Extracto
glioblastomas pediátricos (pGBM), aunque poco frecuentes, son una de las principales causas de cáncer- muertes relacionadas en niños con tumores, esencialmente refractarios a los tratamientos existentes. A continuación, describimos el uso de convencionales y avanzados
in vivo
imágenes por resonancia magnética (MRI) técnicas para evaluar una novela de xenoinjertos ortotópico ratón pGBM (IC-3752GBM cultura derivada del paciente) modelo, y para monitorear los efectos de el agente anti-cáncer OKN-007 como un inhibidor del crecimiento del tumor pGBM. datos de soporte de inmunohistoquímica también se presenta para la proliferación celular y la señalización de crecimiento del tumor. NOC-007 fue encontrado para reducir significativamente los volúmenes tumorales (
p Hotel & lt; 0,05) y aumentar la supervivencia de los animales (
p Hotel & lt; 0,05) en todos los ratones tratados con NOC-007 en comparación con los animales no tratados . En una cohorte de respuesta de los animales tratados, OKN-007 fue capaz de disminuir significativamente los volúmenes tumorales (p & lt; 0,0001), aumentar la supervivencia (p & lt; 0,001), y aumentar la difusión (
p
& lt; 0,01) y las tasas de perfusión (
p Hotel & lt; 0,05). OKN-007 metabolismo también redujo significativamente tumor de lípidos en animales sensibles [(Lip1.3 y Lip0.9) Relación de -to-creatina (
p
& lt; 0,05)], así como disminuir significativamente la proliferación de células tumorales (
p Hotel & lt; 0,05) y la densidad de microvasos (
p Hotel & lt; 0,05). Además, en relación a la vía de PDGFRa, OKN-007 fue capaz de disminuir significativamente SULF2 (
p
& lt; 0,05) y PDGFR
α
(receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas
-α
) (
p Hotel & lt; 0,05) inmunoexpresiones, y aumentar significativamente la expresión de la decorina (
p Hotel & lt; 0,05) en ratones sensibles. Este estudio indica que OKN-007 puede ser un agente anti-cáncer eficaz para algunos pacientes con pGBMs mediante la inhibición de la proliferación celular y la angiogénesis, posiblemente a través de la PDGFR
α
vía, y podría ser considerado como una terapia adicional para pediátrica pacientes con tumores cerebrales
Visto: Coutinho de Souza. P, S Mallory, Smith N, D Saunders, Li XN, McNall-Knapp RY, et al. (2015) La inhibición de crecimiento del tumor glioblastoma Pediátrica por la Lucha contra el Cáncer Agente NOC-007 en ortotópico xenoinjertos de ratón. PLoS ONE 10 (8): e0134276. doi: 10.1371 /journal.pone.0134276
Editor: Marta M. Alonso, Hospital de la Universidad de Navarra, ESPAÑA
Recibido: 6 Marzo, 2015; Aceptado: July 8, 2015; Publicado: 6 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Coutinho de Souza et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud (GM103639 P20, KMF) http://nih.gov/, Universidad del Estado de Oklahoma (AE-1-50060; PCS) http : //go.okstate.edu/, Musella Foundation (número Nº; RAT) http://www.virtualtrials.com/musella.cfm, y encefálico infantil tumor Foundation (número Nº; RAT) http: //www .childhoodbraintumor.org /
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
gliomas de alto grado (GAG) representan uno de los más comunes. sistema nervioso central (CNS), los tumores entre los adultos. Esto contrasta de manera significativa a la población pediátrica donde GAG solamente comprenden aproximadamente el 8-12% de todos los tumores primarios del SNC [1]. Estos tumores se clasifican por la Organización Mundial de la Salud (OMS), ya sea como de grado III o IV que significa que son tumores altamente malignos con rasgos característicos tales como hipercelularidad, atipia nuclear, y alta actividad mitótica con o sin proliferación microvascular y necrosis [2]. Los GAG pediátricas más comunes incluyen astrocitoma anaplásico (OMS grado III) y glioblastoma (GBM, grado IV de la OMS). glioblastoma pediátrico (pGBM) es una de las principales causas de muerte por cáncer en los niños [3] con una mediana de supervivencia global para los pacientes de 11 meses [4]. A pesar de las mejoras en la neurocirugía, la radioterapia y la quimioterapia, el pronóstico para los niños con HGG pediátrica sigue siendo pobre [5]. No hay regímenes de quimioterapia eficaces han sido identificados por cualquier HGG pediátrica sin embargo, [5]. Por otra parte, nuevos agentes dirigidos molecularmente han demostrado poca eficacia en ensayos clínicos de fase temprana [6-8], destacando la necesidad de nuevos enfoques de tratamiento.
Del mismo modo, la mejora de los
in vitro
y
también se necesitan modelos in vivo para
GAG pediátricos. líneas celulares tumorales y modelos animales derivadas de tumores del SNC son herramientas esenciales para el estudio de la biología de la enfermedad, para comprender los mecanismos de resistencia a la terapia, y para llevar a cabo las pruebas preclínicas terapéutica. Hay abundante información sobre modelos animales de adulto HGG [9-11], incluyendo ratones genéticamente modificados químicamente inducido, y modelos de xenoinjerto [9]. Sin embargo, hasta la fecha sólo unos pocos modelos de GBM pediátricos se han establecido y /o caracterizarse [12-14]
Hemos demostrado que el agente anti-cáncer-NOC 007 (Oklahoma nitrona-007;. Disódico 4- [(terc-butil-imino) metil] benceno-1,3-disulfonato de N-óxido o disufenton) es muy eficaz contra gliomas adultos en modelos preclínicos [11,15,16], y actualmente está experimentando evaluación de ensayos clínicos como una nuevo fármaco en investigación para adultos glioblastomas recurrentes. OKN-007 es una pequeña molécula que puede atravesar la barrera hematoencefálica y tiene antiinflamatorio, antioxidante, y las propiedades proapoptóticos [17,18]. En un modelo de glioma ortotópico F98 rata y un modelo de xenoinjerto U87 humano en ratas atímicos, OKN-007 aumentó significativamente la supervivencia de los tratados frente a ratas no tratadas [16]. volúmenes de los tumores en estos dos modelos se redujo significativamente en comparación con los animales tratados no tratados sobre la base de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) de evaluación [16]. La inmunohistoquímica (IHC) la evaluación de los marcadores tumorales comúnmente estudiadas para la proliferación o diferenciación celular, la hipoxia, la angiogénesis y apoptosis indicó que OKN-007 fue capaz de disminuir significativamente la proliferación celular (transportador de glucosa 1 (GLUT-1) y el marcador de la proliferación celular, MIB -1), pero no la diferenciación celular (carbonato de anhidrasa IX), disminuir la angiogénesis (densidad de microvasos (MVD; medida como el nivel del marcador endotelial, CD-31), pero no el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)), disminuir la hipoxia (hipoxia inducible factor 1 α (HIF-1α)), y aumentar la apoptosis (exfoliados caspasa 3) en comparación con los controles no tratados [16]. disminuciones OKN-007-inducida en GLUT-1 y los niveles de HIF-1α pareció ser similar en ambos modelos F98 y glioma U87, mientras que el aumento de la apoptosis parece ser más elevada en los gliomas F98 en comparación con los tumores U87 [16]. Hemos llegado a la conclusión de que OKN-007 tiene la capacidad de causar la regresión glioma en modelos de tumores de roedor agresivos (F98 y U87), así como en gliomas moderados (C6) [11,15,16]. Soporte para el efecto anticancerígeno de la NOC-007 a través de la vía TGFß1 se informó recientemente por Zheng
et al
. (2013), donde se encontraron con que OKN-007 media su efecto antitumoral en células de HCC (Huh7) a través de la supresión de TGFß1 /SMAD2 y la señalización de Hedgehog /GLI1 mediante la inhibición de sulfatasa 2 (SULF2) la actividad enzimática [19].
PDGFR
α
es el blanco más frecuente de amplificación focal en GAG pediátricos [20-23]. Las mutaciones somáticas de PDGFR
α
han sido también informó recientemente en GAG pediátricos [22-24]. También se sabe que la expresión de genes SULF2 se correlaciona con PDGFR
α
expresión [25]. De manera similar a SULF2, decorina se asocia también con la vía de PDGFRa [26]. Ya que se demostró previamente que NOC-007 podría afectar la actividad SULF2, pensamos que tal vez este agente podría ser eficaz contra los GAG pediátricos.
La RM se ha utilizado en preclínica [12] y clínica [27-32] Los estudios para diagnosticar y predecir los resultados de la terapia para el GBM pediátricos. Las técnicas más utilizadas incluyen
in vivo
1 H espectroscopía de resonancia magnética (
1H-MRS) [33-35], las imágenes de difusión (DWI) [36], y arterial spin labeling perfusión (ASL) [37].
1H-MRS se ha usado en entornos de investigación y clínicos a medir los niveles de metabolitos en el cerebro, y es muy adecuado para llevar a cabo el diagnóstico, caracterización y evaluación de la respuesta del tumor al tratamiento [38]. DWI puede evaluar cualitativa y cuantitativamente el movimiento molecular en la base de la organización de las microestructuras de tejido mediante la caracterización de la movilidad del agua [39], y puede proporcionar una evaluación más completa de la información celular y metabólica sobre el cáncer de cerebro humano [40]. ASL permite la evaluación de la medición del flujo sanguíneo del tumor [41], que ayuda en la caracterización del grado tumoral [37] y la respuesta a la terapia del cáncer [42].
A continuación se describe la caracterización de resonancia magnética de una novela de xenoinjertos ortotópico pediátrica ratón HGG (IC-3752GBM derivado del paciente cultivo primario) de modelo y de los efectos de OKN-007 para inhibir
in vivo
pediátrica glioblastoma IC-3752GBM crecimiento tumoral usando (imágenes morfológicas) convencional y técnicas de resonancia magnética avanzada (
1H-MRS, DWI, y ASL). La tinción inmunohistoquímica también se utilizó para evaluar los niveles de proteínas relacionadas con el tumor y para evaluar la proliferación de células tumorales. A lo mejor de nuestro conocimiento, el presente estudio es el primer informe de la caracterización de resonancia magnética de un xenoinjerto modelo murino ortotópico de pGBM, y la evaluación del agente anti-cáncer, NOC-007, en un modelo pGBM.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los experimentos de este estudio se llevaron a cabo siguiendo un protocolo humano aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en el Colegio Baylor de Medicina, así como un protocolo de animales aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de Baylor College of Medicine y el CICUAL de la Oklahoma Medical Research Foundation. Para las muestras de tejidos humanos, el consentimiento informado firmado se obtuvo de todos los pacientes o de sus representantes legales antes de la adquisición de muestras.
muestras de tumores de cerebro
Un espécimen fresco tumorales (3752GBM), a partir de 5 años -old mujer que se sometió a una craneotomía en el hospital de Niños de Texas, fue obtenido en un laboratorio criostato con el consentimiento firmado siguiendo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (H-4844). diagnóstico patológico final fue consistente con glioblastoma pediátrico (pGBM) [43]. La muestra de tumor se implanta directamente en la corteza cerebral derecho de ratones immunedeficient (Baylor College of Medicine IACUC#AN-4548). células de xenoinjertos de tumores recogidos de ratones donantes se sometieron a pases en ratones desnudos a través de seis de las implantaciones posteriores como hemos descrito anteriormente [43,44].
modelo de tumor de cerebro de ratón intracraneal
La cultura mediante pasajes glioblastoma pediátrica IC- 3752GBM se implantó por vía intracerebral en ratones desnudos atímicos (n = 24) (IACUC OMRF protocolos#13-51 y#13-53). Los jefes de los ratones anestesiados fueron inmovilizados (unidad estereotáxica; Kopf Instruments, Tujunga, CA), y con técnicas asépticas, un agujero de trépano 1 mm se perforó en el mm anterior del cráneo 1 y 2 mm lateral al bregma en el lado izquierdo o derecho . Una jeringa de Hamilton 20 l hermética a los gases se utiliza para inyectar 5-10 × 10
6 células IC-3752GBM /mL en suspensión en 4 l de medio de cultivo celular con 1,0% de agarosa en la derecha o izquierda del lóbulo frontal a una profundidad de 1,5 mm respecto a la superficie de la duramadre en una unidad estereotáxica. Analgesia (Buprenex, inyección por vía intraperitoneal) Se ha realizado siguiendo el procedimiento de implantación de células para el alivio del dolor durante la recuperación. Las líneas celulares se mantuvieron y expandieron inmediatamente antes de la inoculación. Después de la inyección, la piel se cerró con suturas quirúrgicas. Los animales fueron divididos en dos grupos: OKN-007-tratado (n = 12) y sin tratar (n = 12) grupos. Ambos grupos fueron estratificados para garantizar que los tamaños tumorales fueron similares antes del tratamiento se inició en el grupo tratado. El cultivo primario de IC-3752GBM no se pasó más de seis veces en los ratones.
NOC-007 de tratamiento
NOC-007 (Ryss laboratorios, Union City, CA) se administró a los ratones en el agua de bebida a una concentración de 150 mg /kg /día (0,20% w /v para un ratón de 20 g). El tratamiento comenzó cuando los volúmenes de los tumores eran entre 10 y 15 mm
3, y se administró de forma continua hasta el final del estudio. Los ratones que recibieron agua potable normal, se utilizaron como controles no tratados. La cantidad de NOC-007 consumida por cada ratón, que fueron alojados en jaulas separadas, se determinó pesando las botellas de agua cada día. No desviación significativa fue observada en el volumen de absorción de líquido de compuesto en estos ratones. La ingesta media de NOC-007 fue de aproximadamente 130-150 mg /kg /día para todos los ratones. Durante todo el estudio, se evaluó la respuesta terapéutica a OKN-007, ya sea como sensible (OKN-007-R) o no responde (OKN-007-NR). La mortalidad se registró diariamente durante el período de estudio para calcular el porcentaje de supervivencia de todos los animales. Todos los animales fueron sacrificados humanitariamente (CO
2 asfixia) cuando se cumplen los criterios de la carga tumoral (tumores ≥ 150 mm
3) y /o mostraron signos de enfermedad, pérdida de peso, la mala condición corporal, porfiria, hipoactividad, inquietud, la agresividad, la ataxia, poco profunda, respiración rápida y /o con dificultad, la caquexia, la falta de respuesta a los estímulos, falta de curiosidad, vocalización, convulsiones, postura encorvada y pelo erizado). Los animales fueron controlados dos veces al día.
técnicas de resonancia magnética
imágenes morfológicas.
Los ratones desnudos fueron anestesiados y colocados en una cuna estereotáxica. A 30 cm de diámetro horizontal imán Bruker Biospin operando a 7 Tesla (T; Bruker BioSpin GmbH, Karlsruhe, Alemania), se utilizó con un gradiente S116 establecido para llevar a cabo todos los experimentos de resonancia magnética. Se ha realizado una EPI (imagen planar eco) transceptor
bobina 1H 50W con un diámetro interior de 38,0 mm para la transmisión de señales y detección. Múltiple-rebanada, eco múltiple (MIPYME) de formación de imágenes (FOV = 2,50 x 2,50 cm
2, TR = 2000 ms, TE = 17,5 o 58,2 ms, matriz = 192, con una media = 2, rebanadas = 16, grosor de corte = 1 mm) se utilizó para calcular los volúmenes tumorales y para inspeccionar la morfología del tumor. Multi giro rebanada eco T
1 ponderados por imágenes (TR = 1000,0 ms, TE = 14 ms, FOV = 2,50 × 2,50 cm
2, promedios = 2, rebanadas = 16, tamaño de la matriz = 256 × 256) eran también se realizó y adquiridas antes y 15 minutos después de la inyección del agente de contraste intravenoso (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, Nueva York, EE.UU., 0,4 mmol /kg).
1H-Espectroscopia por RM.
1H-MRS fue adquirido usando una prensa (Punto Resuelta Spectroscopy) con una secuencia de TE de 24.0 ms, un TR de 2500.0 ms, 512 promedios, y una anchura espectral de 4006 Hz. Un espectro de RM sin supresión fue adquirido con anterioridad mediante la aplicación de la corrección de corrientes parásitas para maximizar la intensidad de la señal y disminuir las anchuras de línea pico. El agua fue suprimida con un vapor (pulsos de radiofrecuencia de potencia variable y retrasos de relajación) optimizados esquema de supresión. En todos los casos, la anchura del pico (anchura a media altura) del pico de agua era inferior a 30 Hz siguiente cuñas localizada, que se llevó a cabo mediante el uso de los ajustes de primer y segundo orden con FastMap. Un voxel cúbico de 2,0 x 2,0 x 2,0 mm
3 se coloca ya sea en el tumor o el tejido cerebral normal contralateral, al tiempo que maximiza la cantidad de tejido tumoral presente en el voxel en todo momento.
Para analizar los datos de MRS, se utilizó un programa Mathematica en la casa (versión 6.0, Wolfram Research, Champaign, IL, EE.UU.). Los espectros fueron escaladas en ppm calibrando contra el pico de agua (4,78 ppm). Los picos principales del metabolismo cerebral fueron identificados como: N-acetil aspartato (NAA) en 2,02 ppm, colina (Cho) en 3,22 ppm, la creatina (Cre) en 3,02 ppm, y los lípidos móviles a 1,3 ppm (Lip1.3) para el grupo de metileno (-CH
2-) y 0,9 ppm (Lip0.9) para el grupo metilo (-CH
3) en el tejido tumoral. Las mediciones de área de pico de los metabolitos se utilizaron para calcular las siguientes relaciones: NAA un tumor a otro Cho (NAA
t Cho
t /), tumor de Cho a (tejido normal) contralateral Cre (Cho
t /Cre
n), tumor de Cho con el tumor de NAA (Cho
t NAA
t /), Lip0.9 tumor para Cre contralateral (Lip0.9
t /Cre
n), y Lip1.3 tumor para Cre contralateral (Lip1.3
t /Cre
n).
imágenes de difusión ponderada.
Una secuencia DWI multi-corte axial de la corona que cubre el todo tumor se realizó mediante una secuencia planar de eco basado en la formación de imágenes de impulsos con los siguientes parámetros: TR = 4000 ms, TE = 51,1 ms, tamaño de la matriz = 128 × 128, grosor de corte = 1 mm, duración gradiente de difusión = 4 ms, la difusión separación en gradiente = 14 ms. Cinco imágenes se obtuvieron con diferentes escaladas de gradiente, lo que resulta en valores b de 100, 200, 500, 700, y 850 s /mm
-2. Los mapas de ADC se generaron para todas las rebanadas en el que se observó el tumor. El coeficiente de difusión aparente valores (ADC) se obtuvieron mediante la elaboración de un único retorno de la inversión a pulso a lo largo de la frontera del tumor normalizado a la contralateral normal del cerebro.
perfusión arterial spin-etiquetado.
Mapas
perfusión eran obtenido en un único segmento axial del cerebro se encuentra en el punto del eje rostro-caudal que el tumor tenía la mayor sección transversal. La geometría de la imagen era un 25,6 × 25,6 mm
2 campo de visión (FOV) de 2 mm de espesor, con un solo disparo de codificación ecoplanar sobre una matriz de 64 × 64. Se utilizaron un tiempo de eco (TE) de 13,5 ms, un tiempo de repetición (TR) de 18 s, y un tiempo de inversión (TIR) de 26,0 ms, y las imágenes no fueron sometidos a un promedio de tiempo. Para obtener contraste de perfusión, se utilizó el esquema de recuperación de inversión del flujo alterna. En pocas palabras, las imágenes de recuperación de inversión fueron adquiridas mediante una inversión de rebanada selectivo de la misma geometría que la rebanada de formación de imágenes o una rebanada concéntrico inversión no selectivo con la rebanada de formación de imágenes con un margen paquete rebanada de 5,0 mm. Para cada tipo de inversión, 22 imágenes fueron adquiridas con tiempos iguales de inversión de 26.0 ms a 8,426.0 ms (con un incremento de 400 ms entre cada TIR). (CBV los valores de flujo sanguíneo cerebral) se obtuvieron mediante la elaboración de un único retorno de la inversión a pulso a lo largo de la frontera del tumor normalizado a la contralateral normal del cerebro para obtener valores normalizados relativos CBF (rCBF). Los valores negativos CBF ASL se supone que es cero [45].
Gross y la histología microscópica
Las necropsias se realizaron en todos los ratones. El grado de tumor en la necropsia fue evaluada por examen macroscópico y microscópico del cerebro para cada animal de los grupos no tratados y tratados con OKN-007. Los tejidos cerebrales fueron fijadas en 10% formalina tamponada con fosfato, se incluyeron en parafina, seccionadas en serie a 4 m, y se tiñeron con hematoxilina eosina (H & amp; E). para el examen histológico
La inmunohistoquímica
inmunohistoquímica la tinción se realizó usando un inmunoteñidor automático (Leica, Bond-III, Leica, Buffalo Grove, IL) con los siguientes anticuerpos policlonales primarios: derivado de plaquetas alfa del receptor del factor de crecimiento (
α
PDGFR) (dilución 1: 1000 , policlonal de conejo, ab61219 clon, Abcam), decorina (dilución 1: 500, policlonal de conejo, LS-B clon 8177/45156), LSBIO LifeSpan Biosciences), heparán sulfato sulfatasa SULF2 (dilución 1: 100, policlonal de conejo, AV49338 clon, Sigma Aldrich), y CD31 (dilución 01:25, policlonal de conejo, ab28364 clon, Abcam, Ki-67 (1: 100 dilución, policlonal de conejo, PA5-19462 clon, Thermo Fisher Scientific, IL). Todos los anticuerpos se optimizaron inicialmente en tejidos de control y los controles positivos y negativos se procesaron en paralelo a las secciones de tejido.
IHC que alcanzaron el
Todos los centros de salud integrados fueron analizados utilizando el Sistema de Análisis de Imágenes ScanScope Aperio (Aperio, Vista, CA). PDGFR
α
, SULF2, y centros de salud integrados decorin se analizaron mediante un algoritmo Total de Píxeles positiva con el espectador Aperio ImageScope. Sólo las áreas que contienen tejido tumoral se analizaron para la expresión IHC. Áreas sin tejido tumoral y áreas con necrosis o significativos artefactos (por ejemplo, plegado de tejidos) se anula la selección y excluidos del análisis. El número de píxeles positivos de las regiones-de-interés (ROI) con alta expresión se divide por el número total de píxeles (negativas y positivas) de la zona analizada, y multiplicado por 100, para obtener el porcentaje de píxeles positivos.
densidad de microvasos (MVD, número de vasos por mm
2) y la media de área de la embarcación (MVA, Vascular área /2 + lumen área), utilizando CD31 como marcador, se determinaron utilizando un algoritmo de análisis de microvasos Aperio. Tres representante de la no superposición de las regiones de interés (ROI) para las muestras tumorales fueron seleccionados al azar, y el Ministerio del Interior y MVA fueron cuantificados para cada animal de los dos grupos tratados y tratados con NOC-007.
Un Análisis de Imágenes Aperio ScanScope también se utilizó el sistema para determinar el índice de marcaje KI-67 (Ki-67 LI). Tres regiones de interés con el mayor número de núcleos marcados se identificaron en cada caso. Ki-67 LI se determinó contando las células 1000 y expresando este como el número de células marcadas por 1000 células [46] para cada animal de los dos grupos no tratados y tratados-OKN-007. También se excluyeron las células marcadas adyacentes o dentro de las áreas necróticas, mientras contando el Ki-67 LI. Los medios y las desviaciones estándar de Ki-67 LI fueron determinados para cada grupo.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graph Pad Prism 6 (6 GraphPad Prism Software, San Diego, CA, ESTADOS UNIDOS). Todos los
p
valores & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Los volúmenes tumorales, relaciones de longitud pico de metabolito [(NAA
t Cho
t /), (Cho
t /Cre
n), (Cho
t NAA
t /), (Lip0.9
t /Cre
n) y (Lip1.3
t /Cre
n)], ADC normalizado, rCBF, Ki-67 LI y inmunoexpresiones de PDGFR
α
, fueron reportados SULF2, y decorina como media ± desviación estándar. Para el análisis estadístico, se utilizaron pruebas t de Student para muestras independientes (prueba t de dos colas) para evaluar las diferencias entre las medias de los ratones normales glioma, no tratados y tratados NOC-007 IC-pediátricos 3752GBM. De Kaplan-Meier curvas de supervivencia y un Log-rank (Mantel-Cox) prueba se utilizaron para comparar los tiempos de supervivencia entre los grupos tratados y no tratados NOC-007.
Resultados
macroscópica, histológica, inmunohistoquímicas y de resonancia magnética de la novela ortotópico de xenoinjertos de glioblastoma pediátrico (pGBM) modelo IC-3752GBM y los efectos de la NOC-007 para inhibir el crecimiento tumoral cultura IC-3752GBM se describen en este informe.
características
macro y microscópicas de el modelo IC-pGBM 3752GBM se presentan en la figura 1A-1E. Macroscópicamente los tumores se caracterizaron como un color gris amarillento, mal delimitada masa, con áreas multifocales de necrosis y hemorragia. El examen histológico reveló bien definidos, se neoplasia infiltrante no encapsulado con atipia marcada celular, alto índice mitótico, y áreas multifocales de necrosis y hemorragia.
(AB) fijados con formol y tejido IC3752 pGBM, caracterizado por ser un color gris amarillento y mal delimitada masa , con áreas multifocales de necrosis y hemorragia. (CE) El examen histológico reveló no estén bien definidos, y los tumores invasivos no encapsulados (E) que se caracterizan por atipia marcada celular, un alto índice mitótico (flechas negras) (C), y las áreas multifocales de necrosis (asteriscos) y hemorragia (signo más) ( RE). T = Tumor, B = normal del cerebro. Barra de escala = 200 m (C-D). Barra de escala = 400 micras (E).
supervivencia de los animales se evaluó mediante la comparación de los animales tratados-007 NOC con los animales no tratados (figura 2). En general, OKN-007 se encontró para aumentar significativamente la supervivencia de los animales (p & lt; 0,0223) (mediana de supervivencia de 25,5 días) en comparación con ratones portadores de tumores no tratados (mediana de supervivencia de 19,5 días). Los datos de supervivencia totales tratados con NOC-007 parecían representar dos cohortes de respuesta al tratamiento. Por ejemplo, se encontró que seis animales respondieron al tratamiento OKN-007 y demostraron tiempos de supervivencia significativamente más largos (
p
= 0,0002) (mediana de supervivencia de 33 días) en comparación con los animales no tratados (n = 12) . Por el contrario, no parecían otros seis ratones pGBM para responder a la terapia OKN-007, y no mostraron diferencia estadística (
p
= 0,3392) en comparación con el grupo no tratado. Los ratones tratados con OKN-007 no responde parecía tener una supervivencia media (19 días) que era similar a la mediana de supervivencia de los ratones portadores de tumor no tratados.
Hubo un aumento significativo en la supervivencia por ciento para todos los ratones tratados con OKN-007 (n = 12) (
p
& lt; 0,05) en comparación con los ratones no tratados portadores de tumores (n = 12). Sobre la base de las diferentes cohortes de respuesta, el grupo NOC-007-tratamiento se divide en NOC-007-R (sensible) y el NOC-007-NR cohortes (no sensibles). ratones NOC-007-R (n = 6) demostraron una supervivencia significativamente más largos (
p Hotel & lt; 0,001) en comparación con los animales UT (n = 12). Por el contrario, los ratones NOC-007-NR (n = 6) no mostraron diferencias estadísticas (
p Hotel & gt; 0,05) en comparación con el grupo de UT
Para el cálculo de todo el tumor. de volumen de algunos animales, se realizaron las imágenes potenciadas en 1 MIPYME T
y adquiridos antes (figura 3A) y 15 minutos después (figura 3B) de inyección de agente de contraste intravenoso (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, Nueva York, ESTADOS UNIDOS). La figura 3E muestra los volúmenes tumorales IC-3752GBM medios cuantitativos calculados a partir de las imágenes de RM. Se encontró que el grupo NOC-007-tratamiento integral para reducir significativamente los volúmenes del tumor (p = 0,0289) en comparación con los ratones no tratados (Figura 3E). Sobre la base de los datos de supervivencia que indicaba cohortes de tratamiento OKN-007 que responden y que no responden, el volumen del tumor también se separó en términos de la respuesta al tratamiento. Se encontraron seis animales de responder al tratamiento OKN-007 [OKN-007- (R)] y demostró tumores significativamente más pequeños (
p
& lt; 0,001) (Fig 3D) en comparación con los animales no tratados (n = 12 ) (figura 3C). También se encontró que seis ratones pGBM encontraron no responder [OKN-007- (NR)] para la terapia OKN-007 (basado a partir de los datos de supervivencia de los animales), mostró diferencia estadística (
p
= 0,7857) cuando en comparación con el grupo no tratado.
imágenes morfológicas ponderadas en T1 representante antes (a) y después de agente de contraste (Gd-DTPA) inyección (B) en ratones portadores de pGBM se muestran. (A) Antes de la administración de contraste el tumor apareció como una masa ligeramente hiperintensa y era difícil de demarcar la misma. (B) Quince minutos después de la inyección de contraste del IC3752 pGBM demuestra la mejora, la delimitación del tumor (línea discontinua de color amarillo). Las imágenes de RM ponderadas en T2 representativas de UT (C) y NOC-007 (D) tratados IC 3752 cerebros de ratón pGBM-cojinete. (E) El histograma cuantitativa para todos los ratones muestra que todos los ratones tratados con OKN-007 (n = 12) tenían una significativa disminución de volumen del tumor (p & lt; 0,05) en comparación con los ratones UT (n = 12). Seis animales respondieron al tratamiento OKN-007 [OKN-007 (R)] y demostró tumores significativamente más pequeños (
p
& lt; 0,0001) en comparación con los animales UT (n = 12). Sin embargo, no parecían otros seis ratones para responder pGBM [NOC-007 (NR)] para la terapia NOC-007, y no hubo diferencia estadística entre el grupo NOC-007 (NR) y UT. Los valores se representan como media ± desviación estándar. comparaciones de grupos: (1) vs UT-NOC 007 (total); (2) UT vs. OKN-007 (R); y (3) NOC-007 (R) vs NOC-007 (NR).
Para todas las otras investigaciones, grupos NOC-007- (R) y 007- NOC-tratamiento (NR) eran en comparación con los ratones portadores de tumores no tratados, ya que no todos los ratones fueron sometidos a evaluaciones
1H-MRS, DWI, las imágenes de perfusión o IHC.
valores 1H-MRS se obtuvieron en ratones desnudos atímicos normales (n = 7) y sin tratar (n = 6) y tratados con OKN-007 (n = 8) ratones con gliomas IC-3752GBM. Fig 4 muestra las regiones donde se colocó el voxel único de 8 mm
3 para
1H-MR espectroscopia en los cerebros de los ratones normales (Fig 4A) y ratones con gliomas IC-3752GBM (Fig 4B). La figura 4C muestra que los no tratados ratones IC-3752GBM pGBM demostró significativamente menor NAA
t /Cho
t (
p = 0,0001
) y superior Cho
t /Cre
n (
p = 0,0325
), Cho
t /NAA
t (
p = 0,0075
), Lip0.9
t /Cre
n (
p = 0,0363
) y los coeficientes Lip1.3
t /Cre
n (
p = 0,0009)
en comparación con el cerebro de los ratones sin timo normal. El Lip1.3
t /Cre
n (
p = 0,0395
), Lip0.9
t /Cre
n (
p = 0,0257
) , Cho
t /NAA
t (
p = 0,0167
), y Cho
t /Cre
n (
p = 0,0254)
proporciones fueron significativamente menor en el grupo OKN-007- (R) que pGBM no tratada en la fase final de la progresión tumoral. El grupo NOC-007- (R) mostró una NAA significativamente mayor
t /Cho
t (
p = 0,0492
) Relación de que el pGBM sin tratar. No hubo diferencia significativa entre el Cho
t /Cre
n (
p = 0,498
), NAA
t /Cho
t (p = 0,6912), Cho
t /NAA
t (
p = 0,4231
), y Lip0.9
t /Cre
n (
p = 0.6205)
relaciones del ratón normal cerebro en comparación con el grupo OKN-007- (R). El grupo NOC-007- (R) mostró una Lip1.3 significativamente mayor
t /Cre
n (
p = 0,0047
) Relación de que el cerebro de ratón normal. No hubo diferencia significativa entre el NAA
t /Cho
t (
p = 0,2071
), Cho
t /Cre
n (p = 0,7101), Cho
t NAA
t /(
p = 0,5362
), Lip0.9
t /Cre
n (
p = 0,7277
) y Lip1.3
t /Cre
n (
p = 0.5163)
relaciones del grupo no tratado en comparación con el grupo NOC-007- (NR).
lugares representativos del 2 x 2 x 2 voxels mm3 utilizan para realizar 1H-MRS en el cerebro de ratón normal (a) y de los ratones portadores de tumores IC3752 pGBM (B). (C) Los ratones no tratados IC3752 pGBM demostraron una proporción significativamente menor AEAC /Chot y (
p = 0,0325
), ratios Chot /naat, Lip0.9t /CREN y Lip1.3t /CREN mayores Chot /CREN cuando en comparación con los cerebros de ratones atímicos normales. El Lip1.3t /cren, Lip0.9 t /cren, CHOT /ratios de Naat, y Chot /CREN fueron significativamente menores en el grupo NOC-007- (R) en comparación con pGBM sin tratar en la fase final de la progresión del tumor. El grupo OKN-007- (R) mostró una relación de Naat /Chot significativamente mayor que el pGBM sin tratar. No hubo diferencia significativa entre el Chot /Cren, Naat /Chot, Chot /Naat y proporciones de Lip0.9t /CREN para los cerebros normales de ratón en comparación con el grupo OKN-007- (R). El grupo OKN-007- (R) mostró una proporción significativamente mayor Lip1.3t /Cren que el cerebro de ratón normal. No hubo diferencia significativa entre la AEAC /Chot, Chot /cren, Chot /naat, Lip0.9t /cren y relaciones Lip1.3t /CREN para los no tratados en comparación con los grupos NOC-007- (NR). Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas (*
p
& lt; 0,05; *** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001; **** p & lt; 0,0001). comparaciones de grupos: (1) normal vs UT; (2) UT vs. OKN-007 (R); (3) NOC-007 (R) vs NOC-007 (NR); (4) normal vs. NOC-007 (R); (5) vs UT-NOC 007 (NR); y (6) normal vs. NOC-007 (NR).
En nuestro estudio, con el uso de DWI, el grupo sin tratamiento mostraron significativamente mayor (
p = 0,0060
) (1,161 ± 0,04538, n = 11) valores de ADC normalizados en las regiones del tumor en comparación con los cerebros de los ratones normales (1,003 ± 0.009358, n = 6) (Fig 5A-5G). El grupo NOC-007-R tratados tenían valores de ADC significativamente mayor normalizados (1,296 ± 0,04141, n = 7) en comparación con el grupo sin tratamiento (p = 0,0432), o los cerebros de los ratones normales (
p = 0,0003
).