa, el ARN total se purificó y se sometió a transcripción inversa con al azar hexámeros y superíndice III (Invitrogen). La amplificación se llevó a cabo utilizando 2 × SYBR verde mezcla de PCR (Bio-Rad, CA) por ABI 7500 sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) tal como se describe [21,22]. primers específicos: para Bcl2 humana: adelante, 5'-GGA GGA GGT GCT CTT CAG G-3 'y revertir, 5'-ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3'; de Bcl-XL: adelante, 5'-ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC 3 'y revertir, 5'-GAT TGG GTC AGG TCA CTG AA-3'; y para la β-actina: adelante, 5'-GGA TCC TCA ACG TGC TTG TCA-3 '; revertir, 5'-TAC CCT TGG CAC CAG AGG TTC TTT GA-3 '. Relativos cuantificaciones de expresión génica se llevaron a cabo de acuerdo con el método comparativo Ct utilizando β-actina como patrón interno. La cuantificación de la expresión génica se analizó con el programa de software 2.0.5 7500 v y se cuantificó por el método 2-ΔΔCt. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
ARN de interferencia
Lentiviral pSIH1-puro-STAT3 shRNA y pSIH1-control puro shRNA se obtuvieron de Addgene (Cambridge, MA). El control shRNA plásmido-A codifica una secuencia shRNA revueltos que no dé lugar a la degradación específica de cualquier mensaje de celular. Control de shRNA horquilla secuencia: CCT AAG AAG GTT TCG TCG CCC CTC GAG CGA CGA GGG CTT CTT AAC AGG. STAT3 shRNA horquilla secuencia: GAT CCG CAT CTG AGA CCT TCG TCG ATT CAA GAG ATA GCC GAT CTA GGC AGA TGT TTT TTG. PTPMeg2 shRNA y su control shRNA fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). Para la producción de pseudovirus, STAT3 shRNA o PTPMeg2 shRNA se cotransfectaron en 293FT células con la mezcla de plásmido de empaquetamiento lentivector (Sistema Biosciences, CA) usando el kit de transfección NanoJuice (EMD Chemical, Inc.) como se describe [23]. Después de 48 h, los medios de comunicación que contienen virus se recogieron por centrifugación a 20.000 x g. Las células se infectaron con los medios que contienen virus en presencia de polibreno (8μg /ml) para la siguiente 24h cuales se seleccionaron clones positivos estables usando 1μg /ml de puromicina.
sulforodamina B (SRB) ensayo
los efectos inhibidores de erlotinib y niclosamida sobre el crecimiento celular se evaluó mediante el ensayo de sulforhodamina B (SRB) como se describe [24]. Las células se cultivaron en pocillos por triplicado utilizando placas de 96 pocillos. Después de un crecimiento durante la noche, las células se trataron con erlotinib, niclosamida o la combinación durante 48 h. Se determinó la fracción de células supervivientes como se describe [24].
Cabeza y cuello xenoinjertos de cáncer y tratamientos
El Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional de la Universidad de Emory aprobó el protocolo para los experimentos con animales. ratones desnudos de seis semanas de edad, Nu /Nu se adquirieron de Harlan y se alojaron en condiciones libres de patógenos en jaulas microisolator. Los xenoinjertos se suscitaron mediante la inyección de 5 × 10
6 de las células Tu212 en una solución de sal equilibrada en el tejido subcutáneo sobre la región de flanco de ratones desnudos. Se permitió que los tumores crezcan a un volumen promedio de 250 mm
3 antes de la iniciación de la terapia como se describe [25]. Tumor-teniendo ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento (n = 8 por grupo) como sigue: (1) de control de vehículo (0,5% DMSO, 100 pl /d i.p.); (2) erlotinib (40 mg /kg /d por vía intraperitoneal); (3) la niclosamida (20 mg /kg /d por vía intraperitoneal); (4) erlotinib (40 mg /kg /d) + niclosamida (20 mg /kg /d). El volumen del tumor se evaluó mediante mediciones de la pinza una vez cada dos días y se calcula con la fórmula: V = (L x A
2) /2 (L: longitud; W: anchura) como se describe [26]. Después de 14 días consecutivos de tratamiento, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO
2. tumores recogidos se usaron para el análisis adicional.
La inmunohistoquímica (IHC) análisis
IHC tinción del tejido tumoral usando conejo caspasa activa anti-humano 3 de anticuerpos se realizó como se describe [25]. Brevemente, tumores recogidos fueron incluidos en parafina y se cortaron en secciones de 4 micras. La tinción se realizó a través de R.T.U. kit Vectastain siguiendo el protocolo estándar del fabricante (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Los portaobjetos de tejidos se bloquearon con suero normal de caballo 2,5% durante 10 min. Las muestras fueron incubadas con conejo caspasa 3 activa de anticuerpos anti-humana (dilución 1:50), durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, las diapositivas de tejido se incubaron con anti-IgG de conejo HRP anticuerpo secundario durante 10 minutos. Los portaobjetos se tiñeron con 3,3 'diaminobencidina (DAB) (Vector Laboratories) y de contraste con hematoxilina (Vector Laboratories), se deshidrataron, se trataron con xileno y se montaron. Todas las diapositivas fueron examinados y representativas imágenes fueron tomadas usando un microscopio Olympus BX41 (Olympus, América, Melville, NY). células caspasa-positivos activos en los tejidos tumorales fueron anotados en 400 × magnificación. El número medio de células positivas por 0,0625 mm
2 área se determinó a partir de tres campos separados en cada una de tres muestras de tumores independientes como se describe [25].
inmunohistoquímica basada en puntos cuánticos de fluorescencia (QD-IHF) y su señal de cuantificación
QD-IHF para la medición de la expresión de proteínas en los tejidos tumorales se realizó como se describe anteriormente [27 a 29]. Brevemente, tumores recogidos fueron incluidos en parafina y se cortaron en secciones de 4 micras. Después de la desparafinación y rehidratación, recuperación de antígeno se llevó a cabo mediante el calentamiento con tampón de citrato (10 mmol /L, pH 6,0) en un microondas durante 10 min. Los portaobjetos de tejidos se bloquearon con suero normal de caballo 2,5% durante 10 min antes de la incubación del anticuerpo primario. Rabbit pEGFR anti-humana y anticuerpos p-STAT3 anti-humano de ratón se mezclaron a una dilución de 1:50 en 1 × PBS que contenía 2,5% de suero de caballo. IgG de conejo normal se utilizó como control negativo. Las secciones de tejido se incubaron con una solución mixta de p-EGFR y anticuerpos p-STAT3 durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con 1 × PBS tres veces, QD705 de cabra anti-IgG de ratón conjugado (verde) y QD605 de cabra anti-conejo conjugado IgG (rojos) anticuerpos secundarios se añadieron a las diapositivas con más de incubación durante 1 hora a 37 ° C. Los portaobjetos se lavaron tres veces con 1 x PBS, a contratinción con DAPI, montados y almacenados a 4
oC en condiciones de oscuridad. procedimientos de imagen y cuantificación QD se realizaron como se describe anteriormente [29]. Se utilizó el Nuance
TM microscopio de fluorescencia (CRI consolidado con Calibre, una empresa PerkinElmer, Hopkinton, MA) para la cuantificación de las señales QD-IHF. Todos los archivos de imagen en cubos fueron recolectados a partir de diapositivas de tejidos tumorales en intervalos de longitud de onda de 10 nm de 420-720 nm, con un tiempo de exposición automática por intervalo de longitud de onda a 200 ~ 400 aumentos. Teniendo el cubo con una transmisión de longitud de onda larga permitido filtro de paso de banda de todas las longitudes de onda de emisión indicados en 420 nm. Ambas imágenes QD separados y combinados fueron obtenidos por desmezcla el cubo de imágenes basada en el establecimiento de la biblioteca espectral QD. Para cada diapositiva del tejido, se tomaron 10 cubos. La señal de fondo se eliminó para la cuantificación exacta de las señales QD. El promedio de cada señal QD se obtuvo mediante la selección de las zonas tumorales en cada cubo para la cuantificación de software de imágenes de Nuance (calibrador /PerkinElmer). Una lectura promedio de los 10 cubos se obtuvo como un recuento de señal promedio total de cada diapositiva tejido para ambas señales pEGFR y pSTAT3.
Mouse análisis de sangre
se recogió sangre entera (250μL) en EDTA tubos recubiertas a través de punción cardíaca de los ratones anestesiados para los estudios de hematología. Las muestras fueron analizadas por los glóbulos blancos (WBC), glóbulos rojos (RBC), plaquetas (PLT), alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y de nitrógeno de urea en sangre (BUN) en el Laboratorio de Patología Clínica de la Universidad de Georgia (Athens, GA)
El análisis estadístico
Las diferencias significativas entre los dos grupos fueron analizadas mediante la prueba t y p & lt valor de dos caras de Student para datos independientes.; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad INSTAT 3 (San Diego, CA) [30].
Análisis del índice de combinación (IC) del valor
valor de CI para la sinergia de drogas se calculó utilizando el software CompuSyn (Combo-Syn, Inc., Paramus, NJ) como se describe [31].
resultados
La inhibición de EGFR erlotinib por PTPMeg2 regula a la baja que conduce a la fosforilación de STAT3 mejorado
recientemente se ha informado que la inhibición de EGFR por erlotinib activa la STAT3 /Bcl2 /Bcl-XL supervivencia vía de señalización en el cáncer de pulmón humano [32]. Para probar si este efecto de erlotinib se produce en las células de cáncer de cabeza y cuello, células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlotinib (0.1μM) durante diversos tiempos. Los resultados indicaron que erlotinib reducido de fosforilación de EGFR en asociación con una mayor fosforilación de STAT3 Tyr705, el aumento de los niveles de Bcl2 /Bcl-XL y niveles disminuidos de survivina (Figura 1A). STAT3 es un factor de transcripción fisiológica de Bcl2 y Bcl-XL [33-35]. Los niveles elevados de Bcl2 y Bcl-XL mRNA también se observaron en Tu212 y Tu686 células después del tratamiento erlotinib (Figura 1B), lo que indica que STAT3 erlotinib activado regula positivamente Bcl2 /Bcl-XL, pero no survivina en la etapa de la transcripción. Para demostrar cómo erlotinib estimula la fosforilación de STAT3, se evaluaron los efectos de erlotinib en STAT3 quinasa (es decir JAK2) y fosfatasa (es decir PTPMeg2). Curiosamente, erlotinib no sólo inhibe la fosforilación de JAK2 sino que también redujo significativamente el nivel de expresión PTPMeg2 en células de cáncer de cabeza y cuello (Figura 1A). Estos resultados indican que la fosforilación de STAT3 erlotinib mediada por la activación y pueden ser resultado de la inhibición de la fosfatasa STAT3 PTPMeg2.
A
, las células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlotinib (0.1μM) durante diversos tiempos . Los niveles de varias proteínas (pSTAT3, PTPMeg2, pEGFR, Bcl2, Bcl-XL, etc.) se analizaron por Western blot.
B Opiniones, células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlotinib (0.1μM) durante varios tiempos. Los niveles de Bcl2 o Bcl-XL ARNm se analizaron por RT-PCR.
Es importante destacar que la precipitación específica de PTPMeg2 también condujo a un aumento de la fosforilación de STAT3 y niveles elevados de Bcl2 y Bcl-XL en el cáncer de cabeza y cuello las células (Figura 2), lo que apoya aún más el papel de PTPMeg2 como fosfatasa STAT3 fisiológica, como informó recientemente [15].
PTPMeg2 shRNA o control shRNA se transfectaron en células Tu212. Los niveles de expresión de pSTAT3, Bcl-XL, Bcl2 y MCL-1 se analizaron por Western blot.
La interrupción de STAT3 sensibiliza a las células de cabeza y cuello a erlotinib
Para probar si erlotinib la activación de STAT3 mediada afecta negativamente a la actividad erlotinib contra cáncer de cabeza y cuello, STAT3 fue derribado a partir de células Tu212 y Tu686 utilizando STAT3 shRNA (Figura 3A). El silenciamiento de STAT3 no sólo regula a la baja Bcl2 y Bcl-XL (Figura 3A), sino también sensibiliza significativamente las células cáncer de cabeza y cuello a erlotinib (Figura 3B), lo que sugiere que la orientación STAT3 puede tener un gran potencial para mejorar la eficacia de erlotinib contra el cáncer de cabeza y cuello .
Un
, STAT3 shRNA o control shRNA se transfectó en células Tu212 y Tu686. Los niveles de expresión de STAT3, Bcl-XL y Bcl2 se analizaron por Western blot.
B Opiniones, células Tu212 y Tu686 que expresan STAT3 shRNA o control shRNA fueron tratados con erlotinib (con 1 m) durante 48 h. El crecimiento celular se determinó por ensayos de SRB.
Niclosamida bloques erlotinib-inducidas fosforilación de STAT3 y sinergia con erlotinib en la supresión de la cabeza y el crecimiento de las células del cáncer del cuello
Niclosamida ha sido recientemente identificado como un inhibidor de la STAT3 potente [18]. Para probar si la interrupción farmacológica de la actividad STAT3 sensibiliza a las células de cáncer de cabeza y cuello a erlotinib, las células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlotinib en la ausencia o presencia de concentraciones crecientes de niclosamida. El análisis de transferencia Western mostró que la niclosamida inhibió la fosforilación de STAT3 erlotinib inducida y downregulated Bcl2 /Bcl-XL de una manera (Figura 4A) dependiente de la dosis. Es importante destacar que la niclosamida en combinación con erlotinib aumentó significativamente la inhibición del crecimiento de células de cáncer de cabeza y cuello (es decir Tu212 y Tu686) (Figura 4B). Para analizar con mayor precisión el grado de sinergia entre la niclosamida y erlotinib, los valores del índice de combinación (IC) se calcularon como se describe en "Métodos". Los valores de CI fueron 0,39325 para Tu212 y 0,447333 para las células Tu686, respectivamente. Los valores de CI de menos de 1 indican que la inhibición del crecimiento sinérgico niclosamida y erlotinib exposición de las células de cáncer de cabeza y cuello.
Un
, las células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlotinib en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de niclosamida durante 48 h. pSTAT3, Bcl2 y Bcl-XL se analizaron por Western blot.
B Opiniones, células Tu212 y Tu686 fueron tratados con erlonitib, niclosamida o su combinación. Después de 48 h, el crecimiento celular se determinó por ensayos de SRB. los valores del índice de combinación (IC) se calcularon como se describe en "Métodos.
Niclosamida y erlotinib sinérgicamente inhiben el crecimiento de xenoinjertos de cabeza y cuello cáncer en animales
Desde la niclosamida y erlotinib juegan un sinérgica papel contra el cáncer de cabeza y cuello
in vitro gratis (Figura 4), es interesante examinar este efecto sinérgico
in vivo
. En primer lugar, cáncer de cabeza y cuello xenoinjertos se generaron utilizando células Tu212. Entonces, los ratones portadores de cabeza Tu212 y xenoinjertos de cáncer de cuello fueron tratados con erlotinib (40 mg /kg /d), niclosamida (20 mg /kg /d) por sí sola o en combinación durante dos semanas. Los resultados mostraron que tanto erlotinib y niclosamida solo tuvo una eficacia modesta en contra de los xenoinjertos de tumores. Sin embargo, la combinación de erlotinib y niclosamida reprime la formación de tumores de xenoinjerto significativamente más eficiente que cualquiera de los agentes solo solos
in vivo
(p & lt; 0,01) (Figura 5A). Estos datos sugieren que la niclosamida y erlotinib tienen una fuerte sinergia en el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello.
Un
, ratones portadores de xenoinjertos Tu212 fueron tratados con el control del vehículo, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamida (Niclo, 20 mg /kg /d) o su combinación durante 14 días. Cada grupo incluía 8 ratones. El volumen del tumor se midió una vez cada 2 días. Después de 14 días, los ratones se sacrificaron y los tumores se retiraron y se analizaron. Se tomaron fotografías representativas del tumor.
B
, la caspasa activa 3 y Ki 67 se analizaron en los tejidos tumorales al final de los experimentos de tinción IHC y se cuantificaron como se describe en "Métodos".
C
, los niveles de expresión de pEGFR, pSTAT3, Bcl2 y Bcl-XL en los tejidos tumorales de diversos grupos de tratamiento fueron analizados por Western blot.
Se midió la apoptosis mediante el análisis de la caspasa activa 3 en los tejidos tumorales por tinción IHC como se describe anteriormente [25]. La combinación de erlotinib y niclosamida aumentó significativamente la caspasa activa 3 células positivas en asociación con una disminución de Ki-67 células positivas en los tejidos tumorales de cabeza y cuello (figura 5B). El análisis de proteínas de lisados de tejido tumoral de tres ratones en cada grupo de tratamiento se indica que la fosforilación de STAT3 estimulada erlotinib-bloques niclosamida lleva a una disminución Bcl2 y los niveles de Bcl-XL (Figura 5C). Estos datos sugieren que el mecanismo molecular por el que la niclosamida y erlotinib sinergismo exhibición contra el crecimiento del cáncer de cabeza y cuello
in vivo
.
Es importante destacar que los tratamientos fueron bien tolerados sin pérdida de peso durante el tratamiento (Figura 6A). No hubo alteraciones observables en las funciones de órganos vitales como se refleja en los resultados de hígado, riñón y pruebas de la función de la médula ósea (ALT, AST y BUN, CMB, Hb y plaquetas) (Figura 6B). La histopatología de los tejidos normales cosechadas (cerebro, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón e intestino) no reveló ninguna evidencia de toxicidad en el tejido normal (Figura 6C).
Un
, el peso del cuerpo de Los ratones con xenoinjertos de Tu212 se midió una vez cada dos días durante el tratamiento con el control del vehículo, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamida (Niclo, 20 mg /kg /d) o su combinación.
B Opiniones, análisis de sangre de los ratones después de varios tratamientos durante 14 días. C, H & amp; E histología de los diversos órganos después de los tratamientos.
Análisis de pEGFR y pSTAT3 en los tejidos tumorales de puntos cuánticos (QD) immunohistofluorescence basado en (QD-IHF)
La técnica QD-IHF tiene una ventaja significativa en lo que permite la cuantificación de distintos marcadores simultáneamente en el mismo portaobjetos de tejidos [27-29,36]. Los niveles de pEGFR y pSTAT3 se analizaron simultáneamente por QD-IHF usando anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados QD con dos longitudes de onda de emisión diferentes (es decir, QD705 (verde) y QD605 (rojo)). Ambas imágenes QD separados y combinados se obtuvieron después de la determinación de la biblioteca espectral QD y desmezcla la imagen en cubos. imágenes QD de tejidos tumorales mostraron que pEGFR fue localizado en la membrana celular y pSTAT3 se encuentra en el núcleo (Figura 7). Disminución pEGFR y se observaron mayores niveles pSTAT3 en los tejidos tumorales de xenoinjerto de cabeza y cuello tras el tratamiento de ratones con erlotinib (Figura 7). Por otra parte, la niclosamida bloqueó completamente la fosforilación de STAT3 estimulada erlotinib en los tejidos tumorales (Figura 7).
Un
y
B Opiniones, xenoinjertos Tu212 fueron tratados con el control del vehículo, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamida (Niclo, 20 mg /kg /d) o su combinación durante 14 días. pEGFR y pSTAT3 se analizaron en los tejidos tumorales al final de los experimentos realizados por QD-IHF y cuantificaron como se describe en "Métodos".
Discusión
cánceres de cabeza y cuello son de los más tumores prevalentes en el mundo. A pesar de los avances en las terapias convencionales (es decir, cirugía, radiación y quimioterapia), la tasa de supervivencia general de CECC no ha mejorado significativamente en las últimas tres décadas [4]. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques más eficaces que actúan a través de mecanismos moleculares básicos es fundamental para mejorar el pronóstico de los cánceres de cabeza y cuello. EGFR es ampliamente sobreexpresa en SCCHN. A pesar de su expresión ubicua, las terapias dirigidas a EGFR son sólo moderadamente eficaces en el tratamiento de SCCHN [5]. El mecanismo de resistencia a los agentes de EGFR de orientación no se entiende completamente. Aquí, se encontró que la inhibición de EGFR por los resultados de erlotinib en la fosforilación de STAT3 en Tyr705 que conducen a su activación y a mayores niveles de Bcl2 /Bcl-XL, tanto en mRNA y niveles de proteína en la cabeza y las células de cáncer de cuello (Figura 1). Este efecto podría reducir la eficacia de erlotinib contra el cáncer de cabeza y cuello. Curiosamente, la fosforilación de STAT3 erlotinib inducida por la activación y no el resultado de su JAK2 quinasa aguas arriba debido a erlotinib no activa JAK2, pero reduce el contrario la fosforilación de JAK2 (Figura 1A). Además de JAK2, la fosforilación de STAT3 también se estrechamente regulada por la desfosforilación a través de su fosfatasa fisiológica PTPMeg2 [15]. El tratamiento de células de cáncer de cabeza y cuello y Tu212 Tu686 con erlotinib reduce PTPMeg2 (es decir, una fosfatasa STAT3 fisiológica) de una manera (Figura 1A) dependiente del tiempo. Por lo tanto, erlotinib, además de la inhibición de EGFR, puede también suprimir PTPMeg2 que conduce a la fosforilación de STAT3 mejorada. Curiosamente, desmontables específica de PTPMeg2 también activó la STAT3 /vía de supervivencia Bcl2 /Bcl-XL (Figura 2), lo que sugiere que PTPMeg2 puede desempeñar un papel importante en la regulación de la sensibilidad de las células a erlotinib cáncer de cabeza y cuello.
STAT3 se ha identificado recientemente como una posible diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello [37]. El agotamiento de STAT3 por RNAi sensibiliza las células significativamente cáncer de cabeza y cuello a erlotinib (Figura 3). La niclosamida ha sido recientemente identificado como un inhibidor de la STAT3 que puede suprimir la fosforilación de STAT3 en la actividad de transcripción [18] Tyr705 y. Desde niclosamida no sólo bloquea potentemente erlotinib inducida por la fosforilación de STAT3, sino también un efecto sinérgico con erlotinib contra el cáncer de cabeza y cuello
e in vitro
in vivo gratis (Figuras 4 y 5), proponemos que erlotinib en combinación con niclosamida tiene un gran potencial para ser desarrollado como un enfoque terapéutico nuevo y más eficaz para mejorar el pronóstico de cáncer de cabeza y cuello. Los puntos cuánticos (QDs) son partículas nanométricas hechas de semiconductores inorgánicos y tienen propiedades ópticas novedosas que pueden producir emisión de fluorescencia a diferentes longitudes de onda en función de su tamaño y composición [38-40]. La gran stokes de desplazamiento de los puntos cuánticos, medida por la distancia entre los picos de excitación y emisión, se puede utilizar para mejorar la sensibilidad de detección. Esto es particularmente importante en el análisis de muestras biológicas complejas tales como muestras de tejido que contienen un alto fondo auto-fluorescencia y múltiples biomarcadores simultáneamente. Además, la señal de immunohistofluorescence basado en QD (QD-IHF) no es photobleachable y el espectro de la señal es más estrecho que los de los colorantes orgánicos, mejorando de este modo la especificidad de la cuantificación. análisis basado en QD confirmó que la inhibición de pEGFR por erlotinib estimula la fosforilación de STAT3 en los tejidos tumorales, y que bloquea específicamente niclosamida erlotinib inducida por fosforilación de STAT3 sin afectar pEGFR (Figura 7). Estos datos QD-IHF no sólo proporcionan evidencia adicional de que el erlotinib activa STAT3, sino también descubrir el mecanismo molecular por el que la niclosamida y erlotinib sinérgicamente reprimir el cáncer de cabeza y cuello
in vivo
.
En resumen, los presentes estudios han demostrado que la inhibición de EGFR por erlotinib estimula la fosforilación y la activación de STAT3 conduce a mayores niveles de Bcl2 y Bcl-XL, que podrían reducir la eficacia de erlotinib contra el cáncer de cabeza y cuello. inducida por la activación de STAT3 erlotinib puede ocurrir a través de la supresión de su PTPMeg2 fosfatasa fisiológica. la inhibición combinada de EGFR y STAT3 usando erlotinib y niclosamida reprime de forma sinérgica cáncer de cabeza y cuello
e in vitro
in vivo
, lo que puede representar un nuevo y estrategia terapéutica eficaz para mejorar el pronóstico de los pacientes con la cabeza y el cáncer de cuello.
Reconocimientos
agradecemos a Anthea Hammond para la edición profesional del manuscrito.