Extracto
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) está entre el más mortal de los cánceres humanos, debido a su diagnóstico tardío, así como su intensa resistencia a agentes terapéuticos actualmente disponibles. Para identificar los mecanismos de por qué PDAC son refractarios a la quimioterapia citotóxica ADN perjudiciales y la radiación, se realizó un interrogatorio global de la respuesta al daño del ADN del PDAC. Encontramos que las células PDAC generalmente albergan altos niveles de daño en el ADN espontánea. La inhibición de extremos no homólogos (NHEJ) reparar ya sea farmacológicamente o por RNAi dio lugar a una mayor acumulación de daño del ADN, la inhibición del crecimiento, y en última instancia la apoptosis, incluso en ausencia de agentes que dañan el ADN exógeno. En respuesta a la radiación, las células PDAC se basan en la vía NHEJ de reparación rápida de ADN de doble filamento se rompe. Mecánicamente, cuando NHEJ se inhibe hay un aumento compensatorio en la recombinación homóloga (HR). A pesar de esta regulación al alza de recursos humanos, persiste y dañan las células de ADN son significativamente más sensibles a la radiación. En conjunto, estos hallazgos apoyan la incorporación de la inhibición NHEJ en enfoques terapéuticos PDAC, ya sea solo o en combinación con terapias que daña el ADN, como la radiación
Visto:. Li YH, Wang X, Pan Y, Lee DH, Chowdhury D, Kimmelman AC (2012) inhibición de extremos no homólogos Reparación de unión perjudica el crecimiento de cáncer de páncreas y mejora la respuesta de la radiación. PLoS ONE 7 (6): e39588. doi: 10.1371 /journal.pone.0039588
Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: Enero 16, 2012; Aceptado: 25-may de 2012; Publicado: 18 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. ACK es apoyado por el Instituto Nacional del cáncer de subvención R01CA157490, Premio Académico Kimmel, y el Premio desarrollo de la carrera AACR-PanCAN. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. ACK es un consultor para la Forma Terapéutica y de Dainippon Pharma. Ha recibido fondos de investigación de la terapéutica Karyopharm para un proyecto sin relación y ha recibido unos honorarios hablando de Pfizer. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera nuestra adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) sigue siendo el cuarto líder causa de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos [1], y se caracteriza por una intensa resistencia a la quimioterapia y la radiación ionizante (IR). Debido a esto, la mayoría de los pacientes va a sucumbir a su enfermedad en menos de un año y nuevos enfoques terapéuticos están claramente necesario. La inestabilidad genómica es una de las características del cáncer [2] y en consonancia con este y otros han demostrado que los cánceres de páncreas muestran niveles extremadamente altos de alteraciones genómicas [3]. Además, los cánceres de páncreas son profundamente resistente a terapias de ADN perjudiciales tales como la quimioterapia citotóxica y la radiación [4]. Sin embargo, la importancia biológica de la inestabilidad genómica en esta enfermedad y cómo esto puede afectar a la respuesta a que daña el ADN terapias es relativamente sin explorar.
roturas de doble cadena (DSBs), inducidas por la radiación u otros agentes que dañan el ADN, se cree siendo las lesiones del ADN más peligrosos que amenazan la supervivencia celular. En respuesta a la radiación ionizante, DSBs son detectados por el Mre11-Rad50-Nbs1 complejo (complejo MRN) y complejos /Ku80 Ku70 que activan rápidamente ataxia telangiectasia mutada (ATM) y el ADN-PK, respectivamente [5]. La activación de estas quinasas induce una serie de eventos celulares, incluyendo la fosforilación de proteínas de control del ciclo celular y la iniciación del proceso de reparación de ADN. Histona H2AX, un importante sustrato de ATM y el ADN-PK, se fosforila en serina 139 (referido como γH2AX), que forma focos de los sitios OSD asociados con otros factores de reparación [6].
Existen
Dos vías principales para reparar DSB recombinación -homologous (HR) y extremos no homólogos a participar (NHEJ) [7], [8]. reparación HR-dirigida requiere un cromosoma homólogo o una cromátida hermana como una plantilla para reparar el ADN con alta fidelidad, por lo que se produce principalmente en las fases S y G2- del ciclo celular cuando la plantilla está disponible. En contraste con los recursos humanos, la reparación NHEJ OSD por la ligadura de dos extremos de ADN de la transformación, a fin de ADN. El procesamiento final a menudo conduce a la pérdida de nucleótidos y hace NHEJ propenso a errores [9]. NHEJ es activo durante todo el ciclo celular. Por lo tanto, la etapa del ciclo celular y la naturaleza de los extremos de ADN son dos determinantes de opciones de reparación entre HR y NHEJ [7], [10]. Además, la actividad DNA-PK en sí se ha implicado en la inhibición de la HR [11], [12]. Es importante destacar que, las células cancerosas a menudo muestran anormalidades en la respuesta al daño de ADN y defectos en la reparación del ADN que puede correlacionarse con la expresión alterada de las proteínas de reparación. Por ejemplo, una mayor expresión de la NHEJ proteínas, DNA-PK y Ku70 /80 ha sido reportado en líneas celulares de cáncer [13], [14], [15], [16] Sin embargo, la respuesta al daño del ADN y la reparación del ADN en PDAC las células se mantiene relativamente sin explorar.
a continuación se determinó la importancia de la reparación del ADN en PDAC biología y encontramos que las células PDAC albergan niveles elevados de daño en el ADN basal. La inhibición de la NHEJ en el aumento de daño en el ADN y en última instancia disminución de la proliferación. En respuesta a la inhibición NHEJ, recursos humanos está regulada positivamente pero las células son incapaces de reparar el daño del ADN de manera eficiente en respuesta a la radiación. Esto da como resultado un aumento de la sensibilidad a la radiación como se evidencia por una disminución de la supervivencia clonogénico. Nuestros datos implican la inhibición NHEJ como un enfoque terapéutico potencial en PDAC.
Resultados
daños en el ADN basal en PDAC
En un esfuerzo para entender por qué PDAC son profundamente resistente a daños en el ADN terapias, tales como quimioterapia citotóxica y terapia de radiación, se realizó un esfuerzo para entender la respuesta al daño del ADN y la reparación del ADN en estos tumores. Como paso inicial, los niveles basales de daño en el ADN se examinaron en una colección de 18 líneas celulares PDAC, así como un no transformada inmortalizada línea ductal pancreático humano de células (HPDE) [17] como control. Se realizó análisis de Western blot para γH2AX, un marcador ampliamente utilizado para el daño del ADN, en particular las roturas de doble cadena de ADN (DSBs) [18], [19]. Sorprendentemente, más de la mitad de las líneas celulares PDAC mostró niveles elevados de γH2AX (Figura 1A y 1B) en comparación con HDPE. Para confirmar que los niveles elevados de γH2AX no eran simplemente debido al aumento de los niveles de las histonas totales, que normalizó los niveles de γH2AX a H2AX total en la líneas de células seleccionados (datos no mostrados) y se demostró que estas líneas continuaron han elevado γH2AX comparación con HPDE Células. Como prueba adicional de los daños del ADN elevada en PDAC, γH2AX inmunofluorescencia se llevó a cabo en líneas celulares de PDAC representativos. Estos análisis fueron en gran medida coherente con los datos de transferencia Western, con focos en líneas PDAC típicamente mayor que en HPDE (Figura 1C y 1D). Para medir directamente el daño del ADN, se realizaron ensayos de cometas neutrales para evaluar la cantidad de roturas de doble hebra en condiciones basales. Una vez más consistente con los datos γH2AX, cuatro de las cinco líneas celulares ensayadas PDAC demostró estadísticamente más altos momentos de cola que en HPDE (Figura 1E), lo que indica un aumento de DSBs. Tomados en conjunto, estos datos indican que las células PDAC menudo poseen niveles basales elevados de daños en el ADN que puede resultar en la activación de una respuesta de daño del ADN.
(A) análisis de transferencia de Western de γH2AX en HPDE y 18 líneas celulares PDAC. Las muestras de 8988T y Panc1 irradiaron a 4Gy se utilizaron como controles positivos y actina sirvió como control de carga. Los experimentos se realizaron al menos tres veces. (B) Cuantificación de la expresión γH2AX por densitometría se normalizó a la expresión de actina y se presentan como relación con HPDE. Los datos se muestran a partir de tres experimentos independientes con barras de error representan desviaciones estándar. (C) Inmunofluorescencia para basales γH2AX focos en tres líneas celulares representativas (HDPE, 8988T y HPAC). Verde: γH2AX; Azul: DAPI (núcleo). La barra de escala es igual a 10 micras. La cuantificación se realizó en (D) y se muestra como porcentaje de células con más de 5 focos. Los experimentos se realizaron tres veces y se calcularon los valores medios. Las barras de error representan la desviación estándar de tres experimentos individuales. (E) Neutral ensayo cometa se realizó para evaluar directamente el ADN de doble filamento se rompe y los datos expresados como momento de la cola (Tail momento = longitud de la cola x% del ADN en la cola). Para todos los paneles, asteriscos muestran un aumento estadísticamente significativo en comparación con el HDPE por la prueba t (p = 0.05).
vías de reparación del ADN en PDAC
Las dos principales vías de reparación del ADN por el doble capítulo romper la reparación son la recombinación homóloga (HR) y la unión de los extremos de reparación no homóloga. reparación HR requiere un cromosoma homólogo o una cromátida hermana como una plantilla y principalmente tiene lugar en S o fase G2 del ciclo celular para reparar precisamente dañado ADN [7]. NHEJ, sin embargo, la reparación de ADN por ligación directamente el ADN termina después del procesamiento final, que a menudo introduce pérdida de nucleótidos y hace NHEJ propenso a errores [9]. Dados los niveles basales elevados de daño del ADN en PDAC, se evaluó la aptitud de estas células para recursos humanos y NHEJ. Para medir la cantidad relativa de recursos humanos, se realizó inmunofluorescencia para Rad51, una proteína crítica de recursos humanos que se une a salientes de ADN de cadena sencilla y cataliza el proceso de intercambio cadena de ADN. La formación de focos Rad51 es un indicador sensible y específico de HR [20], [21]. Los niveles basales de focos Rad51 eran bajos en las células 8988T PDAC, así como en las células HPDE (Fig 2A). Mientras que las células HPDE mostraron un marcado aumento en Rad51 focos con dosis crecientes de radiación, las células 8988T mostraron un incremento significativamente menor en focos incluso a 5 Gy de radiación (Fig 2A). Teniendo en cuenta los niveles mínimos de recursos humanos se ve en esta línea PDAC, especuló que estas células pueden depender principalmente de NHEJ de reparación. Para evaluar NHEJ, se utilizó un ensayo bien caracterizado basada en luciferasa plásmido de reparación [22], [23]. En resumen, un plásmido cortado luciferasa (PGL2) se transfectaron en células y la reparación a través de NHEJ se mide por la actividad luciferasa relativa. Ambas líneas 8988T y Panc1 PDAC habilidad demostrada en NHEJ como se muestra en la Figura 2B.
(A) de recursos humanos en respuesta a dosis crecientes de radiación (0, 2, y 5 Gy) se midió mediante la formación de focos Rad51 y expresaron como focos promedio por célula. Los focos se incrementan en las células HPDE con dosis crecientes de radiación, mientras que sólo se cambian mínimamente en las células 8988T. Los datos son de dos experimentos independientes realizados con cubreobjetos replicados con barras de error representan desviaciones estándar. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa mediante la prueba t (p = 0.05). Imágenes representativas se muestran a continuación. (B) NHEJ mide por un ensayo de plásmido de luciferasa de reparación. Se normalizaron los datos para la eficiencia de la transfección y luego a la luciferasa sin cortar. Tanto Panc1 y células 8988T muestran la reparación NHEJ apreciable. Desmontables de Ku80 disminuyó notablemente NHEJ en células Panc1. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.
DNA-PK se requiere para el crecimiento PDAC
Teniendo en cuenta los resultados de los ensayos de la reparación de DSB, próxima pregunta si las células se basan en PDAC NHEJ para la proliferación y el crecimiento normal. Nos centramos en la inhibición de la DNA-PK, que consiste en la proteína heterodimérica Ku70 /Ku80 y la subunidad catalítica, DNAPKcs, y es esencial para NHEJ [24]. El uso de shRNAs, suprimimos la expresión de las subunidades reguladoras de DNA-PK, Ku70 y Ku80 en células 8988T. Tanto shRNAs produjo una robusta disminución de la expresión de Ku70 o Ku80 en células 8988T, que fue detectado por qRT-PCR para Ku70 y Ku80 y por Western blot para Ku70 (Figura 3A). El agotamiento de Ku70 o Ku80 inhibió significativamente el crecimiento de anclaje independiente de 8988T tal como se evaluó mediante ensayos de softagar, así como la proliferación de ensayo de curva de crecimiento (Figura 3B y 3C). Represión de Ku70 o Ku80 también disminuyó la tasa de crecimiento de dos líneas adicionales de células PDAC, HupT3 y BxPC3 (Figura 3C). En contraste con PDAC, el agotamiento de Ku70 o Ku80 en HPDE, MCF7 (una línea celular de cáncer de mama) o H460 (una línea celular de cáncer de pulmón) mostraron efectos más modestos sobre la proliferación (Figura 3C). Estos datos sugieren que las células requieren PDAC Ku70, Ku80 para el crecimiento. A fin de analizar el requisito de NHEJ para mantener el crecimiento PDAC, un inhibidor farmacológico DNA-PK, NU7026 [25], [26], se utilizó para investigar la participación de DNA-PK en el crecimiento del PDAC. tratamiento NU7026 disminuyó significativamente el crecimiento independiente de anclaje de células PDAC, mientras que el crecimiento de H460 y MCF7 no se vio afectada incluso a las dosis más altas (20 M) (Figura 4A). Además, se determinó la sensibilidad de una colección de líneas PDAC a NU7026 mediante la determinación de las CI50 (Fig 4C). Más de la mitad de las líneas fueron sensibles a la inhibición de ADN-PK. NU7026 también disminuyó la supervivencia de las células clonogénico 8988T PDAC (Figura 4B). En conjunto, los datos apoyan que las células PDAC dependen de NHEJ de reparación del ADN para el crecimiento en condiciones basales.
(A) La supresión de la expresión de Ku70 o Ku80 en células 8988T por shRNAs detectado por cuantitativa en tiempo real PCR (izquierda) y western blot (derecha). (B) Panel superior: imágenes representativas de la formación de colonias en agar blando de las células infectadas 8988T, ya sea con un control shRNA a GFP o dos shRNAs diferentes a Ku70 o Ku80, respectivamente. Panel inferior: la cuantificación de la formación de colonias en agar blando de las células 8988T relativos a shGFP células infectadas. Los resultados son las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan desviaciones estándar. Dos asteriscos indican significancia estadística:
P Hotel & lt; 0,01 mediante la prueba t se realizaron ensayos de curva (C) Crecimiento para evaluar el efecto de la inhibición de la NHEJ por Ku70 y Ku80 caída en el crecimiento del PDAC. Tenga en cuenta la supresión del crecimiento robusto en líneas celulares PDAC (8988T, HupT3, BxPC3) y apenas alteran otras líneas celulares (MCF7, H460 y HPDE).
(A) ensayos de agar blando de 8988T células PDAC y líneas de células tumorales de otras histologías (H460 y MCF7) con dosis crecientes de la NU7026 inhibidor de DNA-PK demuestra la inhibición dependiente de la dosis de crecimiento independiente de anclaje en las células PDAC pero sólo efectos mínimos en las otras líneas celulares ensayadas. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa mediante la prueba t (p = 0.05). (B) la supervivencia de las células Clonigénicas 8988T tratados con NU7026 que muestra disminución del crecimiento clonogénico. (C) IC50 a NU7026 a través de un panel más grande de líneas celulares PDAC muestran que la mayoría son sensibles a la inhibición de ADN-PK. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. (D) NU7026 tratamiento de las células 8988T inducida por daño en el ADN y la apoptosis medida por γH2AX y escindidos de caspasa-3, respectivamente. células 8988T se trataron con NU7026 o DMSO como un control por un día o siete días seguido de análisis de transferencia Western. El aumento de daño en el ADN fue vista en el punto de tiempo temprano (Día 1) con el aumento de daño y en última instancia, la apoptosis se ve en día 7. (E) células HPDE en comparación muestran un pequeño aumento en la expresión γH2AX, pero aumento muy mínima en la caspasa-3 escindido.
Un posible resultado, cuando el ADN dañado se quede sin reparar es que las células finalmente someterse a la apoptosis [27], [28]. Para evaluar las consecuencias celulares de la inhibición de la DNA-PK en células PDAC, nos fijamos en los marcadores de daño en el ADN y la apoptosis después de un corto (1 día) o largo plazo (7 días) de tratamiento con NU7026. De hecho, encontramos que la inhibición de ADN-PK por un día causó daño en el ADN adicional analizado por γH2AX. Sin embargo, en el punto de tiempo de siete días aumentó escindido expresión de caspasa-3 se hizo evidente que indica que la apoptosis puede ser elevado en NU7026 células tratadas pero no en DMSO tratada células de control (Figura 4D). En contraste, el tratamiento de las células HPDE con NU7026 mostraron aumento de γH2AX con muy mínima de la caspasa-3 de expresión escindido (Figura 4E). Por lo tanto, la inhibición de la vía NHEJ conduce a una acumulación adicional de DSB, la activación de punto de control y, finalmente, la apoptosis en células PDAC.
reparación de DSB en PDAC después de IR depende de la DNA-PK
Para más explorar la respuesta de las células PDAC al daño del ADN, se midió la cinética de reparación de tres líneas celulares PDAC siguiente IR mediante el control de γH2AX focos en 30 min, 2, 6 y 12 horas después de IR con una dosis clínicamente relevante de 2Gy. γH2AX focos alcanzó un máximo de alrededor de 30 minutos después de IR. A las 12 h después de IR, el número de focos γH2AX en las tres células PDAC volvió al nivel basal. Hemos encontrado además que la reparación de las tres líneas celulares PDAC se atenuó de manera significativa por la inhibición de la DNA-PK, lo que indica que la reparación de DSBs en células PDAC depende de NHEJ (Figura 5A) altamente. Curiosamente, la inhibición de la DNA-PK sólo tuvo un efecto mínimo en la reparación de las células HPDE (Fig 5A). A continuación examinó la forma en la reparación de recursos humanos se ha visto afectado por la inhibición de NHEJ. Como se indica anteriormente, HR fue menor en las células 8988T incluso después de IR en comparación con el HDPE. Sin embargo, horas aumentó significativamente en presencia de NU7026 en las células 8988T después de IR (Figura 5B). A pesar de la aparente aumento compensatorio de la FC en células 8988T, donde se inhibe NHEJ, el número de focos γH2AX sigue siendo alta (Figura 5A), lo que indica que esto todavía no es suficiente para la reparación completa.
(A) la cinética de reparación de tres líneas celulares PDAC (8988T, Panc1 y BxPC3) se midieron mediante tinción γH2AX en diversos puntos temporales después de la radiación. Los datos se muestran como focos número por célula, normalizado a la 30 min punto de tiempo cuando la formación de focos fue máxima. Cada línea celular fue tratado con NU7026 (20 mM) o DMSO. En cada línea de la resolución de los focos se retrasó considerablemente con el tratamiento NU7026. Se realizaron experimentos similares en las células HPDE (panel derecho). Tenga en cuenta que la NU7026 no atenúa resolución focos en estas células. (B) HR se incrementa como respuesta compensatoria a la inhibición NHEJ en células PDAC. la formación de focos Rad51 se incrementa notablemente cuando la actividad de DNA-PK es inhibida por NU7026. Panel izquierdo: focos Rad51 en verde y el núcleo en azul se muestra mediante tinción con DAPI. Panel derecho: cuantificación de focos por célula en las condiciones indicadas. Se muestran los datos de dos experimentos independientes con barras de error representan las desviaciones estándar de la media.
inhibición NHEJ sensibiliza PDAC a IR
La inhibición de la NHEJ aumenta el daño del ADN que conduce a una disminución del crecimiento y la apoptosis en las células PDAC, así como los resultados en la presencia prolongada de focos daño del ADN después de la radiación. Por lo tanto, se esperaría que la inhibición NHEJ para mejorar la eficacia de la radiación. Tanto 8988T y las células Panc1 mostraron una mayor sensibilidad a IR cuando fueron tratados con NU7026 como se muestra por una disminución de la supervivencia clonogénico (Figura 6A). Del mismo modo, las células 8988T y Panc1 con Ku70 o Ku80 desmontables también eran más sensibles a IR (Figura 6B). Consistente con la disminución de la supervivencia de células clonogénicas, un aumento de la fracción de células 8988T fueron detenidos en la fase G2 /M del ciclo celular cuando las células se trataron con NU7026 y IR (71,88% frente a 27,26% en el control irradiado) en comparación con control tratado o células irradiadas (Figura 6C).
(A) inhibición de la DNA-PK con NU7026 radiosensitizes 8988T y Panc1. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos por triplicado y se trataron con DMSO o NU7026 a 20 M del día siguiente. Las células fueron sometidas a IR después del tratamiento durante la noche con DMSO o NU7026. Después de 9 días, se fijaron las células, se tiñeron y se contaron las colonias. La fracción superviviente se calculó utilizando la eficiencia de plaqueo. (B) La supresión de Ku70 o Ku80 radiosensitized líneas celulares PDAC, 8988T y Panc1. células 8988T o Panc1 se infectaron con shKu70 o shKu80 y shGFP se utilizó como control. Los ensayos se realizaron como en (A). (C) la distribución del ciclo celular típico de 8988T en tratamientos indicados. células 8988T se trataron con NU7026 o DMSO durante dos días seguidos por IR en 2Gy y se tiñeron con yoduro de propidio 24 horas más tarde. ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo. Los experimentos se repitieron tres veces y se muestra es el resultado representativo.
Discusión
cánceres pancreáticos son profundamente resistentes a los enfoques terapéuticos actuales, incluyendo aquellos que trabajan a través de la inducción de daño en el ADN, tales como diversos citotóxica quimioterapias y radiaciones. Por lo tanto, la comprensión de la respuesta de estos tumores al daño del ADN puede proporcionar ideas terapéuticas clave. Nuestro trabajo demuestra que las líneas celulares de cáncer pancreático a menudo tienen niveles elevados de daño en el ADN basal en ausencia de agentes que dañan el exógenas. Mientras que la etiología exacta de los daños de ADN basal aumentado no se conoce, es tentador especular que la constante de la inestabilidad genómica que estos tumores soportar [3] puede ser parcialmente responsable. Por ejemplo, durante el proceso de amplificación genómica, los ciclos de rotura-fusión-puente se producen lo que resulta en la formación de DSBs transitorios continuas [29]. Estos y otros sucesos genómicos visto con frecuencia en PDAC, tales como translocaciones cromosómicas, pueden promover un estado constante de daño en el ADN.
Nuestros resultados también sugieren que NHEJ es la principal vía responsable de la reparación de DSB en células de cáncer de páncreas como la inhibición de NHEJ suprime la cinética de reparación rápida. En conjunto, la evidencia sugiere un escenario donde estos tumores han desarrollado una dependencia de NHEJ de sobrevivir a la inestabilidad genómica continua y el daño en el ADN resultante que sobreviene. La selección de la vía de reparación de DSB y la relación entre los recursos humanos y NHEJ son de gran interés científico y al mismo tiempo las bases moleculares exactos de selección vía se están elaborando, es probable que al menos parte de la opción de reparación es dictado por el ciclo celular , como HR sólo puede funcionar en S /G2 /M [7]. Se demuestra que la HR es bastante baja en las células PDAC, incluso en respuesta a la IR. Sin embargo, hay un aumento compensatorio de la FC cuando se inhibe la NHEJ, pero, no es suficiente para evitar que los niveles genotóxicos de los daños en el ADN.
Además, nuestros resultados también están en consonancia con los recientes enfoques terapéuticos en los genes BRCA1 y 2 tumores mutantes utilizando inhibidores de PARP. Este "letalidad sintética", donde se deteriora tumores con una sola vía de reparación del ADN, tales como recursos humanos son sensibles a la inhibición de una vía de reparación segundo (por ejemplo BER), ha recibido mucha atención [30], [31], [32]. En línea con el concepto de la inhibición de las vías de reparación del ADN como un enfoque terapéutico, PDAC muestran una sensibilidad a los inhibidores de NHEJ. Una posible explicación es que el daño en el ADN basal elevada sirve para saturar la reparación de DSB que los hace susceptibles a la inhibición de NHEJ u otras vías de reparación del ADN.
Por último, la inhibición de NHEJ muestra una fuerte sinergia con la radiación. Esto no es inesperado desde un punto de vista mecanicista, pero puede tener implicaciones clínicas en el tratamiento de la enfermedad. Si bien la enfermedad a distancia es una causa importante de mortalidad en el cáncer de páncreas, los datos recientes muestran que hasta un 30% de muertes PDAC son directamente atribuibles a la progresión local [33]. Desafortunadamente, la cirugía no es posible para la mayoría de estos pacientes y la única otra terapia local disponible, la radiación, es ineficaz en la mayoría de los casos, incluso cuando se combina con la quimioterapia [34]. Por lo tanto, el aumento de la sensibilidad de estos tumores a la radiación podría tener un impacto transformador en esta población de pacientes. De hecho, el desarrollo de inhibidores de proteínas de reparación del ADN se produce rápidamente y muchos están moviendo en la clínica como componentes del tratamiento del cáncer [35]. Los conocimientos mecánicos identificados en este estudio, proporcionan un fundamento molecular de peso para explorar el desarrollo de tales agentes para el tratamiento del cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y reactivos
las líneas de células tumorales humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection o de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares. Se obtuvieron células de HPDE M.S. Tsao. [17]. Las células se cultivaron en DMEM o RPMI suplementado con 10% de la pantorrilla cósmica suero, antibióticos y glutamina. Las células fueron cultivadas en HPDE (KSF) medio de queratinocitos libre de suero complementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico (Gibco). NU7026 (Sigma) se utilizó en 20 mM a menos que se indique lo contrario.
PCR en tiempo real
El RNA se aisló con Trizol (Invitrogen), tratado con DNasa y transcripción inversa a cDNA utilizando MMLV alta Rendimiento de la transcriptasa inversa (Epicentri) siguiendo las instrucciones del fabricante. PCR se llevó a cabo utilizando el reactivo SYBR Green detección (Applied Biosystems) en un Bio-Rad Chromo4 termociclador. La amplificación por PCR se realizó a 95 ° C durante 2 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 15 seg y 72 ° C durante 30 seg. Por último una curva de fusión se genera a partir de 55 ° C a 95 ° C, leer cada 0,5 ° C. Los cebadores fueron los siguientes:. Ku70, hacia adelante 5'AGTCATATTACAAAACCGAGGGC 3 'y revertir 5'CCTTGGAGGCATCAACCAAAAA -3' Ku80 hacia adelante 5'CCTTTCTGGTGGGGATCAGTA 3 'y revertir 5'ACCTGGTTGGATTTTGCTTTCAA -3'
IC50 ensayo
las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron mediante dilución en serie de NU7026 al día siguiente durante 72 h. La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo Cell-Titer-Glow (Promega, G7570) según las instrucciones del fabricante. La IC50 se calculó utilizando un modelo sigmoidal usando BioDataFit 1.
transfección shRNA
plásmidos que contienen pLKO.1 shRNA secuencia de Ku70 y Ku80 se obtuvieron de la RNAi Consortium (secuencias disponibles bajo petición). Lentivirus que contiene Ku70, Ku80 y de control GFP shRNAs fueron producidos en células de empaquetamiento HEK293T y se utilizaron para infectar las células en presencia de 8 mg /ml de polibreno (Sigma H9268). Tras la selección de puromicina durante 2-3 días, las células se volvieron a medio habitual para los experimentos.
La proliferación celular ensayo
Las células infectadas por lentivirus que contiene shGFP, shKu70 y shKu80 se sembraron por triplicado en 24- así las placas en el 2500-5000 células por pocillo. Las células se fijaron en formalina al 10% y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en el día como se indica. Colorante se extrajo con ácido acético al 10% y la proliferación se determinó midiendo la DO a 595 nm. proliferación relativa se calculó por la normalización a día 0.
ensayo de agar blando
2 ml de medio que contenía 1% de agarosa (Nobel Agar, BD 214230) se colocó en placas de 6 pocillos como capa inferior . 2 ml de suspensión de células con 5000 células en medio que contiene 0,5% de agarosa se colocó en la parte superior de la capa inferior solidificó. Después de 9-14 días, las colonias se tiñeron con violeta de p-yodonitrotetrazolio (Sigma, 18377), se contaron y se fotografiaron. Si es necesario, se añadió NU7026 tanto a la parte inferior y la parte superior de agar antes de ser colocados en las placas. se añadieron 200 l de inhibidores que contiene medio en la parte superior cada 3 días. Para los experimentos de ARNi, se sembraron las células dos días después de la transfección.
supervivencia clonogénico ensayo
Las células se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos a 100 células /pocillo en medio de crecimiento, se trató con NU7026 la día siguiente, y radiada a los 2, 4 y 6 Gy. Después de 10-14 días de incubación, las células fueron fijadas en 80% de metanol y se tiñeron con 0,2% de cristal violeta y se contaron las colonias. La fracción superviviente se calculó utilizando la eficiencia de plaqueo.
ensayo del cometa, Neutral
ensayo del cometa, Neutral se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Trevigen). Brevemente, las células se combinaron con agarosa de bajo punto de fusión (catálogo no. 4250-050-02), y luego montadas en CometSlide (catálogo no. 4250-200-03). Después de la lisis celular (catálogo no. 4250-050-01) y el desenrollado de ADN, se sometieron a electroforesis las células durante 40 min a 21 voltios en tampón TBE. Las láminas fueron fijadas con etanol, manchados por SYBR y las imágenes tomadas por la máquina AutoComet (Tritek Corp). Un mínimo de cien celdas seleccionadas al azar de cada muestra fueron analizados utilizando el software CometScore (http://autocomet.com). daño en el DNA fue determinada por momento de la cola (longitud de la cola multiplica por el porcentaje de ADN en la cola).
análisis de transferencia de Western
Las células se lavaron por PBS, se contaron y se lisaron en tampón de carga 2x SDS . El análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con protocolos estándar. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para Western: actina (Sigma, A2066), γH2AX (Millipore, 05-636), Ku-70 de cabra (Santa Cruz, sc-1487), fosfo-Chk1 (S345) (la señalización celular,#2348) , y se escindió de la caspasa-3 (Asp175) (la señalización celular,#9664).
Inmunofluorescencia tinción
Las células cultivadas en cubreobjetos o portaobjetos de microscopía 8 pocillos se fijaron durante 20 min con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron por 0,1% de Triton X-100 para 3 min. Las células fueron incubadas durante la noche a 4 grados con anticuerpos monoclonales de ratón contra γH2AX (Millipore, 05-636), o Rad51 (Santa Cruz, sc-8349, H-92), seguido de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-FITC (Santa Cruz, 1 :300) o de cabra anti-IgG de conejo-FITC (Santa Cruz, 1:300). imágenes de células fueron tomadas con un microscopio Zeiss utilizando un objetivo de 63x y se analizaron los focos /núcleo.
vitro plásmido En pGL2 basados en NHEJ ensayo
plásmido de control de pGL2 (Promega) fue completamente linealizó la endonucleasa de restricción HindIII y el ADN linealizado se extrajo del gel de agarosa con el kit de extracción de gel (Invitrogen). plásmido circular y el ADN linealizado fue entonces co-transfectadas con PRT-RL plásmido en células con Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668). Las células transfectadas se lisaron y se ensayaron para actividad de luciferasa con Dual Luciferase Assay (Promega). La señal de luciérnaga se normalizó a la de Renila que sirvió como referencia de la transfección. La capacidad total NHEJ se calculó la actividad de luciferasa de luciérnaga a partir de células transfectadas con ADN digerido con HindIII con relación a la del plásmido intacto.
citometría de flujo ensayo
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos, se trató con NU7026 el día siguiente durante 48 horas, y radiada a 2 Gy y se fija después de 24 horas con hielo frío de etanol al 70% en PBS durante toda la noche. Después de la centrifugación, los pellets se resuspendieron en PBS, se tiñeron con solución de yoduro de propidio durante 30 minutos y se analizaron por citometría de flujo (BD FACS Calibur) en la oscuridad.