Extracto
cáncer
pulmón o carcinoma pulmonar se derivan principalmente de las células epiteliales que son delgadas y la línea en las superficies alveolares de los pulmones para el intercambio gaseoso. ANO1 /TMEM16A, inicialmente identificado a partir de células epiteliales de las vías respiratorias, es un miembro de Ca
2 + activado por Cl
- canales (CaCCs) que funcionan para regular la secreción epitelial y volumen de la celda para el mantenimiento de iones y la homeostasis del tejido. ANO1 /TMEM16A Recientemente se ha demostrado ser altamente expresado en varios epitelio originó carcinomas. Sin embargo, se desconoce el papel de ANO1 en el cáncer de pulmón. En este estudio, mostramos que la inhibición de los canales de cloruro activada por calcio ANO1 /TMEM16A suprime el crecimiento tumoral y la invasión en el cáncer de pulmón humano. ANO1 es upregulated en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Llamar a la puerta abajo ANO1 por pequeños ARN de horquilla inhibieron la proliferación, la migración y la invasión de GLC82 y NCI-H520 cancelar las células evaluadas por CCK-8, los aspirantes a la curación, transwell y 3D ensayos de agar blando. ANO1 proteína se sobreexpresa en el 77,3% de los casos de tejidos de adenocarcinoma de pulmón humano detectados mediante técnicas de inmunohistoquímica. Además, el crecimiento del tumor en ratones desnudos implantados con células GLC82 se suprimió significativamente por ANO1 silenciamiento. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan evidencia de que la sobreexpresión ANO1 contribuye al crecimiento del tumor y la invasión de cáncer de pulmón; y la supresión de ANO1 sobreexpresión puede tener un potencial terapéutico en el tratamiento del cáncer de pulmón
Visto:. Jia L, W Liu, Guan L, M Lu, Wang K (2015) Inhibición de tumor activados por calcio Cloruro de Canal ANO1 /TMEM16A Suprime el crecimiento y la invasión en el cáncer de pulmón humano. PLoS ONE 10 (8): e0136584. doi: 10.1371 /journal.pone.0136584
Editor: Shang-Zhong Xu, de la Universidad de Hull, Reino Unido
Recibido: 28 de abril de 2015; Aceptado: 5 Agosto 2015; Publicado: 25 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación al astillero del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2013CB531302 y 2014ZX09507003-006-004) y la Fundación Nacional de Ciencias de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón o carcinoma pulmonar que se deriva de las células epiteliales generalmente se clasifica en el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). A medida que el tipo más común de cáncer de pulmón, NSCLC representa el 84% de los casos estimados con dos subtipos principales: el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas [1]. En la actualidad, la patogénesis y el desarrollo de cáncer de pulmón no ha sido claramente definido. aumento de la evidencia indica que los canales iónicos juegan un papel importante en la proliferación de células de cáncer y la invasión, y en la conducción de la progresión del cáncer en absoluto diferentes etapas [2, 3].
Los canales iónicos son los poros llenos de agua y proteínas de transmembrana presentes en todas las células vivas, participando en diversas actividades fisiológicas integrales de la excitabilidad, la contracción, la secreción, ciclo celular y cascadas metastásicos [4, 5]. expresión normal de los canales iónicos es crucial para mantener Ca
2 + y el tejido homeostasis durante la proliferación celular y la diferenciación a través de gobierno los flujos de iones celulares, la regulación del volumen celular, y la generación de potencial de membrana [6, 7]. Los canales de cloruro son importantes para muchos procesos biológicos, incluyendo el transporte transepitelial de los flujos de iones, la regulación del volumen celular, la diferenciación y la apoptosis [8, 9]. volumen celular estable y constante y la homeostasis de iones durante la proliferación y la diferenciación celular son estrictamente necesarias para la función celular y la supervivencia [10, 11]. flujo de cloruro a través de los canales de cloruro en respuesta a la celda inflamación es uno de los mecanismos críticos por el cual las células restaurar su volumen siguiente perturbaciones osmótica y el estrés causado por las actividades metabólicas intensivos resultado de agua, no electrólito y de intercambio de iones en las superficies epiteliales [12-14]. La desregulación de la expresión del canal iónico se convierte en epigenetically anormal en las células cancerosas metastásicas [15-17]. Por ejemplo, la regulación positiva de cloruro de canal intracelular 1 (CLlC1) está implicado en la migración de células de cáncer de colon y la invasión a través de la mediación de disminución de volumen regulatorio (RVD) mecanismo de [18]; y la sobreexpresión de cloruro de canal 3 (ClC3) contribuye a múltiples carcinomas humanos, tales como glioma, de pulmón, de mama y tumores de cuello uterino [19]. También se ha informado de que el aumento en el calcio intracelular se produce durante desafío hipotónica está relacionada con RVD y participa con apoptosis cáncer, lo que indica la interacción entre la homeostasis del calcio y el volumen homeostasis [20, 21].
Ca
2 + activados por Cl
- canales (CaCCs) son los principales reguladores de la secreción epitelial y la regulación del volumen celular [22, 23]. TMEM16A, también conocido como DOG1, ORAOV2, o TAOS-2, se identificó a partir de células epiteliales de las vías respiratorias como un CACC de buena fe que media endógeno Ca
2 + cloruro de corriente, activado [24-26]. TMEM16A también se ha referido como anoctamin 1 (ANO1) debido a su selectividad de aniones y ocho segmentos transmembrana (OCT) [25]. El
ANO1 /TMEM16A
gen se localiza en 11q13, una de las regiones amplificadas con mayor frecuencia en los cánceres humanos [27, 28] y asociado con un mal pronóstico [29]. Recientemente se ha demostrado que ANO1 /TMEM16A se amplifica o sobreexpresa en varios cánceres humanos tales como tumores del estroma gastrointestinal (GIST), cáncer de próstata, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC), cáncer de mama y células de cáncer colorrectal [27, 30 33]. ANO1 sobreexpresión también se correlaciona con mal pronóstico de HNSCC y de mama pacientes con cáncer [30, 34], y la inhibición farmacológica de la actividad CACC ANO1 por CaCCinh-A01 y T16Ainh-A01 puede inhibir la proliferación de las células del cáncer [32, 35, 36]. Aunque la razón de la alta expresión de ANO1 en los tumores no es clara, varios estudios han demostrado que ANO1 participa en la señalización oncogénica mediante la activación de EGFR y CaMK vías para promover ciclo celular y la progresión del cáncer [30, 37]. Se ha informado de que las proteínas que interaccionan con ANO1 tales como proteínas reguladoras de unión a la actina de señalización /andamios ezrin, radixina, moesina y RhoA pueden participar en la regulación de la función ANO1 [38, 39]. Más recientemente, ANO1 y EGFR se encuentran para formar un complejo funcional que regula la proliferación celular HNSCC [40]. Sin embargo, si ANO1 /TMEM16A juega un papel en la génesis de tumores de cáncer de pulmón sigue siendo desconocido.
En este estudio, encontramos que el CACC ANO1 está altamente regulada positivamente en los tejidos de cáncer de pulmón humano. ANO1 upregulation se confirmó en diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón humano. Desmontables expresión ANO1 por el ARN de horquilla corta inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón y GLC82 NCI-H520. La inhibición de la ANO1 el crecimiento del tumor también suprimida en ratones desnudos implantados con estable transfectadas GLC82 células. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que la proteína de membrana ANO1 puede servir como un biomarcador potencial y objetivo para el diagnóstico y la terapia del cáncer de pulmón.
Métodos
Cultivo de células
2BS línea de células pulmonares normales , líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y H1299 fueron regalos de Dr. Hongti Jia en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud. Las células A549 y H1299 fueron obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). 2BS células fueron obtenidas originalmente del Instituto Nacional de Productos Biológicos (Pekín, China). líneas celulares de cáncer de pulmón GLC82 y Calu-3 para el adenocarcinoma y NCI-H520 para el carcinoma de células escamosas se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC). Las células 2BS se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), y las otras líneas celulares se propagaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen). El medio se suplementó con suero de ternera fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en medio a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2.
transfecciones shRNA y generación de líneas celulares estables
ANO1 shRNAs revueltos y plásmidos fueron shRNA construido por GeneChem Co., Ltd. (Shanghai, china). El shRNAs se clonaron en los sitios BamHI y HindIII del pGCsi-U6 /Neo vecor /GFP, y se utilizó la secuencia de bucle en la TTCAAGAGA. La secuencia diana de tres ANO1 shRNAs fueron los siguientes: shRNA1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA; shRNA2, GCATCTATTTGACTTGTCT; shRNA3, CGAAGAAGATGTACCACAT. La secuencia fue CGAGTGGTCTAGTTGAGAA revueltos. Para la transfección, se utilizó 8 g de ADN por placa de 60 mm con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, y medio de transfección se reemplazó con medio de cultivo 4 horas después de la transfección. Todos los experimentos posteriores se realizaron a 48-72 h después de la transfección y se repitieron por triplicado. Para generar la línea celular estable que expresa GLC82 ANO1 shRNA, se seleccionaron las células transfectadas por debajo de 800 mg /ml de G418.
tinción inmunohistoquímica
muestras de tejido de cáncer humano resecado quirúrgicamente consistentes en 44 casos de adenocarcinoma de pulmón y 40 se obtuvieron los casos de carcinoma de pulmón de células escamosas retrospectivamente de la Universidad de Pekín Tercer hospital. Las muestras de tejido fueron totalmente des-identificarse antes del acceso por nosotros y todos los pacientes fueron informados y dieron su consentimiento para el uso de su tejido extirpado para futuras investigaciones. Las secciones de tejido se incubaron en una cámara seca 60 ° C durante una hora antes de-con parafina en xileno tres veces y hidratados a través de una serie graduada de etanol. Tratada en peróxido de hidrógeno 3% durante 10 minutos, los tejidos se hierven en 10 mM solución de recuperación de antígeno de citrato (pH 6,0) durante 20 minutos utilizando un horno de microondas. Inmunohistoquímica (IHC) tinción se llevó a cabo mediante la incubación de los tejidos con el anticuerpo primario a ANO1 (1: 100; ab53212, Abcam) a 4 ° C durante la noche. Después de incubar los tejidos con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-HRP durante 30 minutos a 37 ° C, se utilizó el sistema de cromógeno DAB para la visualización. Las puntuaciones se calculan multiplicando la intensidad (número entero entre 0 y 3).
análisis de transferencia de Western
Las células se lavaron tres veces en solución de tampón fosfato enfriado con hielo y se lisaron en tampón RIPA con 1 X Detener y fosfatasa de la proteasa cóctel de inhibidores (Pierce, Rockford, IL). Las muestras se cuantificaron usando un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, EE.UU.). Cantidades iguales de proteína (50 mg) se separaron usando PAGE (8%) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Después se bloquearon con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 5% de leche, la membrana de transferencia se incubó durante la noche a 4 ° C con anti-conejo ANO1 (1: 1000; Abcam) y de conejo anti -β-actina (1: 500; de Santa Cruz, CA). La membrana se incubó con un anticuerpo anti-conejo IgG-HRP anticuerpo secundario (1: 5.000, Santa Cruz) durante una hora a temperatura ambiente y se visualizó usando el Immobilon Western HRP Sustrato
proliferación celular CCK8 ensayo
.
la proliferación celular se midió con el Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japón). 500 células por pocillo fueron inoculadas en placas de 96 pocillos. se añadieron 10 l de la solución Kit Recuento celular en cada pocillo a las 24, 48, 72 y 96 horas después de sembrado. A continuación, las placas de 96 pocillos se incubaron durante 2 horas a 37 ° C antes de la densidad óptica (OD) se midió a 450 nm por un lector de microplacas.
Colonia ensayo de formación en la cultura
Para formación de colonias en cultivo, las células transfectadas (tratado con 800 mg /ml de G418 durante 2 días después de 48 horas de la transfección) se sembraron a 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% para 12-15 días. Las colonias restantes fueron teñidas con 0,1% de cristal violeta y se contaron, y se tomaron imágenes después de la tinción.
formación de colonias en agar blando ensayo
ensayo de formación de colonias en agar blando se realizó en un 6- así placa. La capa de base se hizo mezclando 1,2% de agarosa (Invitrogen) y el volumen equivalente de medio 2 x con 20% de FBS. Entonces se recogieron las células de cada grupo y se suspendieron en medio que contiene 0,4% de agarosa y se sembraron sobre la capa de base por triplicado a una densidad de 3000 células por pocillo. Después de 30 días, se observaron aparentemente los clones y se congelaron las células durante cuatro horas, y luego se tiñeron por 0,02% de cristal violeta. Las imágenes fueron tomadas después de la tinción.
cicatrización de heridas ensayo
Para medir la actividad de migración, se inocularon células en placas de seis pocillos, que se cultiva a 90% de confluencia en RPMI-1640 que contiene 10% suero bovino fetal. Luego, las células se mueren de inanición cambiando el medio a suero libre de RPMI-1640 y se cultivaron durante 24 h. Las células se raspó con 100 l puntas de pipeta de plástico y se lavaron con una solución tampón de fosfato. Las imágenes se recogieron cada 24 horas en un microscopio de contraste de fase invertida (Olympus; ampliación: 10 ×). La relación del área de la herida restante se calculó en relación con el área inicial de la herida y normalizado a grupo o DMSO grupo shRNA revueltos.
Transwell ensayo
actividad invasión celular se evaluó en 8,0 micras de poro transwell tamaño cámaras de placas 24 de inserción (Corning, Acton, MA, EE.UU.) recubiertas con BioCoatMatrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.). Después de pre muerto de hambre durante 24 horas por cultivo en un medio libre de suero, 3X10
4 (NCI-H520) o 5X10
4 células (GLC82) por pocillo se sembraron en las cámaras superiores con medio libre de suero y se incubaron durante 48 (NCI-H520) o 72 horas (GLC82). Las cámaras inferiores se rellenaron con medio de suero bovino fetal 10%. Después de limpiar las células fuera desde el lado superior de la cámara superior, el lado inferior de la cámara superior se fijó con metanol y se tiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Las imágenes fueron fotografiadas bajo un microscopio. El área de DAPI en la cámara inferior se normalizó al grupo shRNA revueltos o grupo DMSO, lo que indica su invasividad relativa.
in vivo de xenoinjertos
el crecimiento del tumor
comprado del departamento del Laboratorio de Ciencia Animal de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, 5 semanas de edad Balb /c nu /nu hembras fueron puestos en cuarentena durante 1 semana antes de su uso en el estudio. Animales (8 animales por jaula) fueron alojados en microisolat con libre acceso al alimento estándar para roedores y agua bajo condiciones de temperatura controlada (23 ± 2 ° C) a 70% de humedad [33]. Los animales se mantuvieron en un ciclo inverso de 12 h /12 h luz /oscuridad (luces encendidas a las 7:00 AM). Los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Pekín y fueron consistentes con las directrices éticas. células estables GLC82 (1 x 10
7 células por ratón) se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). células GLC82 fueron transfectadas por revueltos shRNA, ANO1 shRNA1 y ANO1 shRNA2, respectivamente, y se seleccionaron por G418 durante dos semanas antes de su uso. células GLC82 se inocularon subcutáneamente en las extremidades anteriores derecha de los ratones desnudos, y en cada grupo se utilizaron ocho animales. En el 7º día después de la inyección, los tamaños de los tumores se midieron cada 2-4 días durante un período de 2 semanas y calculados por (L x W
2) /2 (L y W representan el diámetro longitudinal y transversal más larga, respectivamente ). El punto final de los experimentos fue a los 19 días después de la inyección de las células GLC82 para asegurarse de que la masa tumoral no interfirió significativamente con las funciones normales del cuerpo de los ratones o causan dolor. Los ratones se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (120 mg /kg) combinado con 0,25% de lidocaína antes de que se eliminan los tumores. Se obtuvieron imágenes representativas antes de tumores se pesaron utilizando una balanza electrónica.
El análisis estadístico
El GraphPad Prism 5 se utilizó para analizar los datos. Todos los datos se expresan como media ± s.e.m. Estudiante de
t-test
se utilizó en el análisis de datos de experimentos celulares entre los dos grupos. El ANOVA se aplicó para analizar los niveles de proteína de ANO1 en varias líneas celulares, y para comparar la diferencia en el crecimiento del tumor. Para el análisis de las colecciones de tejidos patológicos humanos, se realizó la prueba de Chi-cuadrado. El valor de
P
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
La sobreexpresión de ANO1 en los tejidos de adenocarcinoma de pulmón humano
Para examinar la nivel de expresión de proteínas ANO1 del canal de cloruro activado por calcio, que utiliza anticuerpos ANO1 para la tinción inmunohistoquímica y se detectó la expresión ANO1 en muestras de tejido patológico de pulmón de 84 pacientes. Como se muestra en la figura 1, la proteína ANO1 fue altamente expresado en el adenocarcinoma de pulmón, mientras que los tejidos de benigna alvéolos adyacentes a carcinoma y carcinoma de células escamosas mostraron tinción negativa de ANO1. El análisis de tinción inmunohistoquímica reveló que la expresión de proteínas ANO1 fue positiva en 34 de 44 (77,3%) muestras de tejido de adenocarcinoma de pulmón humano (Tabla 1). En muestras de tejido de carcinoma de pulmón de células escamosas, 6 de 40 (15%) se tiñeron ANO1 positivo. Estos resultados indican que la proteína ANO1 se sobreexpresa en la tumorigénesis del cáncer de pulmón humano y, en particular, el adenocarcinoma de pulmón.
(A) benigna alvéolos adyacentes a carcinoma que muestra tinción ANO1 negativo. (B) El carcinoma de pulmón de células escamosas que muestra tinción ANO1 negativo. (C) de pulmón tejido de cáncer de adenocarcinoma humano que muestra tinción ANO1 (color marrón) del epitelio neoplásico. La barra de escala indica 50 micras.
La regulación positiva de la expresión ANO1 en líneas celulares de cáncer de pulmón humano
El uso de inmunohistoquímica, nuestro hallazgo inicial reveló que ANO1 se sobreexpresa en el cáncer de pulmón humano tejidos especialmente en adenocarcinoma. Para confirmar el hallazgo inmunohistoquímico y determinar si ANO1 también está regulada positivamente en diferentes tipos patológicos de líneas celulares de cáncer de pulmón, hemos seleccionado y probado 6 líneas de células diferentes que incluyen las células 2BS para la línea de células de pulmón humano normal, GLC82 y Calu 3 células de adenocarcinoma , las células NCI-H520 para el carcinoma de células escamosas, y A549 y células H1299 de tipo no confirmado de cáncer de pulmón (Fig 2). Proteínas extraídas de 2BS, NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 o células H1299 se separaron por electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes y se sondaron con anticuerpo específico ANO1. Como se muestra en el panel inferior de la figura 2, el análisis cuantitativo de ANO1 nivel de expresión de proteína mostró una elevación de 2,8 veces en la NCI-H520, 6,9 veces en GLC82, 6,3 veces en Calu-3, 3,1 veces en A549 y 8.0 -fold en H1299, en comparación con las células normales de pulmón 2BS. El aumento de la GLC82, las células H1299 Calu-3 y fue estadísticamente significativa, pero no para las células A549 NCI-H520 y (P = 0,149 y P = 0,238, respectivamente), aunque hubo una tendencia de aumento en la expresión ANO1. Este resultado es consistente con el análisis inmunohistoquímico de los tejidos de cáncer de pulmón obtenidas de pacientes (Tabla 1), lo que confirma, además, que la expresión ANO1 es mayor en el adenocarcinoma de pulmón GLC 82 células que el carcinoma escamoso células HCI-H520. Se seleccionaron las células GLC82 y NCI-H520 que tenían diferentes niveles de expresión de proteínas ANO1 para futuras investigaciones
Panel superior:. western blot imágenes representativas de la expresión ANO1 en diferentes líneas celulares de pulmón. Panel inferior: estadístico gráfico de barras análisis (n = 3) de ANO1 niveles relativos en NCI-H520, GLC82, Calu-3, A549 y líneas celulares H1299 (en comparación con las células normales 2BS). La expresión de ANO1 se normalizó al nivel de expresión de β-actina. ANO1 se sobreexpresa significativamente en GLC82, Calu-3 y células H1299 líneas. La significación estadística mediante ANOVA se da como *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0.001. Todos los datos se muestran como media ± SEM
La inhibición de la proliferación celular y GLC82 NCI-H520 silenciando ANO1
Para evaluar el papel biológico de ANO1 en la proliferación de células de cáncer de pulmón, hemos utilizado shRNAs a desmontables la expresión de ANO1 en diferentes líneas celulares. La eficacia de tres shRNAs se evaluó mediante Western blot en células de cáncer de pulmón y GLC82 NCI-H520. En comparación con la transfección de shRNA revueltos, ANO1 shRNA1 transfección fue el más efectivo en el silenciamiento de la expresión endógena de las proteínas ANO1 tanto en células GLC82 y NCI-H520 (figura 3a), y por lo tanto se usó para el resto de experimentos.
(a) RNAi desmontables de la expresión de proteínas en células que expresan ANO1 ANO1 se muestra por las imágenes de Western blot. Las proteínas de la membrana de las células extraídas GLC82 y NCI-H520 a los 3 días después de la transfección de diferentes ANO1 shRNAs (shRNA1, shRNA2 y shRNA3) se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo ANO1. ANO1 shRNA1 mostró la inhibición más eficaz de la expresión ANO1, en comparación con los otros dos shRNAs y el shRNA revueltos. la proliferación celular (B) o GLC82 NCI-H520 se evaluó mediante el ensayo de CCK8 basado en la disminución de WST8 extracelular por NADH producido en la mitocondria. El uso de un lector de microplacas, el número de células se cuantificó mediante la medición de la absorbancia a 450 nm. La transfección de ANO1 shRNA1 resultó en una inhibición significativa de GLC82 y NCI-H529 la viabilidad celular de manera dependiente del tiempo en comparación con las células tratadas con shRNA revueltos (n = 6). (C) La proliferación celular de células de carcinoma se evaluó por el ensayo de formación de colonias en cultivo en presencia de ANO1 shRNA1. El análisis cuantitativo del grupo de silenciamiento ANO1 mostró menos génesis colonia, en comparación con el grupo de shRNA revueltos (n = 3). Imágenes representativas se muestran a continuación los gráficos de barras. (D) RNAi de ANO1 inhibe la clonogenicidad de las células GLC82 en agar blando (n = 3). NCI-H520 no pudo formar colonias en agar suave. La significación estadística por el estudiante de
t-test
está indicado como *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0.001. Los datos se expresan como media ± s.e.m.
Para determinar la viabilidad y proliferación, se realizó un ensayo de proliferación celular utilizando células CCK8 GLC82 y NCI-H520. Como se muestra en la figura 3B, silenciando ANO1 ralentizó significativamente el crecimiento de GCL82 adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso células NCI-H520 pulmonares. La proliferación de células GLC82 se inhibió de forma dependiente del tiempo a partir de 89,1% en el día 2, 81,6% en el día 3 a 75,0% en el día 4. La proliferación de células NCI-H520 también se inhibió de 89,0% en el día 2, 75,3% en el día 3 a la de 71.7% en el día 4. a fin de confirmar estos resultados, se utilizaron dos ensayos de formación de colonias, tanto en placa de cultivo y agar blando. Como se muestra en la figura 3C, silenciar ANO1 resultó en una disminución de la formación de colonias 36,2% en GLC82 células y la formación de colonias 30,7% en las células NCI-H520, comparado con el control shRNA revueltos. Para confirmar aún más el efecto de silenciar ANO1 sobre la proliferación, se utilizó el ensayo de formación de colonias en agar blando que controla el crecimiento celular independiente de anclaje. células GLC82 podrían formar colonias en agar blando en treinta días, pero las células NCI-H520 fallado para formar colonias. Como se muestra en la figura 3D, la proliferación de las células tratadas con GLC82 ANO1 shRNA fue significativamente inhibido en comparación con el grupo de shRNA revueltos. Estos resultados indican que el silenciamiento ANO1 endógeno puede inhibir la proliferación de células de cáncer de pulmón y GLC82 NCI-H520.
Reducción de la migración celular GLC82 y NCI-H520 y la invasión silenciando ANO1
Para investigar la migración de las células de cáncer de pulmón, se utilizó el ensayo de cicatrización de heridas que evalúa el cierre de heridas. Dos días después de la transfección, se sembraron las células en una placa de seis pocillos hasta 90% de confluencia antes de hambre durante 24 horas. La capa de células fue cuidadosamente herido por puntas estériles, se incubaron con medio libre de suero. Como se muestra en la figura 4A y 4B, la transfección de células de cáncer de pulmón GLC82 con ANO1 shRNA inhibe la herida llenado de 66,8% a las 24 h, 67,5% a las 48 h y 74,3% a las 72 h, en comparación con shRNA revueltos. En las células de cáncer de pulmón NCI-H520 (figura 4C y 4D), la curación de heridas en el grupo knockdown ANO1 era sólo de 29,1% a las 24 h y 27,6% a las 48 h en comparación con el grupo de control shRNA revueltos. En las 48 h, la curación de la herida era casi completa en el grupo de control shRNA revueltos. Estos resultados muestran que endógeno ANO1 promueve la migración de células tumorales, y silenciar ANO1 inhibe la migración de células de cáncer de pulmón.
Migración de GLC82 y las células NCI-H520 transfectadas con ANO1 shRNA1 o revueltos shRNA se evaluó mediante el ensayo de curación de heridas . Dos días después de la transfección, se sembraron las células en una placa de seis pocillos hasta 90% de confluencia y luego en ayunas durante 24 horas. La capa de células fue cuidadosamente herido por puntas estériles, y se incubaron con medio libre de suero. (A) Las imágenes de campo claro de la herida en puntos de tiempo 0 h, 24 h, 48 hy 72 h (GLC82) se muestran a baja magnificación. (B) Cuantificación del cambio en la curación de heridas de las células GLC82 se muestra en el gráfico de línea y normalizada a grupo shRNA revueltos. (C) Fotos de NCI-H520 experimento de curación de heridas a las 0 h, se presentaron 24 hy 48 h. (D) Gráfico de líneas de células NCI-H520 que muestran la migración de células que fue inhibida por ANO1 shRNA1 desmontables (n = 3). La significación estadística (Estudiante de
t-test
) está indicado como *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0.001. Se muestran todos los datos como media ± s.e.m.
La característica más mortal de cáncer en el cáncer de pulmón es el potencial de invasión y metástasis. Para analizar si el silenciamiento ANO1 también afecta a la invasión de células, se utilizó el ensayo transwell. Dos días después de la transfección con ANO1 shRNA1 o revueltos shRNA, GLC82 y las células NCI-H520 se mantuvieron en ayunas durante 24 horas antes de la incubación adicional en la cámara superior. Después de 48 horas de incubación de las células NCI-H520 o 72 horas de incubación de la GLC82 células, las células invasoras en la cámara inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con DAPI. Como se muestra en la figura 5, el potencial de invasión de las células tumorales se suprime de forma espectacular por ANO1 caída. El área de ANO1 silenciada GLC82 células que pasaron por la cámara superior fue de sólo el 4,0% del grupo shRNA revueltos (Figura 5A y 5B). Como se muestra en la figura 5C y 5D, el área relativa de transwell ANO1 caída en células NCI-H520 fue 12,2%, en comparación con las células transfectadas por shRNA revueltos. Estos resultados indican que el silenciamiento ANO1 inhibe la migración y la invasión de cáncer de pulmón y GLC82 células NCI-H520.
Células se mueren de inanición
GLC82 y NCI-H520 durante 24 horas antes incubados en la cámara superior con filtros Transwell Matrigel. Después de 48 horas (NCI-H520) o 72 horas (GLC82), células invasoras en la cámara inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con DAPI. (A) Las imágenes representan campos microscópicos de las células invasoras GLC82. (B) La invasividad de las células que expresan ANO1 shRNA 1 o revueltos shRNA se cuantificó por área manchada de invadir GLC82 células. El área de invasión se normaliza a grupo shRNA revueltos. (C) fotos representativas de las células NCI-H520 invadido a través de filtros Transwell Matrigel. (D) de chat Bar de las células NCI-H520 que muestran la disminución de la invasión de células por ANO1 shRNA1 desmontables (n = 3). La significación estadística por el estudiante de
t-test
está indicado como *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0.001. Los datos se expresan como media ± SEM
Supresión del crecimiento de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos por ANO1 caída
Para investigar el efecto de ANO1 caída en el crecimiento de xenoinjertos de tumores
in vivo
, tres grupos de células GLC82 se transfectaron individualmente con ANO1 shRNA1, ANO1 shRNA2 y revueltos shRNAs, y su eficiencia desmontables se confirmó por Western blot antes de la inyección para la formación de xenoinjerto de tumor en ratones (figura 6A). Hemos inyectado 10
7 GLC82 células por ratón en las extremidades anteriores derecha de 5 semanas de edad ratones desnudos en cuatro grupos para la formación de un xenoinjerto de tumor. El tamaño de los tumores se midió por primera vez 7 días después de la inyección (día 0). Como se muestra en la figura 6B y 6C, ANO1 silenciamiento resultó en una reducción significativa del crecimiento tumoral por 68,8% en el grupo shRNA1 y 42,1% en el grupo shRNA2, respectivamente, en comparación con el grupo revueltos en la observación de día 12. En el día 12, los tumores se retiraron de los ratones y ponderados. Se observó una notable reducción del peso del tumor en los grupos ANO1 shRNA (figura 6D y 6E). En comparación con el control mezclado shRNA, el peso medio de los tumores de los grupos ANO1 shRNA1 y shRNA2 estaba a punto de 38,7% y 70,1%, respectivamente (Fig 6D y 6E). Además tinción inmunohistoquímica de ANO1 en tumor de xenoinjerto confirmó que la reducción de la proteína ANO1 niveles de expresión era coherente con el volumen de los tumores en los grupos tratados por ANO1 shRNAs con diferente potencia y en el grupo control (Fig 6F y 6G). Estos resultados indican que el silenciamiento ANO1 no sólo inhibe la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón, pero también suprime significativamente el crecimiento del tumor.
Las células normales o células GLC82 GLC82 estables que expresan ANO1 shRNA 1, 2 y ANO1 shRNA revueltos shRNA se inocularon hipodérmicamente en las extremidades anteriores derecha de 5 semanas de edad ratones desnudos hembra (1x107 células por ratón). (A) Análisis de la eficiencia occidental caída de tipo salvaje GLC82 células y células GLC82 estables que expresan shRNA revueltos, ANO1 shRNA 1 y 2. ANO1 shRNA (B) imagen representativa de ratones desnudos que llevan GLC82 tumores implantados en cuatro grupos: el grupo blanco (n = 7), revueltos grupo shRNA (n = 8), grupo ANO1 shRNA1 (n = 8) y ANO1 shRNA2 grupo (n = 8). (C) El tamaño del tumor se midió cada 2-4 días por Nonio durante su desarrollo desde el día 7 después de la inyección. El crecimiento de tumores que expresan ANO1 shRNA1 y ANO1 shRNA2 fue significativamente inhibido de una manera dependiente del tiempo, en comparación con el grupo de shRNA revueltos. (D) la imagen Representante de tumores recogidos de los ratones a los 12 días de la generación. (E) Los tumores se pesaron y se analizaron después de la eliminación quirúrgica. En comparación con los tumores shRNA revueltos, tumores ANO1 shRNAs eran más ligeras. La significación estadística (ANOVA) se muestra como *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01 y ***
p Hotel & lt; 0.001. Los datos se expresan como media ± s.e.m. (F) Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica de la expresión ANO1 en los tejidos tumorales de xenoinjerto. (G) Análisis de la expresión ANO1 en los tejidos tumorales de xenoinjertos se llevó a cabo al anotar de 0 a 3 según la intensidad y el área de la tinción.
Discusión
El objetivo de este estudio fue investigar si Ca
2 + activados por Cl
- canal (CACC) ANO1 o TMEM16A, identificado originalmente de las células epiteliales de las vías respiratorias, está implicado en la progresión del carcinoma de pulmón no de células pequeñas, que es típico de pulmón epitelial cáncer.
en este estudio, hemos demostrado que ANO1 es altamente sobreexpresado en varias líneas celulares de cáncer de pulmón y muestras de tejido de adenocarcinoma humano. El silenciamiento ANO1 suprime la proliferación celular, la migración y la invasión, y el crecimiento de tumores implantados.