Extracto
Heat shock factor 1 (HSF1) es un regulador maestro que coordina la expresión de la proteína chaperona para mejorar la supervivencia celular en la cara del estrés por calor. En las células cancerosas, HSF1 conduce un programa transcripcional distinta de choque de calor para promover la metástasis y la supervivencia celular. Su fuerte asociación con el fenotipo maligno implica que los antagonistas de HSF1 pueden tener utilidades generales y eficaces en la terapia del cáncer. Con este fin, habíamos identificado un aptámero de ARN ávido de HSF1 que es portátil entre los diferentes organismos modelo. La extensión de nuestro trabajo previo en la levadura y Drosophila, aquí se presenta la actividad de este aptámero en líneas celulares de cáncer humano. Cuando se entrega en las células usando un gen sintético y fuerte promotor, este aptámero fue capaz de prevenir HSF1 de la unión a sus elementos de regulación de ADN. A nivel celular, la expresión de este aptámero inducida por apoptosis y abolió la capacidad de formación de colonias de células cancerosas. A nivel molecular, se redujo chaperones y atenúa la activación de la vía de señalización MAPK. En conjunto, estos datos demuestran la ventaja de aptámeros en la validación de dianas de drogas y apoyan la hipótesis de que la actividad de unión al ADN HSF1 es un objetivo potencial para el control de la transformación oncogénica y el crecimiento neoplásico
Visto:. HH Salamanca, Antonyak MA, Cerione RA , Shi H, Lis JT (2014) la inhibición de factor de choque térmico 1 en células humanas de cáncer con un potente ARN aptámeros. PLoS ONE 9 (5): e96330. doi: 10.1371 /journal.pone.0096330
Editor: Sandy D. Westerheide, University of South Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Enero, 2014; Aceptado: 4 Abril 2014; Publicado: 6 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Salamanca et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (NIH) subvenciones (GM25232 a JT Lis; CA140730 a JT Lis y H. Shi; Minoritarios del suplemento#25.232 a 2351 a JT Lis y HH Salamanca), y la Universidad de Cornell (Provost Diversidad Beca de HH Salamanca). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el factor de choque térmico 1 (HSF1) es un factor de transcripción que responde a una variedad de factores de estrés ambiental para activar la respuesta de choque térmico en las células eucariotas, un mecanismo de protección conservada entre diferentes reinos [1]. insultos estresantes, como la exposición térmica, estimulan HSF1 para actuar como un activador maestro de un conjunto de genes diana. En particular, se hace que la acumulación de proteínas con actividades de chaperones, tales como proteínas de choque térmico (HSP), HSP70 y HSP90, que ayudan a mantener la homeostasis intracelular mediante la protección de la proteoma contra los efectos tóxicos de mal plegamiento de proteínas y la agregación [2]. Mientras que sólo hay un HSF en
Saccharomyces cerevisiae
y
Drosophila melanogaster
, existen múltiples isoformas de mamíferos y plantas, que parecen tener funciones especializadas [3] - [5]. función de HSF1 es esencial para la respuesta al estrés y la viabilidad en la levadura [6], y es importante para ovogénesis y el desarrollo temprano en Drosophila [7]. HSF1 también está involucrado en el proceso de envejecimiento en
C. elegans
[8], así como en el desarrollo embrionario y extra-varias enfermedades importantes en los mamíferos [9].
Paradójicamente, bajo ciertas circunstancias, la capacidad de HSF1 para promover la supervivencia celular puede poner en peligro el bienestar general siendo de un organismo multicelular. Un ejemplo patente es la función de HSF1 en el cáncer. Durante mucho tiempo se ha observado que las células cancerosas pueden continuar proliferando en microambientes hipóxicas y hostiles que son de otra manera inhibidora del crecimiento de las células normales. Por lo tanto, no es sorprendente que las células cancerosas exhiben niveles elevados de proteínas de choque térmico (HSP) para facilitar el plegado de las proteínas dañadas y solubilización de los agregados de proteína [10]. Mientras que esta observación sugiere un papel indirecto de HSF1 en la progresión del cáncer, un impacto directo de HSF1 en malignidad ha descubierto recientemente [11]. De hecho, HSF1 se encuentra para ser activado en una amplia variedad de células malignas, y el patrón de ocupación de ADN por HSF1 en tales células cancerosas es diferente de la de las células normales expuestas a choque térmico. Por lo tanto, HSF1 conduce un programa transcripcional distinta que promueve la transformación celular y mantiene el crecimiento maligno. Además de los muchos genes de choque térmico clásicos, genes específicos de cáncer en esta regulación del ciclo celular, señalización de apoyo a los programas, el metabolismo, la adhesión y la traducción. Debido a esta firma HSF1 se asocia con resultados de los pacientes pobres de los diferentes tipos de cánceres humanos, incluyendo los de mama, pulmón y colon, HSF1 puede ser una diana terapéutica para generales y eficaces contra el cáncer [11].
A los efectos de el estudio y control de la función de HSF1 en células y organismos, que previamente identificados un aptámero de ARN, AptHSF-RA1 [12]. El aptámero se aisló inicialmente en un
in vitro
experimento de selección utilizando Drosophila HSF1 como el objetivo, y más tarde demostrado ser capaz de reconocer HSF1 en levaduras, Drosophila y humanos. El análisis de deleción define un motivo de unión mínimo del aptámero compone de dos tallos y de un bucle de vástago unido por una unión de 3 vías [12]. Este aptámero interactúa con el dominio de unión a ADN y una región de unión adyacente de HSF1, y compite con los elementos de ADN de choque térmico (HSE) para la unión a HSF1. En los extractos de célula de levadura, el aptámero inhibe la transcripción a partir de promotores de choque térmico, y cuando se expresa en células de levadura viva, produce un fenotipo sensible retraso en el crecimiento de temperatura y la disminución específica de la expresión de genes de choque térmico [13]. En Drosophila, este aptámero reduce los niveles de Hsp83 y causa anormalidades del desarrollo que imitan los fenotipos de reducción de Hsp83. El aptámero también suprime de manera efectiva los fenotipos inducidos por las formas constitutivamente activas del receptor de EGF y oncoproteínas Raf, que se regulan las proteínas 'cliente' de Hsp83 [14].
A continuación en el presente estudio, se presenta la lucha contra la la actividad del cáncer de este aptámero HSF1 en células humanas cultivadas. Hemos adoptado la configuración dimérica de AptHSF-RA1 utilizado en Drosophila [14], que fue nombrado iarna
HSF1 ( "ia" es sinónimo de "aptámero inhibidor"), y la dio en células de carcinoma cervical HeLa en forma de un sintético gen por transfección. La actividad anti-cáncer del aptámero a continuación se investigó a través de tres líneas de estudios. En primer lugar, se confirmó el mecanismo molecular de la acción aptámero mediante la determinación de la interrupción de la interacción del HSF1 con sus elementos de ADN afines
in vitro
y
in vivo
. En segundo lugar, hemos demostrado la capacidad del aptámero, cuando se expresa en células de cáncer, para promover la apoptosis e inhibir la formación de colonias en agar blando. Por último, se aborda el tema de la especificidad en las células, mostrando: (1) los fenotipos de aptámeros son suprimidos por la sobreexpresión de HSF1 o HSP, (2) la expresión aptámero reduce la expresión del gen diana HSF1, y (3) la expresión aptámero reduce el HSF1 modulada, MAPK vía de señalización. En conjunto, nuestros resultados están de acuerdo con informes anteriores que muestran que el HSF1 es crítica para el mantenimiento de la transformación celular. Por otra parte, nuestros resultados plantean la interesante posibilidad de que un aptámero que inactiva funcionalmente HSF1 se puede utilizar para bloquear la progresión del cáncer humano.
Métodos y Materiales
construcciones de expresión
La secuencia de el constructo aptámero dimérica, iarna
HSF1 es la siguiente (las letras minúsculas representan la ribozima cabeza de martillo): 5′GUCGAGUGACGUUGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUCGGAAUUCAACUGCCUUCGUCAUACUCCUUGAAUUCAACUGCCUUCGGGCAUCGCGAUACAAAAUUAAGUUGAACGCGAGUUCUUGGAGGCUCGACguc uagcgaugugguuucgcuacugaugaguccgugaggacgaaac 3 '. En el proceso de construcción del vector de expresión para el aptámero dimérica, una construcción de control antisentido, RevRA1, se generó, utilizando conjuntos de cebadores que intercambian las cadenas parentales y el retraso de la región de codificación de aptámero manteniendo intacta la unidad de cabeza de martillo. Ambas unidades de sentido y antisentido fueron clonados en vectores de puerta de enlace [14] y se trasladaron a pDest51 (Invitogen) para la expresión del aptámero y el control en las células de mamíferos. La secuencia de codificación de "rescatar" proteínas y sus controles, incluyendo HSF1, HSP90, HSP70, LacZ y GFP, se clonó cada uno aguas abajo del promotor de CMV en un vector diferente con G418 como marcador selectivo.
Cultivo celular y transfección
las células utilizadas en este estudio se obtuvieron de la ATCC y se mantuvieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. HeLa (CCL-2), IMR-90 (CCL-196), 293T (CRL-3216), MCF7 (HTB-22), U87 MG (HTB-14), y BE (2) -M17 (CRL-2267) Las células fueron cultivadas en medio E-MEM bajo nivel de glucosa (ATCC) suplementado con FBS al 10%, 1X penicilina /estreptomicina en 5% de CO
2. MDA-MB-231 (CRM-HTB-26) fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con 10% FBS, 1X Pen /Strep en 5% de CO
2. Las células 293T se cultivaron en medio DMEM de alta glucosa (ATCC) suplementado con 10% FBS, 1X Pen /Strep en 5% de CO
2. Tras el crecimiento hasta la confluencia, se tripsinizaron las células y se pasaron en medio fresco según las instrucciones de la ATCC. Estas células parentales fueron transfectadas con iarna
HSF o ARN RevRA1 vectores de control que expresan. Las células no transfectadas fueron eliminados posteriormente de la población mediante el cultivo de las células en 6 g blasticidin /ml y lavar las células 24 horas después de la transfección. A partir de entonces, las células se mantuvieron y se cultivaron en blasticidin (1 ug /ml). Sólo se utilizaron las células blasticidina resistente a lo largo de los ensayos posteriores. Para los experimentos de "rescate", construcciones que expresan HSF1 humano (hHSF1), Hsp90 humana (hHSP90), humano Hsp70 (hHSP70), LacZ, o GFP se mezclaron con vectores de expresión para HSF aptamer (o ARN de control) en una relación 20:01 para asegurar la expresión apropiada y el exceso de los objetivos interesadas en relación con los aptámeros. Después de que los plásmidos se mezclaron, cada mezcla se transfectó en células HeLa en placas de 6 pocillos. Las células no transfectadas fueron lavados usando los métodos descritos anteriormente y las células restantes se mantuvieron en medio de selección.
EMSA
Se adoptó el esquema general de ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) y modificado a partir de trabajos anteriores [12]. sondas de ARN se marcaron internamente con [
32P a-] UTP mediante el uso de un T7
vitro
kit de transcripción en (MAXIscript, Ambion, Austin, TX). Los 10 l solución de unión contenían 1X tampón de unión, 1 mg de ARN de levadura portador, 4 g BSA portador, DTT 5 mM, glicerol al 10%, 6 unidades de SUPERase-In (inhibidor de RNasa), además de proteína y etiquetado aptámero de ARN. La concentración de la sonda de ARN marcado es inferior a 1 nM en la mayoría de los experimentos. El gen HSF1 humano se obtuvo de la Thiele Lab [15] y se subclonó en el sistema de expresión Gateway como su fusión. La proteína hHSF marcada con His expresada en bacterias se purificó por cromatografía Ni-NTA. Este purificado su-etiquetados proteína hHSF1 se incubó con aptámero de ARN a temperatura ambiente durante 30 min y 10 min a 4 ° antes de cargar en un gel de poliacrilamida nativo 6-9%. Los geles contenían 1/4 tampón TBE y 1 mM de MgCl
2 y se realizaron a 100-150 V a 4 ° C durante 1-2 horas.
RT-PCR
RT -PCR se realizó 24 horas después de la transfección de acuerdo con un protocolo descrito previamente usando los siguientes cebadores
iarna
HSF1 F:.
5'-GTCGAGTGACGTTGGCATCG
iarna
HSF1 R:
5 'GACGTCGAGCCTCCAAGAAC
iarna
Rev F:
5'-GTCGAGCCTCCAAGAACTCG
iarna
R Rev :
5 'GACGTCGAGTGACGTTGGCA
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP)
chip de ensayo se realizó 36 horas después de la transfección de acuerdo con un protocolo descrito anteriormente [16] utilizando anticuerpos contra HSF1 o HSF2 proporcionado amablemente por el Dr. Richard Morimoto.
transferencias de Western
Las muestras se prepararon 72 horas después de la transfección para los análisis moleculares a menos que se especifique lo contrario. Para el examen de la caspasa-3 se prepararon muestras entre 72-96 hrs. En resumen, las células se alimentaron cada 48 horas, y las muestras se recogieron por centrifugación los medios de comunicación, la granulación de las células. Además, las células adherentes fueron desechados en PBS, se sedimentaron y se combinan con las células en los medios de comunicación. Acto seguido, las muestras se sometieron a lisis en presencia de detergentes no iónicos que contienen inhibidores de la proteasa, y las muestras se hirvieron en presencia de SDS-6X. protocolos convencionales de Western blot se utilizaron los siguientes anticuerpos. Anticuerpos primarios: G6PDH se adquirió de Sigma (A9521). Todos los otros anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Inc .: HSF1 (No. 4356), Hsp90 (No. 4875), Hsp70 (No. 4872), Hsp60 (No. 4870), Hsp40 (No. 4868), calnexina (No. 2433), GRP78 (Nº 3177), EGFR~p (Nº 2234), Erk1 /2~p (Nº 9146), el total de Erk1 /2 (Nº 9102), caspasa-3 (# 9662). El anticuerpo PARP era anti-PARP DBD, un regalo del doctor W. L. Kraus y transglulaminase (TGM2) fue un regalo del laboratorio del Dr. R. Cerione comprado de Thermo Scientific. Los anticuerpos secundarios se utilizaron de acuerdo con inmunorreactividad adecuada. Las membranas de PVDF se bloquearon con 5% de BSA y las membranas se incubaron anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C.
apoptótica ensayo
La apoptosis se observó mediante la cuantificación del número de células HeLa que contienen núcleos fragmentados como se visualizó por tinción DAPI bajo el microscopio. En estos experimentos, se observaron, iarna
HSF o ARN RevRA1 células de control parental durante 96 horas después de la transfección. En estos experimentos, no transfectadas iarna
HSF se eliminó mediante el cultivo de las células en 6 g blasticidin /ml y lavar las células 24 horas después de la transfección. Sólo se utilizaron las células blasticidina resistente a lo largo de los ensayos posteriores. Todos los análisis estadísticos en este estudio se calcularon utilizando la prueba t de Student.
ensayo de crecimiento independiente del anclaje
6 × 10
3 células transfectadas semi-estables se sembraron en placas de 6 pocillos en medio apropiado suplementado con 3% de agarosa (Tipo VII, Sigma A4018) sobre una capa caliente de medio de pre-solidificado que contiene 6% de agarosa (Tipo VII, Sigma A4018). Cinco días después de la siembra de las células de una nueva capa de 1 cm de los medios de comunicación se sembró sobre las células en crecimiento. células HeLa que contienen 17-AGG tenían una concentración final de 8.8 ug dl mezcla agar /17-AAG. Se evaluó la capacidad de las células para crecer en agar blando después de 14 días. Las colonias se analizaron en el microscopio óptico.
Resultados
iarna
HSF1 impide HSF1 se una a sus elementos de ADN reguladores en células de carcinoma HeLa
Anteriormente, hemos desarrollado una método para la entrega de los aptámeros de ARN en los núcleos de las células como genes sintéticos [17] y lo utilizó para expresar el aptámero de HSF1, AptHSF-RA1, en Drosophila [14]. Este constructo de ARN, llamado iarna
HSF1, contiene dos unidades aptameric para mejorar la avidez y una ribozima de cabeza de martillo en la que el 5 'y 3' del RNA están protegidos para facilitar el plegado y la estabilidad. Se adaptó este constructo mediante la colocación de su secuencia de codificación bajo el control del promotor EF-1a en un vector de expresión de mamífero. También hicimos una construcción de control, llamado RevRA1, en el que el resto aptámero de la iarna
HSF1 fue reemplazado por su secuencia antisentido. Antes de usarlo en las células, produjimos este ARN por
transcripción in vitro Opiniones y se determinó su avidez por HSF1 humano purificado en un ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Figura 1A) usando proteína purificada HSF1 humano (Figura S1 A) . Aquí, el iarna
HSF1 genera un complejo desplazado con una aparente K
d de 25 nM (Figura 1B). En contraste, el control RevRA1 no mostró ninguna unión. Además, cuando la limitación de cantidades de iarna
HSF1 se incubó con altas cantidades de BSA purificado (1 M), no se observó desplazado banda. Juntos, estos
in vitro
resultados demostraron que la interacción entre iarna
HSF1 y HSF1 se produce con gran afinidad y es relativamente selectivo.
(A) electroforética cambio de ensayo de la motilidad (EMSA) utilizando radiomarcado iarna
HSF1 (1 nM) y cantidades crecientes de proteína HSF1 humano muestra que el aptámero se une a su diana con avidez. (B) Cuantificación de la EMSA independiente revela la aparente afinidad de la iarna
HSF1 para HSF1 como Kd~25 nM (n = 5).
A continuación, se transfectaron la iarna
HSF1 expresando vector en un cáncer y una línea de células no transformadas. Elegimos células de carcinoma cervical HeLa como una línea celular de cáncer representativo, ya que son una de las líneas celulares de cáncer humano más comúnmente utilizados y bien caracterizados [18]. Como una línea de células no transformadas, se utilizaron células IMR-90, que son no transformadas, no inmortalizado fibroblastos humanos de pulmón [19]. Como control para el aptámero funcional, se utilizó el vector que expresa RevRA1. Para confirmar la expresión de las construcciones en las células, se realizaron ensayos de PCR cuantitativa (RT-qPCR) usando conjuntos de cebadores que reconocen la dimérica iarna
HSF1 o la RevRA1 de control 24 horas después de la transfección y transcripción inversa. Nuestros resultados mostraron que los niveles de aptámero de ARN fueron similares tanto para el aptámero y el ARN de control en células HeLa y IMR-90 (Figura 2A).
(A) ARN de control (RevRA1) y ARN aptamer (iarna
HSF1) construcciones se expresaron a niveles similares en células HeLa y células IMR90 después de 24 horas después de la transfección (valores normalizados de ARN de GAPDH, n = 3). (B) La alteración de la interacción del HSF1 con sus elementos de ADN afines por iarna
HSF1. ensayos de chip en iarna
HSF1 (o RevRA1) que expresan las células HeLa muestran que la expresión iarna
HSF1 puede inhibir eficazmente HSF1 unión a la
Hsp90
y
Hsp70 promotor
loci
in vivo
(n = 3). Los anticuerpos utilizados en los ensayos de chip son específicos para HSF1 o HSF2 proteínas de mamíferos [20]. BG = Antecedentes.
Para confirmar el mecanismo molecular de acción de aptámeros, determinamos si iarna
HSF1 prevenirse eficazmente HSF1 se una a sus elementos de ADN reguladores en las células. Para este propósito, se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayos sobre iarna
HSF1 o RevRA1 que expresan las células HeLa (36 horas después de la transfección, antes de la apoptosis en las células-ver más abajo) utilizando un anticuerpo específico para los mamíferos HSF1 [20] . Se encontró que la expresión iarna
HSF1 significativamente comprometida HSF1 unión a los promotores principales de choque térmico (
Hsp90
y
Hsp70
)
in vivo gratis (Figura 2B). Porque los mamíferos contienen dos proteínas de choque térmico, HSF1 y HSF2, y el ADN dominio de unión está altamente conservada entre ellos, también a prueba si nuestra aptamer inhibe la unión HSF2. Hemos encontrado que la expresión iarna
HSF1 impide de manera similar HSF2 unión a la
Hsp90
y
Hsp70 promotor
in vivo gratis (Figura 2B). Es posible que el aptámero inhibe ambos factores de transcripción o la inhibición de la unión podría afectar el promotor de ocupación de la otra un factor, ya que tanto HSF1 y HSF2 se sabe que regulan genes específicos de choque térmico [21]. No obstante, los niveles más bajos de HSF2 a los promotores, en relación con HSF1 (tenga en cuenta la diferencia de 50 veces en escala del eje y), detectado por el chip en el
Hsp90
y
Hsp70
promotores y la menor afinidad del aptámero para HSF2 (Figura S1B) sugieren que los efectos inhibidores primarios del aptámero en la expresión génica aguas abajo es a través de HSF1, al menos bajo estas condiciones en células HeLa.
iarna
HSF1 expresión induce la apoptosis y atenúa la capacidad de transformación de las células de cáncer
a continuación, se investigó el efecto de que el aptámero tiene sobre la supervivencia de las células HeLa y las células no transformadas IMR-90. Cuatro días (96 horas) después de la transfección de las células, ya sea con iarna
HSF1 o RevRA1, la viabilidad celular y la apoptosis se cuantificó por observación directa de las células que fueron sometidos activamente blebbing celular, la ruptura nuclear y la fragmentación cromática. Hemos encontrado que la expresión de aptámero en las células no transformadas IMR-90 causó poco, si los cambios morfológicos (Figura 3A) o la inducción de la muerte celular (Figura 3B). Por el contrario, el aptámero provocó un aumento de aproximadamente 9 veces en la muerte de las células de la línea celular de cáncer de HeLa (63% de la población,
p
= 0,0001). Como ya se ha demostrado anteriormente en la figura 2A, estas diferencias no se debieron a diferencias en los niveles de expresión aptámero entre las líneas no transformadas y transformadas de células de cáncer. Para demostrar la generalidad de este efecto, luego preguntamos si la expresión de la iarna
HSF1 en la línea celular de riñón 293T humano transformado químicamente de manera similar podría matar a las células. Se encontró que la expresión iarna
HSF1 en las células 293T provoca drásticamente las células para redondear y desprenderse de sus placas de cultivo, de forma similar a las células HeLa (Figura 3A). En comparación con las células de los padres y de control hubo un aumento de aproximadamente 7 veces mayor de la apoptosis en el iarna
HSF1 que expresan las células 293T, con un
p-valor de 0.0018
(Figura 3B).
(a) iarna
expresión HSF1 no afecta a las células normales (IMR90), sin embargo, induce una morfología anormal en el carcinoma cervical HeLa y células de riñón transformadas químicamente (293T). (SEGUNDO). ensayos de condensación nuclear y la fragmentación revelan que la expresión iarna
HSF1 induce aumento ~ 10 veces en la apoptosis en células HeLa (p & lt; 0,0001) (n = 8), y el aumento de ~ 7 veces en la apoptosis en células 293T (p & lt; 0,0001 ) (n & gt; 8). Además, iarna
HSF1 apoptosis inducida en eficazmente suprimida por la sobreexpresión de chaperones moleculares (HSF1 P & lt; 0,006, Hsp90 p & lt; 0,005, o Hsp70 p & lt; 0,002), pero no proteínas aleatorias (GFP o LacZ) (n & gt; 8).
Desde una fracción del iarna
HSF1-expresión de las células cancerosas no se sometieron a la apoptosis (aproximadamente 30%), hemos tratado de determinar si estas células se vieron comprometidos en su capacidad para formar colonias en ensayos de crecimiento independiente de anclaje (agar blando), un
in vitro
medición de la capacidad tumoral. Como era de esperar, las células HeLa que expresan una secuencia de ARN de control (RevRA1) forman grandes colonias en agar blando (figura 4); Sin embargo, las células HeLa que expresan iarna
HSF1 no lo hicieron. Esto indicó que las células HeLa que expresan el aptámero HSF1 que no se sometieron a apoptosis en las primeras 96 horas de su expresión se ven comprometidos en su capacidad de transformación. Estos resultados proporcionan más apoyo que HSF1 es de hecho necesaria para el mantenimiento del fenotipo transformado cáncer, similar a los informes anteriores [22].
inhibición del crecimiento HSF1 por iarna
HSF1 inhibe transformó en agar blando. El análisis de agar blando de las células no transfectadas HeLa (arriba a la izquierda) o ARN de control de sobre-expresión de HeLa (parte inferior izquierda), muestra que iarna
HSF1 sobreexpresión (abajo a la derecha) inhibe la transformación celular (formación de colonias) de una manera similar como el tratamiento de células HeLa con 150 nM 17-AAG (arriba a la derecha) (día 14).
Debido a la HSP90 se co-regulada por HSF1 y es importante para el crecimiento de células de cáncer [23], que además en comparación los efectos inhibidores de iarna
HSF1 contra un inhibidor de Hsp90 potente 17- (alilamino) -17-demetoxigeldanamicina (17-AAG) en la formación de colonias en agar blando. De manera similar a las células que expresan iarna, células HeLa cultivadas en presencia de 150 nM 17-AAG no fueron capaces de formar colonias en agar blando (figura 4). En general, estos resultados sugieren que la inactivación funcional de HSF1 por iarna
HSF1 reduce la expresión de los principales genes regulados-HSF1 que a su vez son críticos para el mantenimiento del fenotipo transformado.
iarna
HSF reducida chaperona niveles y atenúan la vía MAPK en las células HeLa
validación de dianas de drogas y desarrollo terapéutico requiere una rigurosa garantía de especificidad. Este problema es pertinente para el aptámero HSF1 descrito aquí, ya que se aisló utilizando una proteína ortólogos. Sin embargo, la falta de efectos fuera de la meta es difícil de probar en el complejo entorno de las células vivas. Por lo tanto, nos acercamos a este tema desde tres ángulos diferentes a nivel molecular para demostrar la relación de causalidad entre la expresión de aptámeros y la pérdida del fenotipo transformado en células cancerosas humanas. En primer lugar, tomamos un enfoque genético similar al factor de titulación o add-back experimentos en los que los efectos inducidos aptámeros se invierten por la adición de un exceso de proteína diana [17]. Recientemente, hemos utilizado con éxito esta estrategia en Drosophila y encontramos que las anomalías del desarrollo inducidas por el iarna
HSF1 podrían ser suprimidas por la expresión excesiva de HSF1 [14]. Siguiendo este ejemplo, se examinó si HSF1 sobreexpresión podría rescatar a las células cancerosas que expresan iarna
HSF1 de la apoptosis. Se encontró que la expresión ectópica de HSF1 o genes que son importantes para la promoción de la supervivencia celular HSF1 regulado, es decir,
Hsp70
y
Hsp90
, puede rescatar la respuesta apoptótica mediada aptámero, en comparación con el expresión de proteínas de control (LacZ o GFP) (Figura 3B).
en segundo lugar, se confirmó la causalidad entre la expresión de aptámero y su efecto sobre la inhibición de HSF1 midiendo el nivel de los productos de los genes conocidos para ser controlado por HSF1 de unión, como la inhibición de la unión de HSF1 por el aptámero debe causar una disminución de estas proteínas. Medimos los niveles totales de diversas proteínas chaperonas moleculares 72 horas después de la transfección de los padres (no transfectadas), ARN de control (Ap) y iarna
HSF1-que expresan las células HeLa (Figura 5A). Es importante destacar que los niveles de HSP70, calnexina, transglutaminasa 2 (TGM2), y GRP78 fueron severamente disminuyó en las células que expresan de aptámero. expresión de HSP90 también fue reproducible disminuyó, aunque en menor medida que HSP70. En contraste, el nivel de la mitocondrial chaperona Hsp60 específica no se vio afectada por el aptámero, lo que sugiere que Hsp60 es o bien una proteína altamente estable con una larga vida media que es tolerante de los eventos proteolíticos de apoptosis o su expresión es independiente de HSF1 transcripcional actividad. En estos experimentos, la apoptosis se detectó mediante el ensayo para la escisión de la PARP objetivo de la caspasa-3. Para determinar si la disminución observada en HSP70, calnexina, transglutaminasa (TGM2), y GRP78 era debido a la inhibición HSF1 o una consecuencia de la de la apoptosis induciendo aptámero, que mide los niveles totales de chaperones en las células HeLa que expresaban iarna
HSF, pero se les impidió entrar en la apoptosis mediante la co-expresión de HSP90. De manera similar a lo que hemos observado en células que expresan sólo el iarna
HSF1, las células que expresan tanto iarna
HSF1 y HSP90, se observó una disminución general de los niveles totales de las chaperonas moleculares selectos, HSP70 (~ 50%), calnexina (~ 50%), y GRP78 (~ 25%) en comparación con los padres HeLa o células de control (que expresa RevRA1) (Figura 5B, n = 4). Esta observación sugiere que la reducción de los chaperones moleculares por iarna
HSF1 se debe, al menos en parte, a la disminución general de la actividad HSF1 en sus objetivos de genes.
(A) análisis de transferencia de Western que muestra el agotamiento de proteínas chaperonas moleculares específicos en las células de aptámero de control o expresar. Hsp90 co-expresión rescata chaperonas moleculares específicas observadas en HSF1 inhiben las células que expresan aptámeros. El asterisco indica producto de degradación PARP, un marcador de apoptosis. Los que dejan la mayoría de los tres carriles son una serie de dilución de extractos de líneas parentales que proporciona una curva estándar de cuantificación. (B) Cuantificación de los resultados observados en el panel A (n = 4,% de error indica SEM).
Estamos validar los resultados anteriores y aprovechar el poder de la genética de mamíferos mediante el sondeo de HSP70 y HSP90 usando ratón fibroblastos de embriones que se han derivado de ratones nulos viables y fértiles HSF1 (
HSF1 - /-
) generados en el laboratorio de Benjamin Ivor [24]. Entre los mamíferos, HSF1 muestra alta conservación estructural y funcional [15], [20] De una manera similar como la inhibición HSF1 por el aptámero, encontramos que
HSF1 - /-
células tienen efectos relativamente menores en los niveles totales de la proteína Hsp90, sin embargo, muestra efectos importantes sobre la Hsp70 en condiciones normales de crecimiento, en comparación con los MEF de tipo salvaje (Figura S2).
en tercer lugar, examinamos cómo la inhibición de HSF1 por nuestro aptámero atenúa la activación de la vía de señalización MAPK . La vía MAPK Drosophila se había informado anteriormente por nosotros a ser afectados por el aptámero HSF1 [14]. Del mismo modo, la Lindquist y Gius laboratorios han demostrado que el agotamiento de HSF1 también afectan a esta vía [22] - [23], [25]. Aquí mostramos en las células humanas que la inhibición HSF1 por el aptámero afectó a los niveles globales de oncoproteínas clínicamente relevantes, Ras, Raf, y Akt, antes de la aparición (48 horas) y durante la apoptosis inducida aptamer (96 hrs). En comparación con el control RevRA1, el aptámero células que expresan mostró una disminución progresiva de los niveles de Ras, Raf, y Akt de una manera que también era consistente con los niveles decrecientes de longitud completa de la caspasa-3, un marcador Bonified de apoptosis [ ,,,0],26] (Figura S3 A). Encontramos que estos resultados pueden ser parcialmente suprimidos por la co-expresión de hHSF1 tanto en ensayos bioquímicos y morfológicos (Figura S3 A & amp; B).
Para investigar directamente la capacidad de iarna
HSF1 para inhibir la actividad de MAPK en células de cáncer humano, se estimularon las células HeLa que expresan el aptámero o el ARN de control con el mitógeno, factor de crecimiento epidérmico (EGF), y examinar los efectos que tuvo sobre la activación del receptor de EGF o la señalización de MAPK por la recolección de células 10 minutos después del tratamiento y ensayando las muestras por transferencia Western. Es importante destacar que estos experimentos se realizaron en un momento en que las células no estaban sufriendo apoptosis activamente como se visualiza por la proteína PARP intacta (36 horas después de la transfección) (Figura 6A). En general, encontramos que las células HeLa que expresan ARN parental o de control expresan una cantidad considerable de receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que puede ser activado en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento epidérmico (p-EGFR) (Figura 6A). Por el contrario, la orientación actividad HSF1 con el aptámero disminuyó la cantidad de EGFR activado (p-EGFR) (Figura 6A). Para investigar el efecto de este aptámero tenido en actividad de señalización mitogénica, que probaron para los niveles de Erk1 /2 activadas, los miembros de la MAPK que funcionan aguas abajo del EGFR. Aquí, nos encontramos con que las células que expresan el aptámero HSF1 contienen cantidades de la Figura Erk1 /2 (fosforilado) que se acompaña de una reducción de ~ 75% en los niveles totales de proteína de Erk1 /2, en comparación con las células que expresan el aptámero de control (actived reducen 6B). De una forma similar, y como prueba de principio, complementamos estos experimentos usando WT y
HSF1 - /- MEFs
y encontramos que HSF1 K.O. las células presentan una capacidad comprometida para activar ERK1 /2 (p-ERK1 /2) (figura S4). Este atenuada respuesta de señalización de MAPK puede ser suprimida por sobre-expresión de k-Ras
G12V en
HSF1 - /-.
Células MEF
(A) la inhibición HSF1 atenúa la activación del receptor de EGF después de la adición de EGF a las células HeLa. (B) la inhibición HSF1 por iarna
HSF1 provoca un agotamiento de los niveles totales y formas activadas de Erk1 /2.