Extracto
Las células cancerosas activan la biosíntesis de ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) a fin de mantener una demanda creciente de fosfolípidos con composición de acilo apropiado durante la replicación celular. Hemos demostrado anteriormente que una caída estable de estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1), el principal Δ9-desaturasa que convierte la SFA en MUFA, en células de cáncer disminuye la velocidad de la lipogénesis, reduce la proliferación y en la invasividad in vitro, y deteriora drásticamente la formación de tumores y el crecimiento. Aquí mostramos que la inhibición farmacológica de SCD1 con una pequeña molécula nueva en células de cáncer promueve la activación de la quinasa activada por AMP (AMPK) y la posterior reducción de la actividad de la carboxilasa acetil-CoA, con una inhibición concomitante de la lipogénesis de glucosa mediada. La inhibición farmacológica de AMPK se redujo aún más la proliferación de las células de SCD1-agotado, mientras que la activación AMPK restauró la proliferación para controlar los niveles. La adición de concentraciones suprafisiológicas de glucosa o piruvato, el producto final de la glicólisis, no invirtió la baja tasa de proliferación de células de cáncer de SCD1-ablación. Nuestros datos sugieren que las células cancerosas requieren SCD1 activo para controlar la velocidad de la lipogénesis de glucosa mediada por, y que las células cuando la actividad de SCD1 se deteriora regulan negativamente la síntesis de SFA a través de la inactivación AMPK mediada de acetil-CoA carboxilasa, evitando así los efectos nocivos de la acumulación de SFA.
Visto: Scaglia N, Chisholm JW, Igal RA (2009) inhibición de la StearoylCoA desaturasa-1 inactiva acetil-CoA carboxilasa y perjudica la proliferación de las células del cáncer: El papel de la AMPK. PLoS ONE 4 (8): e6812. doi: 10.1371 /journal.pone.0006812
Editor: Marcelo Bonini, Institutos Nacionales de Salud (NIH) /Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS), Estados Unidos de América
Recibido: 5 de mayo de del 2009; Aceptado: August 4, 2009; Publicado: 27 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Scaglia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Fundación Charles y Joanna Busch y SEBS /NJAES, Universidad de Rutgers. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas presentan un metabolismo modificado radicalmente que promueve su proliferación continua. Como parte del cambio metabólico hacia la síntesis macromolecular para apoyar la replicación celular, las células cancerosas activan la biosíntesis de ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) para sostener una demanda creciente de los fosfolípidos de la composición de acilo apropiado para la biogénesis de la membrana. Por lo tanto, varias enzimas críticas implicadas en la síntesis de novo de ácidos grasos se ha demostrado que se sobreexpresa en células malignas: ATP-citrato liasa, requerida para la producción de citosólica acetylCoA [1], carboxilasa acetil-CoA (ACC), la enzima que cataliza la síntesis de malonil-coa, el primer paso comprometido en la síntesis de ácidos grasos [2], [3], y el ácido graso sintasa (FAS), que sintetiza SFA [2]. La importancia de la síntesis de ácidos grasos para la proliferación de células de cáncer y la supervivencia se pone de relieve por el hecho de que la inhibición de cualquiera de estas enzimas lleva a un alto en la proliferación celular y el aumento de la muerte celular [4] - [9]. Sin embargo, a pesar de la sobreactivación del tándem de enzimas biosintéticas que en última instancia hace SFA, abundantes cantidades de ácidos grasos monoinsaturados se encuentran típicamente en las células del cáncer [10] - [13], lo que sugiere que se requiere la biosíntesis de ácidos grasos monoinsaturados para asegurar la proliferación de células cancerosas y la supervivencia.
desaturasas stearoylCoA de mamíferos (SCD) son enzimas que catalizan la microsomales Δ9-desaturación de acylCoAs saturada para formar derivados monoinsaturados [14]. La expresión de SCD1, principal isoforma SCD, se aumenta en varios cánceres humanos, tumores inducidos químicamente, así como en las células transformadas por oncogenes [1], [13], [15] - [18]. Hemos demostrado que SCD1 modula no sólo el contenido de ácidos grasos monoinsaturados en las células cancerosas, pero también el proceso general de la lipogénesis [19]. Sorprendentemente, la ablación de la expresión de SCD1 reduce la proliferación de células de cáncer y en la invasividad in vitro, y deteriora drásticamente la formación de tumores y el crecimiento [19], [20]. También hemos encontrado que activa SCD1 puede ser necesaria para las células neoplásicas para sobrevivir a un estrés lipotoxic desde SCD1 caída aumenta la apoptosis basal y sensibiliza las células a los efectos citotóxicos de exceso de SFA [19]. SCD1 también se ha identificado a partir de una biblioteca de siRNA como un gen cuya supresión perjudica la supervivencia de células de cáncer humano, apoyando además un vínculo funcional entre SCD1 y el crecimiento de células de cáncer [21]. Sin embargo, a pesar de este incremento de las informaciones, los intrincados mecanismos por los cuales SCD1 modula el metabolismo lipídico y al mismo tiempo las características biológicas de las células cancerosas no se conocen.
El proceso de lipogénesis en células de mamíferos está regulada por Akt y AMP dependiente de la proteína quinasa (AMPK), dos importantes proteínas de señalización que controlan varios biosintética crítica y reacciones catabólicas. Akt es un potente inductor de la lipogénesis de glucosa mediada por células cancerosas, la regulación de principalmente la actividad y la transcripción de múltiples enzimas de la glucólisis y síntesis de ácidos grasos [22], [23]. Como parte de un bucle de realimentación, la actividad de Akt está modulada por los niveles de FAS y SCD1. Se observó que el bloqueo de la actividad de FAS y la ablación de disminuir la expresión de SCD1 Akt fosforilación y la actividad en las células del cáncer [20], [24]. Por el contrario, la activación de AMPK por la fosforilación promueve la regulación a la baja de varias vías lipogénicas y activa reacciones de suministro de energía, tales como la oxidación de ácidos grasos [25]. Uno de los objetivos principales de la AMPK es activada por el CAC. Tras la fosforilación de AMPK, la actividad de ACC se disminuye dando por resultado la inhibición de la de novo la síntesis de ácidos grasos [26]. La reducción concomitante de los niveles de malonil-coa promueve el β-oxidación de los ácidos grasos. SFA también son inhibidores alostéricos potentes del CAC, proporcionando un bucle de retroalimentación negativa para la biosíntesis de ácidos grasos [27] - [29]. Nuestra hipótesis es que la elevación de SCD1, mediante la conversión de ácidos grasos monoinsaturados SFA, es capaz de mantener la vía de síntesis de ácidos grasos y la lipogénesis totalmente activado. Esta condición favorece el crecimiento de las células cancerosas y la proliferación, por lo tanto, la reducción de la actividad de SCD1 debe perjudicar estos dos procesos biológicos
Recientemente, varias series de inhibidores selectivos de molécula pequeña novela Δ9-desaturasa se han publicado [30] - [32]. . Uno de estos inhibidores de SCD, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diclorobencilamino) -2- (4-metoxifenil) -3-oxopirido [2,3-b] pirazin-4 (3H) il) etil) acetamida), es un inhibidor potente y específico de microsomal de rata y HepG2 células Δ9-desaturación [30] y puede ser una herramienta valiosa para el estudio de potencial la regulación del metabolismo celular y las vías de señalización por la actividad de SCD1.
en nuestros estudios actuales, se muestra que la inhibición aguda de la actividad de SCD1 con CVT-11127, así como la deficiencia crónica de SCD1 por caída génica estable, entorpece seriamente la síntesis de ácidos de novo graso de la glucosa en células de carcinoma de pulmón humano. Informamos además, que la inhibición farmacológica de la actividad de SCD reduce drásticamente la proliferación celular en las células cancerosas, lo que confirma que la actividad de SCD1 es un requisito fundamental para el crecimiento de las células cancerosas. Asimismo, se observó que el bloqueo de SCD1 activa AMPK y el CAC inactivada que resulta en una disminución de la lipogénesis. En condiciones experimentales que inducen la lipogénesis, tales como la estimulación de la ACC con citrato y la inhibición de AMPK, se observó una disminución adicional en la proliferación celular en las células deficientes en SCD1. Por el contrario, la activación farmacológica de AMPK invierte la proliferación celular para controlar los niveles. En conjunto, nuestros datos sugieren que la regulación a la baja de la síntesis de ácidos grasos cuando la actividad de SCD1 es baja puede ser un mecanismo de salvaguardia de adaptación para evitar los efectos nocivos del exceso de SFA cuando se deteriora su conversión en ácidos grasos monoinsaturados. Por otra parte, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de SCD1 en la regulación de la proliferación neoplásica y el metabolismo.
Materiales y Métodos
Materiales
células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 y WS-1 humana fibroblastos se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.). Las células de cáncer de pulmón H1299 y células MCF-7 de cáncer de mama humano fueron generosamente proporcionadas por el Dr. C. S. Yang y el Dr. Wendie Cohick, Universidad de Rutgers, Nueva Jersey, respectivamente. modificación del medio de Eagle (DMEM) con L-glutamina, mezcla de vitaminas MEM y solución de aminoácido no esencial MEM de Dulbecco eran de Mediatech Cellgro (Manassas, VA, EE.UU.). Medio Esencial Mínimo (MEM) que contiene sales de Earle y L-glutamina, DMEM libre de glucosa, fenol MEM libre de rojo, solución de tripsina-EDTA y reactivo de transfección Lipofectamine ™ 2000 se adquirieron de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EE.UU.). Inactivado por calor suero fetal bovino, cristal violeta, proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel 2, ácido graso de albúmina de suero libre de bovino, anticuerpo β-actina monoclonal anti, AICAR, coenzima A, ATP, NADH y dimetil sulfóxido (DMSO) fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). membrana de nitrocelulosa, disolventes de calidad HPLC, solución tamponada con fosfato sin calcio y magnesio y otros suministros de cultivo celular se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE.UU.). anticuerpos fosfo-ACC (Ser79) anti-fosfo AMPKα (Thr172) y se obtuvieron de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, EE.UU.). Conjugado con HRP anti-ratón y anti IgG de conejo eran de Santa Cruz biotecnologías (Santa Cruz, CA, EE.UU.). D- [U
14C] glucosa, [1-
14C] ácido esteárico, y [1-
14C] acetato de sodio se adquirieron de American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, EE.UU. ). [Metil-
3H] timidina, [2-
3H] desoxiglucosa y de rango completo del arco iris marcador de peso molecular eran de GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ, EE.UU.). kit de ensayo de lactato era de Eton Biosystems Inc. (San Diego, CA, EE.UU.). BCA Bradford kit de ensayo de proteínas y super señal de pico West sustrato quimioluminiscente fueron de Pierce (Rockford, IL, EE.UU.). Compuesto C era de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.).
Cultivo de células
WS-1, las células A549 y MCF-7 se cultivaron en MEM y H1299, H460 y MDA-MB -231 células se cultivaron en DMEM. El medio se suplementó con 10% de FBS, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (10 mg /ml), aminoácidos no esenciales al 1% y solución MEM de vitamina 1% (medio de cultivo). Las células se cultivaron a 37 ° C, 5% de CO
2, y 100% de humedad.
modelos celulares de la inhibición de SCD1
Una población clonal transfectada estable de células A549 que lleva una secuencia antisentido del gen de SCD1 humana (hSCDas) se ha descrito anteriormente [20]. Además, la inhibición farmacológica de la actividad de SCD se evaluó con nuevo inhibidor químico SCD, CVT-11127 (N- (2- (6- (3,4-diclorobencilamino) -2- (4-metoxifenil) -3-oxopirido [2, 3-b] pirazin-4 (3H) -il) etil) acetamida), cuya síntesis y la estructura se describe en otra parte [30]. CVT-11127 se utilizó a concentraciones en las que la inhibición de SCD1 era mayor que 95%. El tiempo total de incubación con el inhibidor de SCD fue, al menos, 24 h a fin de permitir por una duplicación de la población celular.
actividad de SCD y síntesis de ácidos grasos de novo
Δ9 actividad desaturasa en todo se determinó células como se describe anteriormente [19]. En pocas palabras, las monocapas de células subconfluentes se incubaron con la concentración especificada de inhibidor de SCD o vehículo DMSO en los medios de cultivo durante 24 h. Seis horas antes de la cosecha, las células se pulsaron con ácido [
14C] esteárico (0,25 Ci /60 mm placa de Petri) en medio de cultivo que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino. Total de lípidos celulares se extrajeron de acuerdo con Bligh & amp; Dyer [33] y transesterificado con BF
3 en metanol durante 3 horas a 64 ° C bajo atmósfera de nitrógeno. Los ésteres metílicos se separaron por cromatografía argentation capa fina (TLC) siguiendo el procedimiento descrito por Wilson y Sargent [34], usando una fase disolvente que consiste en hexano: éter etílico (90:10, en volumen). Los ácidos esteárico y oleico radiomarcados se detectaron con un escáner Storm (Molecular Dynamics) y su densidad óptica cuantificados con ImageQuant software. Para la síntesis de ácidos grasos de novo, se incubaron las células durante 6 a 24 h con [U
14C] glucosa o durante 24 h con [
14C] acetato de sodio en la presencia o ausencia del inhibidor de SCD. Se extrajeron lípidos celulares como se describe y la cantidad de [
14C] trazador incorporado en los lípidos se normalizó al contenido de proteína celular de las células cultivadas en placas de Petri paralelas. Las alícuotas de [
14C] lípidos celulares de glucosa-marcadas se esterifican y los niveles de radiomarcado SFA y MUFA se determinaron por TLC como se describe anteriormente.
Determinación de la absorción de glucosa
células preconfluentes H1299 se incubaron con 1 M CVT-11127 o el vehículo en DMEM glucosa deficiente durante 24 h. Las células se pulsaron entonces durante 7 minutos con 0,5 Ci /plato [
3H] desoxiglucosa en DMEM que contenía 0,5% de BSA, 25 mM HEPES y 100 mM de glucosa. medio marcado se elimina rápidamente y etiquetado residual en las monocapas se eliminó mediante tres lavados con PBS enfriado con hielo. La radioactividad total de los homogeneizados de células se contó en un contador de centelleo y [
3H] DPM se normalizaron al contenido de proteína de la célula.
composición de ácidos grasos celular total
Total de lípidos celulares de A549 y H460 células de cáncer tratados con 10 uM o 1 uM CVT-11127, respectivamente, o vehículo durante 24 h se extrajeron como se describió anteriormente. ácido heptadecanoico (C17: 0) se añadió como estándar interno en el inicio del proceso de extracción de lípidos. La transesterificación y la metilación de los ácidos grasos de los lípidos totales se realizaron como se describe por Lepage y Roy [35]. Fatty composición de éster metílico del ácido se determinó por cromatografía de gases utilizando un Varian 3800 GC (Varian Inc, Palo Alto, CA), equipado con una columna DB-23 (J & amp; W Scientific Inc., Folsom, CA) y FID. factores de identificación y respuesta éster metílico de ácidos grasos se determinaron utilizando mezclas estándar (NuChek Prep Inc., Elysian, MN). picos cromatográficos se identificaron por comparación de sus tiempos de retención con los de los estándares de ácidos grasos puros y distribución porcentual se calculó.
[
3H] timidina en el ADN celular
La tasa de DNA la síntesis se estimó mediante la determinación de los niveles de [
3H] timidina en el ADN después pulsando las células con el trazador radiomarcado por 2 h, seguido de precipitación del ADN total y recuento de centelleo, como se describe [36]. Los grupos de células se incubaron con DMEM libre de glucosa suplementado con diferentes concentraciones de glucosa durante 22 h antes de la adición de la [3H
] timidina. En otros experimentos, el medio de crecimiento se complementó con piruvato de sodio 10 mM o citrato de sodio durante 22 h. Para la inhibición de la SCD, se añadió CVT-11127 a las dosis indicadas para los sustratos de cultivo durante 22 h antes del periodo de marcaje. En todos los casos, el tiempo total de incubación con los metabolitos o el inhibidor fue de 24 h.
Determinación de las curvas de crecimiento de células
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos (14.000 células por pocillo). Veinticuatro horas más tarde, las monocapas se lavaron con PBS y grupos de células se incubaron con 0,5 o 5,5 mM de glucosa en el medio de crecimiento. El medio se cambió cada 48 h a partir de entonces. Para algunos experimentos, se incubaron las células durante 24 h y 48 h con concentraciones crecientes de oleato de sodio hasta 100 mM. La proliferación celular se estimó mediante tinción con cristal violeta según el procedimiento descrito por Menna et al. [37], con modificaciones. Brevemente, las células se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en agua destilada y se enjuagaron tres veces con agua. El medio de contraste en las células teñidas se solubilizó en 10% de metanol, solución de ácido acético al 5% y se cuantifica por espectrofotometría a 580 nm. El valor de un bien en blanco se sustrajo en cada caso. Los valores en diferentes puntos de tiempo se normalizaron a los datos a las 24 horas después de la siembra para evitar diferencias debidas a la disparidad en la eficiencia de la adhesión celular o muerte celular.
medición de lactato
Para determinar la producción de lactato , 9 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta monocapas alcanzaron el 80% de confluencia. Las células se aclararon con PBS y se cultivaron en FBS al 10%, MEM libre de fenol con las concentraciones indicadas de inhibidor de SCD o vehículo durante 24 h. Para algunas determinaciones, las células sometidas a un bloqueo de la actividad de SCD se incubaron con citrato de sodio 10 mM durante 24 h. El contenido de lactato en el medio acondicionado se cuantificó con un ensayo de lactato (Eton Biosciences Inc), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se normalizó para la proteína celular total.
Immunoblotting
Se trataron células preconfluentes como se describe, se enjuaga con PBS enfriado en hielo, raspado en tampón hipotónico frío de lisis (20 mM Tris-HCl pH 7,5, mM de NaF 10, EDTA 1 mM, más de la proteasa y fosfatasa inhibidores de cócteles) y se sonicó. Cincuenta microgramos de proteínas celulares totales se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo fosfo-AMPKα (Thr172) y fosfo-ACC (Ser79) durante la noche o el ratón monoclonal anti β-actina de 2 h en 1:1,000 diluciones. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se usaron en 1:10,000 diluciones. Las proteínas en la membrana se detectaron utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia pico Occidental y se cuantificaron con un ChemiDoc (BioRad) sistema de imagen digital usando un software QuantityOne. Todos los análisis de la densidad de banda de proteína se realizaron en la parte lineal de las curvas de saturación y normalizado para el contenido de β-actina de las mismas muestras.
Determinación de la proteína celular
El contenido total de proteína celular fue medidos por el método de Bradford, utilizando BSA como estándar.
el análisis estadístico
Los resultados de un experimento representativo con al menos 3 muestras por grupo experimental se presentan como medias ± S. D. La significación estadística de los datos se determinó mediante la prueba t de Student.
Resultados
La inhibición farmacológica de la actividad de SCD perjudica la proliferación de las células cancerosas
Hemos informado anteriormente que crónica agotamiento de SCD1 disminuye la tasa de proliferación celular en células de oncogenes transformadas y el cáncer [19], [20]. Para evaluar el uso potencial de los inhibidores de SCD de nuevo desarrollo como nuevos agentes contra el cáncer, hemos probado el potencial efecto inhibidor del crecimiento de CVT-11127, un nuevo inhibidor de molécula pequeña de la actividad de SCD, en varias líneas celulares de cáncer de pulmón. Se encontró que este compuesto es un bloqueador eficaz y desaturasa-selectiva de la actividad de SCD en preparaciones microsomales de hígado de rata y células HepG2 humanos [30]. Estos autores informaron que CVT-11127 no inhibe la actividad de la Δ5 microsomal rata y Δ6 desaturasas en concentraciones de hasta 30 mM, lo que indica que CVT-11127 es selectivo para Δ9 desaturasas. Por lo tanto, se incubaron A549, H1299 y las células H460 con concentraciones crecientes del inhibidor de SCD por 24 h y encontramos una disminución progresiva de la tasa de replicación celular de las células cancerosas con respecto a las células tratadas con vehículo (DMSO) (Figura 1). células H1299 mostraron ~55% y 65% de disminución en la tasa de proliferación celular en presencia de 1 mM y 5 mM CVT-11127, respectivamente (Figura 1A). las células A549 fueron menos sensibles al efecto inhibidor del crecimiento de células de CVT-11127, ya que estas células redujeron su tasa de replicación por 20% y 40% cuando se tratan con 5 micras y 10 mM CVT-11127, respectivamente (Figura 1B). Por otra parte, la tasa de proliferación de las células H460 tratadas con CVT-11127 era 60% menor que los controles tratados con vehículo (Figura 1C), lo que indica que estas células son tan sensibles a los efectos contra el crecimiento del inhibidor de SCD como células H1299.
A549 (a) y H1299 (B) se incubaron con con diferentes concentraciones de CVT-11127 (CVT) o vehículo DMSO durante 24 h, como se describe, y la proliferación celular se determinó mediante el ensayo de cristal violeta. Para un análisis similar, células H460 (C) se trataron con 1 m CVT-11127 durante 24 h. Para la determinación de la síntesis de ADN, A549 (D) y las células H460 (E) se incubaron con 10 mM y 5 mM CVT-11127 o vehículo durante 24 h y se pulsaron con [
3H] timidina (1 Ci /plato) para la 2 horas a 37 ° C. Total [
3H] marcado con ADN se precipitó, la radiactividad se cuantificó en un contador de centelleo y se normalizaron a la concentración de proteína. F, MCF-7 y MDA-MB-231 células de cáncer de mama, y WS-1 fibroblastos de piel humana se incubaron con 10 mM CVT-11127 (CVT) o vehículo DMSO durante 24 h y la proliferación celular se evaluó por el método de tinción con cristal violeta. E, se incubaron células H460 durante 48 h con 1 CVT mu M en presencia de 1, 10, 50 y 100 mM oleato de sodio complejo con BSA (1:02 BSA: proporción de ácidos grasos). De células incubadas con vehículo DMSO se considera el grupo de control. El crecimiento celular se estimó por el método de tinción con cristal violeta. Los valores representan la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. *, P & lt;. 0,05 o menos vs control, mediante la prueba de la t de Student
La incubación con el inhibidor de SCD también resultó en una reducción profunda (~ 60%) en la incorporación de [
3H ] timidina en el ADN recién sintetizado, un marcador temprano de la tasa de proliferación celular, tanto en líneas celulares de cáncer H1299 (Figura 1D y e) y A549. Con el fin de verificar que el efecto contra el crecimiento del inhibidor químico SCD no se célula de tipo específico,-231 MDA-MB células de cáncer de mama MCF-7 y, así como en WS-1 normales humanos fibroblastos, se incubaron con CVT-11127 durante 24 h y la proliferación celular se evaluó mediante tinción de cristal violeta (Figura 1F). Se encontró que las células de cáncer de mama fueron igualmente sensibles a la acción citostática de la inhibidor de molécula pequeña SCD. Sin embargo, la proliferación de WS-1 fibroblastos normales de la piel no se vio afectada por el tratamiento, lo que sugiere que el efecto contra el crecimiento de SCD bloqueo puede ser dependiente de la tasa de replicación celular. Además, concentraciones crecientes de oleato en medio de cultivo celular parcial o totalmente invertido la inhibición de la proliferación celular en células H460 incubadas con el inhibidor de molécula pequeña SCD (Figura 1G). Se obtuvieron resultados similares con células H1299 (datos no mostrados). Estos hallazgos indican que el ácido oleico es esencialmente necesario para la replicación completamente activa de las células cancerosas.
Como era de esperar, la acción inhibidora del crecimiento de CVT-11127 se correlacionó positivamente con una inhibición significativa de la actividad de SCD en las células de cáncer de pulmón . Como se muestra en la Figura 2A-C, el tratamiento de células A549 y H1299 de 24 h con 10 mM y 5 mM de CVT-11127, respectivamente, la reducción de la actividad de SCD más de 95%, como se ensayó por la producción de [
14C ] ácido oleico a partir de su precursor radiomarcado, ácido esteárico. Esto confirma que CVT-11127 es muy efectivo en la supresión de la actividad muy alta SCD encontrado en estas líneas celulares de cáncer
.
Para la determinación de la actividad Δ9-desaturación en las células cancerosas, A549 (A, B) y células H1299 (a, C) se trataron durante 24 h con 10 mM y 5 mM respectivamente CVT, o vehículo DMSO. Seis horas antes de la cosecha, las células se pulsaron con [
14C] 18: 0 (0,25 Ci /placa). Después de la conversión en ésteres de metilo, los ácidos grasos se separaron sobre placas de TLC de nitrato-impregnada de plata. Las manchas radioactivas correspondientes a sustrato SCD y el producto ([
14C] 18:01), se visualizaron con un Fósforo Imager (A) y se cuantificaron por análisis densitométrico (B y C). Los valores representan la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. *, P & lt;. 0,05, mediante la prueba de la t de Student
Como resultado de la reducción de actividad de SCD1 por el inhibidor de molécula pequeña, la distribución de SFA y MUFA en los lípidos celulares totales de células A549 fue considerablemente alterado (Figura 3A y B). Las relaciones de MUFA a SFA tanto en n-7 y N-9 serie del ácido graso se redujo en 25% y 35%, respectivamente, en las células tratadas durante 24 h con CVT-11127 con respecto a los controles tratados con vehículo. Además, se encontró que las relaciones de MUFA /SFA en células H460 disminuido en un 47% (n-7MUFA /SFA) y 60% (n-9MUFA /SFA) en las células se someten a un tratamiento similar con CVT-11127 con respecto a DMSO tratados las células (Figura 3C y D). Las perturbaciones en la célula contenido MUFA por incubaciones con el inhibidor de molécula pequeña se observaron tan pronto como 1 h después del tratamiento (datos no mostrados). Estas observaciones muestran claramente que la composición de la cadena de acilo graso total de los lípidos en las células cancerosas está bajo el control de la actividad de SCD1, incluso cuando se cultivaron estas células en medio con FBS, que contiene cantidades significativas de ácidos grasos monoinsaturados.
células A549 (a, B) y las células H460 (C, D) se incubaron con 10 mM y 1 M CVT-11127 (CVT), respectivamente, o DMSO durante 24 h. lípidos celulares se extrajeron y los ácidos grasos se convirtieron a su forma éster metílico por transesterificación como se describe en Materiales y Métodos. composición de ésteres metílicos de ácidos grasos se determinó por cromatografía de gases y la distribución porcentual de los ácidos grasos se calculó. Los valores expresan la relación de 18: 1n-9/18: 0 (A, C) y 16:01-N7 + 18: 1n-7/16: 0 (B, D), y representan la media ± S.D.. de 4-5 muestras. *, P. & Lt; 0,01 o menos, mediante la prueba de la t de Student
La inhibición de SCD1 disminuye la síntesis de lípidos de novo a partir de glucosa en las células
Cáncer han modificado un conjunto de señalización y rutas metabólicas de mejorar la utilización de la glucosa como principal sustrato para la biosíntesis de macromoléculas y para las reacciones de generación de energía [38]. Anteriormente, hemos demostrado que el agotamiento crónico de SCD1 suprime la tasa global de la lipogénesis [19], [20]. Con el fin de diseccionar los mecanismos de regulación metabólica por SCD1, se investigó el efecto de la inhibición aguda de la actividad de SCD con la novela pequeña molécula CVT-11127 en las vías lipogénesis. Para documentar el efecto de aguda inactivación SCD en la biosíntesis de lípidos mediada por la glucosa, las células A549 y H1299 fueron tratados con inhibidor de SCD o vehículo para 6 h y 24 h, respectivamente, y la formación de lípidos celulares totales de [
14C] glucosa fue determinado. Como se muestra en la Figura 4A y B, la incorporación de glucosa marcada radiactivamente en los lípidos celulares totales se vio afectada significativamente (30%) en la ECF H1299 y A549 tratados con inhibidor con respecto a los controles tratados con vehículo. Como se ha observado anteriormente [20], la incorporación de glucosa marcada radiactivamente en los lípidos totales disminuyó en ~ 20% en las células A549 estable SCD1-desmontables (hSCDas) (Figura 4C), lo que confirma que la presencia de un SCD1 totalmente activo es crucial para el mantenimiento de la acelerada lipogénesis mediada por la glucosa en las células cancerosas. La alteración en la formación de [
14C] lípidos de glucosa marcada no haya sido causado por una absorción deficiente de la glucosa porque no se observaron cambios en la tasa de [
3H] captación de desoxiglucosa en las células tratadas con CVT o vehículo ( Figura 4D). La incorporación de la glucosa radiomarcada en los ácidos grasos de los lípidos celulares de cáncer se redujo mediante el tratamiento con CVT (Figura 4E), lo que sugiere que la formación anormal de los lípidos en las células sometidas a la inhibición de SCD1 puede ser causado por un defecto de novo grasos biosíntesis de ácidos. Como era de esperar, la producción de ácidos grasos monoinsaturados glucosa marcada fue casi totalmente suprimida en las células H1299 con un bloque en la actividad de SCD (Figura 4E, panel superior). Además, la alteración bioquímica en la lipogénesis en células con bloqueo químico de SCD parece estar ubicado aguas abajo de la formación de acetil-CoA desde una formación reducida de [
14C] lípidos de acetato marcado se observó en células H1299 con CVT tratado con respeto al vehículo controles tratados con (Figura 4F).
células A549 (a) y células H1299 (B) se incubaron con 10 mM y 1 mM CVT-11127 (CVT), respectivamente, o DMSO durante 24 h. Las células se pulsaron entonces con 1 Ci D- [U
14C] glucosa durante un máximo de 24 h. C, las células A549 con una caída estable en la expresión de SCD1 (hSCDas) y células de control transfectadas de manera simulada se sometieron a una incubación similar con [
14C] glucosa. lípidos celulares se extrajeron y la incorporación de [
14C] glucosa en lípidos totales se cuantificó por recuento de centelleo y se normalizaron a la concentración de proteína. D, la captación de glucosa basal se ensayó en células H1299 tratadas con CVT 1 M o vehículo durante 24 h mediante la estimación de la captación de [
3H] desoxiglucosa. E, células H1299 se incubaron con [
14C] glucosa en presencia o ausencia de CVT 1 M durante 6 h y los niveles de [
14C] total de ácidos grasos, así como radiomarcado SFA y MUFA (panel superior), se determinaron por TLC argentation como se describe en Materiales y métodos. F, la tasa de la síntesis de lípidos en las células H1299 se evaluó por incubación con 1 CVT M o vehículo y 0,5 Ci /plato de [
14C] acetato de etilo durante 24 h. Los lípidos se extrajeron y la radiactividad de los lípidos totales se determinó por recuento de centelleo. Los valores representan la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. *, P. & Lt; 0,05 o menos, mediante la prueba de la t de Student
Estimulación de la glucólisis /lipogénesis no revierte la disminución de la proliferación de las células deficientes en SCD1
Como se ha descrito anteriormente, tanto aguda el bloqueo farmacológico de la actividad de SCD y el gen desmontables estable de SCD1 altera significativamente las tasas de la lipogénesis de glucosa mediada por células y la replicación. La hipótesis de que una perturbación en la glucólisis aeróbica podría ser la causa primaria de la proliferación alterada y la supervivencia de las células deficientes en SCD1 ([19], [20] y en la Figura 1). De ahí se determinó la tasa de glucólisis en las células A549 y H1299 mediante la evaluación de los niveles de lactato en el medio condicionado, un indicador de la tasa de glicólisis aeróbica en las células del cáncer [39], y encontramos un aumento del 30-60% en las células de someterse a la inhibición farmacológica de la SCD en comparación con los controles tratados con vehículo (Figura 5A). Para confirmar que un cambio en el flujo de metabolitos glicolíticas no era responsable de la replicación deficiente de células SCD1-ablación, se incubaron las células en medio que contiene muy bajas (0,5 mM), normal (5,5 mM) o altas (25 mM) Niveles de glucosa y se determina la tasa de síntesis de ADN y el crecimiento celular. Como se muestra para otras líneas celulares de cáncer, las células A549 muestran estricta dependencia de la glucosa para la proliferación (Figura 5B). Cuando se cultiva en MEM esencialmente-glucosa libre (que contiene ~ 0,5 mM de glucosa de la FBS-suplementación 10%) durante 24 h, la incorporación de timidina radiomarcada en el ADN de las células con deficiencia de SCD1 (hSCDas) y de control se redujo en un 70% cuando se en comparación con las células que crecen en condiciones de cultivo estándar (glucosa 5,5 mM). Sin embargo, la significativa disminución de la tasa de síntesis de ADN observada en las células SCD1 mediante ablación persistió independientemente del nivel de glucosa en el medio de cultivo.