Extracto
activación aberrante de β-catenina Tcf-4 /señalización ha sido implicado en la carcinogénesis humana, incluyendo el cáncer colorrectal. En este estudio, se compararon los efectos de la caída Tcf-4, con la eliminación β-catenina en la proliferación celular, la apoptosis y la quimiosensibilidad en células SW480 y cáncer de colon HCT116 utilizando ARN de horquilla corta mediada por vectores de adenovirus (shRNA). Nuestros resultados muestran que, en comparación con ß-catenina caída, Tcf-4 desmontables de manera más efectiva la formación de colonias inhibido, la apoptosis inducida, y el aumento de 5-FU y la citotoxicidad mediada por oxaliplatino en células de cáncer de colon. Además, investigó los mecanismos implicados en los diferentes grados de actividad observados con β-catenina y Tcf-4 caída en las células de cáncer de colon. Foxo4 es un miembro de la subfamilia de mamíferos FOXO forkhead factores de transcripción y juega un papel importante en el control de la proliferación celular, la apoptosis y la reparación del ADN. Nuestros datos muestran que el nivel de proteína de foxo4 no cambió después del tratamiento con ambas β-catenina y Tcf-4 shRNA. Sin embargo, β-catenina shRNA se encontró para aumentar la acumulación de fosforilados foxo4 S193 y disminuir la expresión de genes diana FOXO p27Kip1 y MnSOD, mientras que Tcf-4 shRNA mostró el efecto contrario. Por lo tanto, en comparación con ß-catenina caída, Tcf-4 knockdown muestra mejor eficacia para inhibir la proliferación y la inducción de la apoptosis de células de cáncer colorrectal, que pueden estar relacionados con una mayor actividad transcripcional foxo4. Estos resultados sugieren que Tcf-4 es una posible diana terapéutica atractiva para la terapia del cáncer colorrectal
Visto:. Xie J, Xiang D-B, Wang H, Zhao C, Chen J, Xiong F, et al. (2012) La inhibición de Tcf-4 induce la apoptosis y aumenta la quimiosensibilidad de las células de cáncer de colon. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10.1371 /journal.pone.0045617
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril de 2012; Aceptado: 23 Agosto 2012; Publicado: 24 Septiembre 2012
Copyright: © Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30700978). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La vía canónica de señalización Wnt juega un papel central en numerosos procesos celulares, desde el desarrollo embrionario a la homeostasis del tejido adulto [1]. La actividad de esta vía de señalización se determina por la cantidad de β-catenina presente en el citoplasma. En ausencia de señalización de Wnt, citoplásmica β-catenina se mantiene normalmente en niveles bajos a través de la degradación continua de la ubiquitina-proteasoma mediada de β-catenina, que está regulada por un complejo de destrucción compuesto de la poliposis coli adenomatosa (APC), la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β), Axin /Conductin, caseína quinasa 1α (CK1α), y otras proteínas que median en estas reacciones bioquímicas. La unión de las proteínas Wnt al complejo receptor de la superficie celular Fz /LRP facilita la fosforilación de la cola citoplásmica de la proteína relacionada con el receptor LDL (LRP) cola citoplasmática por GSK-3β [2]. Esto desencadena la interacción del complejo Fz /LRP con Dishevelled (DSH) y Axin, lo que conduce a la inactivación del complejo de la destrucción, lo que resulta en la acumulación de no fosforilados β-catenina en el citoplasma. La β-catenina acumulada se transloca al núcleo y se une a Tcf /Lef factores de transcripción para regular los genes diana, tales como c-Myc y ciclina D1 [3] - [5].
aberrante Wnt /β señalización catenina se ha informado de contribuir a varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer colorrectal (CRC) [6], [7]. El gen APC o el sitio de fosforilación de GSK-3β en el exón 3 de la
β-catenina
gen (
CTNNB1
) está mutado en muchas células cancerosas, incluyendo CRC, lo que resulta en la actividad transcripcional activado de la señalización de β-catenina /Tcf [8]. Por otra parte, la translocación nuclear de β-catenina en el CCR se asocia significativamente con la progresión del tumor y la supervivencia de los pobres [9], [10]. Por lo tanto, el control de β-catenina y /o el control de su expresión del gen diana aguas abajo representa un objetivo ideal para la terapéutica del cáncer y la quimioprevención [11], [12], [13] .Van de Wetering
et al
. informaron que desmontables de β-catenina por pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) o desmontables de TCF-4 por dominante negativo TCF-4 (dnTCF) inhibió eficazmente la actividad de la TOPflash TCF-reportero y inducida por la detención del ciclo celular y la detención del crecimiento en el colon LS174T células del cáncer [14], [15]. Sin embargo, Tang
et al.
Informó que desmontables de TCF-4 por siRNAs aumentó el crecimiento celular en DLD-1 en las células de cáncer de colon [16]. Estas discrepancias indican que diferentes líneas celulares pueden responder de manera diferente a la TCF-4 caída.
foxo4 es un miembro de la subfamilia de mamíferos factores de transcripción forkhead FOXO [17] que son importantes en una variedad de procesos, incluyendo la proliferación celular , la diferenciación, la apoptosis, la reparación del ADN, y la protección contra el estrés [18]. Es un objetivo abajo AKT fosforilada y se convierte en tres serina y treonina residuos altamente conservados (THR-28, Ser-193, y Ser-258) tras la activación de PKB /Akt. Estudios recientes han demostrado que la β-catenina se une al factor de transcripción FOXO, que desempeña un papel supresor de tumores en una variedad de tipos de cáncer. β-catenina se une a FOXO y aumenta la actividad transcripcional [19]. Por otra parte, la proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG) inhibe la señalización de TCF en células de cáncer de colon mediante el bloqueo de la expresión de β-catenina y la activación de foxo4 [20]. Por lo tanto, β-catenina parece servir un doble efecto positivo mediante el equilibrio (a través de Tcf-4) y negativo (a través de foxo4) regulación de la proliferación celular y la apoptosis.
En este estudio, la hipótesis de que el factor de transcripción aguas abajo Tcf-4 es un objetivo terapéutico más prometedor que β-catenina en el tratamiento de CRC. Nuestro objetivo fue comparar los efectos de Tcf-4 caída y caída β-catenina en la proliferación celular, la apoptosis y la quimiosensibilidad en el SW480 (mutante
APC
, de tipo salvaje
CTNNB1
) y HCT116 (mutante
CTNNB1
, de tipo salvaje
APC)
líneas celulares de cáncer de colon utilizando ARN corto horquilla (shRNA). Mostramos que en comparación con ß-catenina desmontables, Tcf-4 caída inhibe significativamente la proliferación celular, induce la apoptosis de las células, y mejora la quimiosensibilidad de las células de cáncer de colon a través de la regulación positiva de la actividad transcripcional foxo4.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
SW480 y las células HCT116 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en RPMI1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U /ml de penicilina y estreptomicina bajo condiciones de cultivo estándar. Oxaliplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), y de tetrazolio metil tiazolilo (MTT) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.). El plásmido pDC316-EGFP-U6 fue proporcionada por Vector de Gene Technology Company Limited (VGTC, Pekín, China) y el plásmido pBHGloxΔE1, 3Cre fue proporcionado por Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Toronto, Canadá).
los vectores de adenovirus recombinantes
sobre la base de las secuencias de cDNA (
β-catenina
GenBank adhesión no.
NM_001098209,
Tcf-4
GenBank adhesión no. NM_030756), un par específico de oligonucleótidos con una horquilla corta y su secuencia de control negativo se han diseñado y sintetizado, y luego insertado en un pequeño plásmido lanzadera pDC316-EGFP-U6 en los sitios de enzimas de restricción BamH I y Hind III. Se diseñaron oligonucleótidos con los cebadores siguientes [21]:
Reenviar β-catenina shRNA imprimación
'- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3', invierta β-catenina imprimación shRNA:. 5'-3-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG ';
Reenviar Tcf-4 shRNA Primer
5'-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3', revertir Tcf-4 shRNA imprimación:
5'-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3;
control de shRNA:.
dirección de avance
5'-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 ', dirección inversa. 5'-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 '. El control shRNA no tiene homología con ningún genes humanos correspondientes. Todas las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN. Los plásmidos lanzadera resultantes fueron co-transfectadas con el plásmido de rescate adenovirus pBHGloxΔE1, 3Cre en células 293 para adquirir adenovirus recombinante. Recombinante eficiencia adenovirus se detectó mediante el examen del efecto citopático y la expresión de EGFP en las células. Los títulos de adenovirus fueron medidos después de la amplificación y purificación utilizando TCID50 ensayos.
formación de colonias de ensayo
células SW480 se infectaron con adenovirus recombinantes para 90 min, y después de 24 h, que se sembraron a 300 células /pocillo en placas de 6 pocillos y se dejó que se adhirieran durante 24 h. Después de la incubación, se cambió el medio y las placas se incubaron durante 10 días adicionales, en las mismas condiciones de cultivo. Las colonias se fijaron y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 100% de etanol y luego se contaron. Clones de al menos 50 células se cuentan como una colonia.
Ensayos de citotoxicidad
SW480 células se infectaron con los adenovirus recombinantes para 90 min, y después de 24 h, que se sembraron en 96 pocillos las placas a 4000 células /pocillo. Después de 24 h de cultivo, las células se trataron con las concentraciones indicadas de 5-FU o oxaliplatino para 72 h. Después, se añadieron 20 l de MTT (5 g /L) a cada pocillo y se incubó durante 4 h adicionales. Los medios de cultivo se descartan, se añadió 0,15 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO), y las placas se incubaron durante 10 min adicionales con la vibración. La absorbancia se midió a 490 nm usando un lector de microplacas (modelo 550, Bio-Rad, EE.UU.).
Apoptosis Ensayo
SW480 células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 0,5 × 10
6 células /pocillo. Veinticuatro horas después de la siembra, las células en 70% de confluencia fueron infectadas con adenovirus para 90 min y luego se lavan para eliminar los adenovirus. Después de un adicional de cultivo de 24 h, el índice de apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo utilizando el kit de FITC-anexina-V como se describe anteriormente [22].
Análisis Western Blot
Se recogieron las células y las proteínas totales se extrajeron con inhibidores de la proteasa que contienen tampón RIPA. Western blot se llevó a cabo como se describe anteriormente [22]. Brevemente, alícuotas iguales de proteína (50 mg) en cada muestra se resolvieron por electroforesis 10 o 12% de dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear con leche en polvo 5% no grasa, las membranas se incubaron con anticuerpos para ß-catenina (1:5,000), Tcf-4 (1:1,000), c-myc (1:2000), ciclina D1 (1: 2000), foxo4 (1:1000), foxo4 S193 (1:500), p27Kip1 (1:2000), MnSOD (1:2000), caspasa-3 (1:500), y β-actina (1:3000) . Las membranas se incubaron entonces con un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano secundaria (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Las proteínas se detectaron con un sistema de detección de quimioluminiscencia (Pierce), y la emisión de luz fue capturado en la película de rayos X Kodak.
La transfección y el gen reportero de ensayo
Para las mediciones de β-catenina /se han usado; Tcf-4 actividad transcripcional, un par de plásmidos informadores de luciferasa (Upstate Biotechnology TOPflash /FOPFLASH). El pRL-TK gen indicador de luciferasa del plásmido (Promega) fue co-transfectadas para normalizar la eficiencia de transfección. La transfección transitoria se realizó utilizando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las células se infectaron con los adenovirus recombinantes para 90 min, y después de 24 h, posteriormente fueron co-transfectadas con el reportero de luciferasa TOPflash (o mutante de control de flash FOP vector) y pRL-TK. Después de una incubación adicional de 24 h, se recogieron las células para la medición de la actividad de luciferasa usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega). Se realizaron tres experimentos repetidos.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (S. D.). La significación estadística de las diferencias se determinó mediante un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) utilizando el software SPSS v12.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.). Un valor de
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
1. Desmontables de Tcf-4 o β-catenina por transducción mediada por adenovirus de shRNA
a desmontables la expresión de Tcf-4 o β-catenina, los vectores adenovirales se generaron para expresar una shRNA orientación Tcf-4 o β- catenina. El análisis de transferencia Western reveló una disminución dependiente de la dosis en la expresión de proteínas Tcf-4 o β-catenina en 48 h después de la infección con los respectivos vectores adenovirales en células SW480 y HCT116, mientras que no se observó ningún cambio en la expresión de la proteína después de la infección con un adenovirus con adición revueltos shRNA (Fig. 1)
.
SW480 y las células HCT116 se trataron con diferente multiplicidad de infección (MOI) de adenovirus que lleva shRNA. Las muestras se recogieron a las 48 h post-infección. Western blot de lisados de células para la expresión de la proteína β-catenina (a) y Tcf-4 (b).
2. Tcf-4 derribo suprime la señalización Wnt
SW480 y líneas celulares HCT116 tiene β-catenina /Tcf-4 actividad transcripcional constitutivamente activa. Por lo tanto, las células fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido reportero TCF, TOPflash, que consta de tres TCF sitios aguas arriba de un promotor mínimo tk y el marco de lectura abierto de la luciferasa, o plásmido control, FOPFLASH, que es idéntica a TOPflash excepto que contiene mutante de unión sitios de unión TVC inactivos. Figura 2a mostró que tanto β-catenina shRNA y Tcf-4 shRNA marcadamente suprimida β-catenina /Tcf-4 actividad transcripcional endógeno comparado con el control shRNA en ambas líneas de células SW480 y HCT116.
Células
SW480 y HCT116 eran tratado con adenovirus (50 MOI) que llevan shRNA. una, a las 24 h post-infección, las células se cotransfectaron con genes reporteros que alberga sitios Tcf-4 de unión (TOPflash) o un sitio de unión a Tcf-mutante (FOPFLASH), respectivamente, junto con PRL-TK. La actividad de luciferasa se determinó 24 h después de la transfección, normalizado contra los valores de la correspondiente actividad de PRL-TK. Los valores representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,01 frente al control shRNA. b, A las 48 h post-infección, se recogieron las células y expresión de proteínas se determinó por Western blot.
Ciclina D1
y
c-Myc ¿Cuáles son conocidos β-catenina /Tcf-4 genes diana, y por lo tanto también se investigó la expresión de la proteína de la ciclina D1 y c-Myc por Western blot. La Figura 2b muestra que β-catenina shRNA o Tcf-4 tratamiento shRNA resultaron en una disminución marcada de ciclina D1 y la proteína c-Myc tanto en las células SW480 y HCT116.
3. Tcf-4 Derribo Mejora foxo4 Actividad
Para analizar el nivel de proteínas y la activación de la proteína foxo4, se cultivaron las células SW480 y HCT116 durante 48 h después de la infección con adenovirus, y el nivel de proteína se determinó mediante análisis de transferencia Western. El nivel de proteína foxo4 no se ha modificado significativamente después del tratamiento con β-catenina shRNA o Tcf-4 shRNA (Fig. 3). Sin embargo, el nivel de proteína fosforilada de foxo4 S193 se incrementó notablemente después del tratamiento con β-catenina shRNA, y disminuyó después del tratamiento con Tcf-4 shRNA (Fig. 3). Los niveles de expresión de genes diana FOXO p27Kip1 y MnSOD se redujeron marcadamente después del tratamiento con β-catenina shRNA y aumentaron después del tratamiento con Tcf-4 shRNA (Fig. 3).
SW480 y las células HCT116 se trataron con adenovirus ( 50 MOI) que lleva shRNA. Las muestras se recogieron a las 48 h post-infección. El nivel de proteína foxo4, fosforilada foxo4 S193, p27Kip1, y MnSOD se determinó por Western blot.
4. Tcf-4 Derribo inhibe la proliferación celular e induce la apoptosis de las células en células de cáncer colorrectal
A continuación se investigó el efecto del Tcf-4 caída en la proliferación celular y la apoptosis en las células SW480 y HCT116. La proliferación celular se determinó usando un ensayo de formación de colonias. Como se muestra en la Figura 4a, Tcf-4 knockdown indujo una inhibición significativamente más fuerte de la proliferación celular en comparación con ß-catenina caída tanto en las células HCT116 SW480 y (p & lt; 0,05, p & lt; 0,01, respectivamente). Para investigar si la inhibición del crecimiento mediada por shRNA Tcf-4 está asociado con la apoptosis, se trata y las células no tratadas se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la figura 4b, tanto β-catenina shRNA y Tcf-4 shRNA indujo un aumento significativo en el número de células apoptóticas en comparación con las células no tratadas y los grupos de control de shRNA tratados (p & lt; 0,01), y Tcf-4 shRNA indujo un número mayor las células de la apoptosis que ß-catenina shRNA (p & lt; 0,01). La enzima caspasa-3 proapoptótico se activa en un punto de convergencia entre las vías de inducción de la apoptosis intrínsecos y extrínsecos [23]. Por lo tanto, hemos examinado la caspasa-3 escisión como un marcador de apoptosis. De acuerdo con la citometría de flujo hallazgos, Tcf-4 shRNA indujo un aumento mayor en la caspasa-3 en comparación con la escisión ß-catenina shRNA (Fig. 4c).
Las células fueron tratadas con adenovirus (50 MOI) que llevan shRNA para 24 h. a, la proliferación celular se determinó usando un ensayo de formación de colonias. b, la apoptosis celular se determinó mediante la tinción de anexina-V-FITC. c, la expresión de la enzima caspasa-3 proapoptótico se determinó por transferencia de western. Cada punto de datos representa la media ± S. D. de tres o más independientes determinaciones. *
P Hotel & lt; 0,01 frente al control shRNA;
#
P Hotel & lt; 0,05 frente a β-catenina shRNA;
##
P
. & Lt; 0,01 en comparación con β-catenina shRNA
5. Tcf-4 Desmontables mejora la quimiosensibilidad en células de cáncer colorrectal
SW480 y las células HCT116 se trataron previamente con los adenovirus recombinantes que llevan la respectiva shRNA y luego fueron tratados con 5-FU o oxaliplatino a diversas concentraciones durante 72 h. La viabilidad celular se determinó usando un ensayo de MTT. Como se muestra en la Figura 5, β-catenina tratamiento shRNA aumentó 5-FU y la citotoxicidad mediada por oxaliplatino. Además, Tcf-4 tratamiento shRNA resultó en un aumento más significativo de la citotoxicidad en comparación con ß-catenina tratamiento shRNA en cada punto del 5-FU y oxaliplatino (p & lt; 0,01) la concentración.
Las células se infectaron con adenovirus (50 MOI) que lleva shRNA; 48 h después de la infección, las células fueron tratadas con 5-FU o oxaliplatino a diversas concentraciones durante 72 h. La viabilidad celular se determinó usando un ensayo de MTT. Los gráficos de barras representan los valores medios de determinaciones por triplicado ± sd
Discusión
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los tumores malignos de adultos más común que ocurren en todo el mundo en términos de morbilidad y mortalidad . A pesar de las mejoras en el tratamiento médico, los resultados del tratamiento para la enfermedad localmente avanzada y metastásica sigue siendo decepcionante, con tasas de supervivencia a 5 años inferior al 10% en pacientes con metástasis. vía de señalización WNT aberrante es un evento temprano en la progresión de 90% de CRC. Se produce principalmente a través de mutaciones de
APC gratis (hasta 80%) y con menor frecuencia de
β-catenina gratis (alrededor del 10%) o AXIN2 [24]. Las mutaciones en el
APC /β-catenina
genes, lo que resulta en la activación aberrante de la ruta de β-catenina /Tcf-4, son comunes en la CRC, lo que sugiere que la inhibición selectiva de esta vía podría ser un enfoque terapéutico potencial para controlar CRC. Nosotros y otros han informado anteriormente de que los compuestos naturales y medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) inhiben la /β-catenina señalización Wnt [22], [25], [26], [27], [28]. Sin embargo, actualmente no existe ningún inhibidor selectivo para disponible como un agente terapéutico de esta vía. Estudios recientes han demostrado que la mediada por shRNA silenciamiento de los genes de β-catenina inhibe significativamente la proliferación celular e induce la apoptosis celular en células de cáncer de colon humano [29], [30], [31].
En el presente estudio, nos centramos específicamente en la comparación de las eficacias de caída β-catenina y Tcf-4 caída en las células del cáncer de colon, y se investigaron los posibles mecanismos moleculares responsables de estos efectos. Hemos demostrado que Tcf-4 knockdown induce una inhibición significativamente más fuerte de la proliferación celular, la inducción de apoptosis, y la mejora de la quimiosensibilidad en células de cáncer de colon en comparación con ß-catenina caída.
Activado β-catenina /Tcf-4 la señalización por la acumulación de β-catenina en el núcleo ha sido implicado en la carcinogénesis humana, incluyendo CRC. Esta acumulación puede ser consecuencia de la mutación de cualquiera de los genes supresores de tumor
APC
o
β-catenina
sí mismo. Al menos el 60% de los casos de CCR esporádicos contiene una mutación APC, y casi la mitad de ellos muestran anormalidades en ambos alelos APC [32], [33], [34]. En el presente estudio, se realizó un estudio sobre el mecanismo detallado para evaluar la eficacia de la inhibición de la β-catenina /Tcf-4 de señalización en el CCR humano usando la línea celular CRC SW480 humano, que alberga APC mutante y de tipo salvaje β-catenina, y la línea celular HCT116, que alberga mutante β-catenina y APC de tipo salvaje. En primer lugar, construimos vectores adenovirales que llevan β-catenina humana o Tcf-4 shRNA con el fin de derribar a la expresión de β-catenina o Tcf-4. Western blot reveló una disminución dependiente de la dosis en Tcf-4 o expresión de la proteína β-catenina en SW480 y células HCT116 a las 48 h después de la infección con los respectivos vectores adenovirales. Además, tanto la β-catenina shRNA y Tcf-4 shRNA notablemente reprimida la actividad β-catenina /Tcf-4 transcripcional, así como la expresión de dos genes diana conocidos, ciclina D1 y c-Myc, de SW480 y células HCT116. Estos datos indican que tanto la caída β-catenina y Tcf-4 caída suprimen la actividad de β-catenina /Tcf-4
in vitro
.
La coordinación entre la proliferación celular y la apoptosis juega un papel muy importante en la carcinogénesis y el desarrollo de cáncer de colon. La vía de β-catenina /Tcf-4 es una ruta de señalización importante que inclina la balanza de la proliferación celular y la apoptosis en células de cáncer. En nuestro estudio, β-catenina caída inhibe la proliferación celular y la apoptosis celular inducida tanto en SW480 y células HCT116. En comparación con knockdown β-catenina, Tcf-4 knockdown indujo una significativamente mayor inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis. Por otra parte, se encontró que Tcf-4 caída aumentó significativamente la quimiosensibilidad de ambas células SW480 y HCT116 a 5-FU y oxaliplatino.
Además, investigó los mecanismos implicados en las eficacias diferenciales de la caída β-catenina y TCF 4 desmontables en las células SW480 y HCT116. Nuestros datos muestran que el nivel de proteína de foxo4 no cambió después del tratamiento con ambas β-catenina y Tcf-4 shRNA. Sin embargo, se encontró β-catenina shRNA para aumentar la acumulación de fosforilados foxo4 S193 y disminuir la expresión de genes diana FOXO p27Kip1 y MnSOD, que es coherente con un informe anterior que muestra que β-catenina-siRNA inhibió la actividad de reportero TCF y FOXO- señalización dependiente en las células de cáncer de colon LS174 [19]. Por el contrario, Tcf-4 shRNA mostró el papel regulador opuesta a ß-catenina en foxo4. Estos hallazgos sugieren que la β-catenina shRNA inducida por la baja regulación de la señalización dependiente de foxo4 es independiente de Tcf-4.
FOXO factores juegan un papel importante en el control de la proliferación celular, la apoptosis y estrés oxidativo [17]. [18]. Sus funciones están reguladas por múltiples vías de señalización, incluyendo AKT. En ausencia de la activación de AKT, foxo4 se encuentra en el núcleo, donde funciona como un factor de transcripción [35]. Tras la activación de AKT, foxo4 se fosforila en tres serina y treonina residuos altamente conservados (Ser-193, Thr-28, y Ser-258), seguido de la inactivación y la exclusión nuclear [36]. Essers et al. [19] mostró que no había interacción funcional entre β-catenina y FOXO en el estrés oxidativo de señalización, y β-catenina-específica shRNA reduce TCF y FOXO actividad transcripcional en células de cáncer de colon LS174T, que expresan una forma mutante de β-catenina. La evidencia acumulada sugiere que los factores FOXO funcionan como supresores de tumores en una variedad de cánceres. Tang et al. [37] también encontró que foxo4 inhibe la expresión de HIF-1α y VEGF en células de cáncer. Por otra parte, un estudio reciente mostró que la sobreexpresión de tipo salvaje foxo4 dio lugar a un aumento de la citotoxicidad mediada por doxorubicina en células de cáncer de colon HCT116, que se agrava aún más por la sobreexpresión de un mutante foxo4 localizada exclusivamente en el núcleo [38].
por lo tanto, la hipótesis de que la regulación al alza de la actividad foxo4 es responsable de la mayor eficacia de Tcf-4 shRNA efectos en las células de cáncer de colon en comparación con ß-catenina shRNA. Por un lado, Tcf-4 y foxo4 pueden competir para β-catenina [19]. Cuando se inhibe la señalización Tcf, β-catenina se une directamente a foxo4 y mejora foxo4 actividad transcripcional. Por otro lado, TCF4 caída puede regular a la baja ciertas vías de señalización, tales como Akt. Un informe reciente muestra que se detectó una reducción significativa de los niveles AKT2 y la fosforilación de Akt después de la caída del Tcf-4 utilizando Tcf-4 siRNA en células de glioma [39]. Por lo tanto, la inactivación de Akt por Tcf-4 resultados shRNA en desfosforilación de foxo4, que en consecuencia se activa la señalización FOXO-dependiente.
En conclusión, hemos demostrado que dirige la inhibición de la β-catenina /Tcf-4 de señalización inhibe la célula proliferación, induce la apoptosis, y mejora la quimiosensibilidad de las células de cáncer de colon. Además, en comparación con ß-catenina caída, Tcf-4 knockdown mostró una mayor eficacia para inhibir el crecimiento celular y la inducción de apoptosis CRC, lo que puede estar relacionado con un aumento de la actividad transcripcional foxo4. Estos resultados sugieren que Tcf-4 puede ser una diana terapéutica atractiva para la terapia CRC. Se necesitan más estudios para confirmar estos resultados y determinar la utilidad de la orientación Tcf-4.