Extracto
transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) se activa de forma constitutiva en muchos tipos de cáncer en la que promueve el crecimiento , inflamación, angiogénesis e inhibe la apoptosis. Hemos demostrado que STAT3 se activa constitutivamente en el cáncer gástrico humano, y que la actividad transcripcional STAT3 impulsada por IL-11 induce crónica tumourigenesis gástrico en el gp130
757FF modelo de ratón de desarrollo de cáncer gástrico. Aquí nos muestran que el tratamiento de células humanas de cáncer con AGS gástricas la Janus quinasa (JAK) inhibidor WP1066 de la dosis, e inhibe la fosforilación dependiente del tiempo STAT3, en conjunción con una reducción de la fosforilación de JAK2, la proliferación reducida y aumento de la apoptosis. Además, la aplicación de WP1066 intraperitoneal durante 2 semanas, redujo el volumen del tumor gástrico en un 50% en el gp130
757FF coincidente ratón con reducción de la activación de JAK2 y STAT3 en comparación con, controles de camada tratados con vehículo. Los tumores gástricos de ratones tratados WP1066- habían reducido la inflamación polimorfonuclear, coincidente con la inhibición de numerosas citoquinas proinflamatorias incluyendo IL-11, IL-6 y IL-1β, así como factores de crecimiento Reg1 y anfirregulina. Estos resultados muestran que WP1066 puede bloquear la proliferación, reducir la inflamación e inducir la apoptosis en las células tumorales gástricas mediante la inhibición de la fosforilación de STAT3, y que muchas citoquinas y factores de crecimiento que promueven el crecimiento del tumor gástrico están reguladas por mecanismos de STAT3-dependiente. WP1066 puede servir de base para futuras terapias contra el cáncer gástrico
Visto:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) La inhibición de la JAK2 /STAT3 Camino reduce el crecimiento del cáncer gástrico
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993
Editor: Rupesh Chaturvedi, Escuela de Medicina de la Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Enero, 2014; Aceptado: April 1, 2014; Publicado: May 7, 2014
Derechos de Autor © 2014 Judd et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por fondos de; NHMRC proyecto Australia (www.nhmrc.gov.au) de subvención#509165 NIH /NCI EE.UU. (nih.gov; www.cancer.gov) el melanoma SPORE CA093459-06 P50, NIH /NCI EE.UU. (nih.gov; www.cancer. gov) SPORE cerebro 2 P50 CA127001-06. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Waldemar Priebe tener patentes y tiene un interés financiero en el desarrollo del compuesto de la siguiente WP1066 ; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Compuestos Levitzki para el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares. Une la patente WO /2005/058829 12/01/2004. Tenga en cuenta también que los autores han proporcionado una declaración enmendada del Conflicto de intereses en relación con una patente sobre WP1066 realizada por W. Priebe. Los autores también declaran que "esto no altera nuestra adhesión a las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido".
Introducción
De los siete transductor de señales y activador de la transcripción miembros de la familia (STAT) , STAT3 se ha implicado más consistentemente en una gama de cánceres comunes en seres humanos, incluyendo; pulmón, de mama, de ovario, de próstata, de colon y [1], [2], [3], [4]. Esto también es cierto en el cáncer gástrico humano [5], [6], [7] en el que STAT3 activación por fosforilación crónica en tirosina (Y) residir 705 se ha relacionado con un aumento del crecimiento, la angiogénesis, la invasión y la metástasis del cáncer primario [ ,,,0],6], [7], [8]. Por lo tanto, la inhibición de la actividad transcripcional STAT3 en el cáncer gástrico humano puede proporcionar un medio posible de reducir la alta morbilidad y prolongar la vida entre los pacientes con cáncer gástrico en todo el mundo.
En la ausencia de mutaciones funcionales en el gen STAT3, STAT3 actividad aberrante es inducida por la actividad persistente de tirosina quinasas aguas arriba, y /o por unscheduled- o sobre-expresión de los ligandos estimuladores [9], [10], [11]. Esto está claramente ejemplifica en la gp130
757F /F modelo de ratón de desarrollo de cáncer gástrico, en el que un Phe por Tyr sustitución en la posición 757 en el brazo intracelular de la IL-6 de la familia de señalización gp130 receptor impide simultáneamente SHP2 y SOCS3 de unión , lo que resulta en la inhibición de Ras /MAP quinasa de transducción de señales, y la hiperactivación de STAT3 por la fosforilación constitutiva [23], [24], [26]. Recientemente nosotros y otros han demostrado que en los tumores gástricos, aumentos significativos en la transcripción coinciden con el aumento de expresión del ligando gp130 IL-11 en modelos de cáncer y de ratón gástricos humanos de esta enfermedad [5], [12], [13]. En este último IL-6 es prescindible, pero IL-11 es absolutamente necesario para la génesis tumoral [12], [13]. Además, la IL-11 /STAT3 se ha demostrado ser un importante motor de la gastritis atrófica, la primera lesión precancerosa del estómago después de la infección crónica por la bacteria
Helicobacter pylori
[14].
hasta la fecha, numerosos quinasas se han reportado para inducir la actividad STAT3 después de la unión ligando /receptor, sin embargo, sólo JAK1 y cuenta JAK2 para la fosforilación de STAT3 en acoplamiento con IL-11 /receptor gp130 complejo [15] y de éstos IL-11 /gp130 se une preferentemente JAK2 [16]. Estas observaciones sugieren que JAK2 y STAT3 presentes objetivos prometedores para el diseño de antagonistas terapéuticos para suprimir la IL-11 /señalización en el cáncer gástrico humano STAT3.
Recientemente, el ácido cafeico derivado WP1066, estructuralmente relacionada con el inhibidor de la baja potencia de la tirosina quinasa AG490 , se ha demostrado que es un inhibidor muy potente de la vía JAK2 /STAT3 en glioma transformado cerebro [17] y las líneas celulares de carcinoma renal [18], que conduce a la inhibición del crecimiento y la inducción de las vías de pro-apoptóticos clásicos. Además, es eficaz WP1066
in vivo
contra melanomas malignos y leucemias altamente que son positivas para la mutación JAK2 V617F-+, que promueve la activación constitutiva JAK2 quinasa [19], [20], [21], [22 ]. Estudios no publicados indican que WP1066 no es un inhibidor competitivo de ATP, y puede bloquear la expresión de JAK2 y STAT3 fosforilado; Además, p-STAT3-Y705 puede inhibirse independientemente del estado de JAK2. Por lo tanto, WP1066 presenta una oportunidad única para inhibir tanto p-JAK y p-STAT3, y posteriormente de forma potente bloque JAK2 /STAT3 vía de señalización y la actividad transcripcional STAT3.
Para probar la idea de bloqueo dual de JAK2 y la activación de STAT3 en el estómago y el posterior desarrollo de cáncer gástrico, hemos utilizado tanto
in vitro
y
in vivo
enfoques para evaluar si WP1066 puede ralentizar o bloquear el crecimiento del tumor gástrico mediante la inhibición de la actividad /STAT3 JAK2, y otras vías de señalización oncogénicas estrechamente relacionados. Aquí mostramos que WP1066 inhibe eficazmente la fosforilación de STAT3, e induce la apoptosis en una línea celular de cáncer gástrico, y que puede inhibir el crecimiento del tumor gástrico
in vivo
mediante el bloqueo de la inducción de genes clave STAT3-regulado.
Materiales y Métodos
Preparación y almacenamiento de inhibidores de quinasa
inhibidor WP1066 fue desarrollado y sintetizado por Waldemar Priebe y compañeros de trabajo en la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, y actual de las acciones fue suministrado por cortesía de Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, EE.UU.. Las acciones se volvieron a suspender en Hybri-Max DMSO y se almacenaron a -20 ° C. La acción era un solo uso, y no volver a congelarse después de la descongelación.
in vitro Cultura y
células AGS (ATCC, Manassas VA, EE.UU.) las células se mantuvieron en medio completo que contiene RPMI + Glutamax ( Gibco Invitrogen Life Sciences, OR, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 50 UI de penicilina a 37 ° C en 5% de CO
2-95% de aire.
Western Blot
los extractos de proteína se prepararon ya sea con el reactivo Trizol (Life Technologies, Vic, Australia) según las instrucciones del fabricante y pellets de proteína se resuspendieron en 1% de dodecilsulfato de sodio que contiene 2 mmol /l Na
3Vo
4 o RIPA buffer. Alícuotas (30 mg) se sometieron a electroforesis en gel de sulfato /poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. Las membranas se bloquearon y se incubaron a 4 ° C durante la noche en leche descremada con los siguientes anticuerpos; STAT3, Py (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, PS (473) AKT, JAK2, Py (1007), Y (1008) JAK2 (Señalización celular,#9132,#9134S,#9131,#9102#4377,#9272,#4058,#3752,#3751,#3229,#3771), GAPDH (Abcam#9485). Las membranas se incubaron con anticuerpo secundario peróxido de conjugado (Dako, policlonal de conejo anti porcina, HRP conjugado,#P0399) y se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Para el análisis de las bandas se cuantificaron utilizando el sistema de software Quantity One (Biorad) y las proteínas fosforiladas expresadas como una proporción de GAPDH de una membrana por duplicado. Al menos n = 8 muestras fueron evaluados por cualquiera de los tratamientos.
Recuento celular por Haemocytometry
Las células se sembraron a 5 x 10
4 células /ml en formato de 24 pocillos en medio completo y se dejaron crecer en reposo durante 24 horas. Las células fueron tratadas con la concentración apropiada de WP1066 o DMSO como control para 0-360 min. Después las células se desalojaron de tratamiento por tratamiento con tripsina-EDTA al 0,25% (Sigma), se tiñeron con azul de tripano al 0,4% (Sigma) a una dilución 1:01 durante 5 minutos a 4 ° C, y se contaron en un hemocitómetro.
diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) tinción
Para etiquetar células AGS con CFSE, las células se desalojaron por tratamiento con tripsina-EDTA al 0,25% (Sigma) y se resuspendieron en precalentada /0,1% BSA PBS a una densidad de 1 × 10
6 células /ml. 10 CFSE mM colorante (Invitrogen) se preparó según el protocolo del fabricante, a continuación, 5 l /ml se añadió y se mezcló completamente mediante una inversión para garantizar el etiquetado homogénea de células. Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 10 minutos, se inactivó mediante la adición de 5 volúmenes de medios de enfriado con hielo y se incubaron durante 5 minutos en hielo. a continuación, las muestras se lavaron 5 veces en los medios y se sembraron a 2 x 10
5 células /pocillo (placas de 6 pocillos). Una muestra de células se tomó después de la siembra y se marcó con 100 g /ml de yoduro de propidio (PI) y se analizó por citometría de flujo para la uniformidad y la intensidad de etiquetado. Las células fueron cultivadas en medio completo durante 48 horas después de que fueron tratadas con o sin WP1066 apropiado (5 mM) a 37 ° C con 5% de CO
2 95% de aire durante 18 horas. Las células fueron tripsinizadas como anteriormente y se resuspendieron en medio completo, marcado con 100 mg /ml PI, y se analizaron por citometría de flujo en 488 ηM. Los datos se registraron utilizando la diva BD FACS (BD Biosiences) paquete de software y analizado por Modfit LT paquete de software (VSH).
Anexina V tinción
p>
5 células /pocillo en placas de 6 pocillos con DMSO (control de vehículo), o WP1066 (5 M), o etopósido (200 micras; control positivo) a 37 ° C con 5% de CO
2 95% aire en reposo durante 24 horas. Las células se trataron entonces de la siguiente manera; se lavó en PBS enfriado en hielo, tripsiniza que el anterior, y la densidad de células determinado por haemocytometry antes de la resuspensión en tampón de unión de Anexina a 1 × 10
6 células /ml. 100 l de esta preparación fue tomada, y se incubaron con 5 l de componente A (Anexina Fluor 488 componente V anexina, HEPES 25 mM, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 0,1% de albúmina de suero bovino) y 1 mg /ml de PI durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se mezclaron a continuación con 400 l de tampón de unión Anexina y se analizaron por citometría de flujo. controles apropiados +/- componentes de la reacción estaban preparados para ajustar el sesgo en la compuerta. Los datos se registraron utilizando la diva BD FACS (BD Biosiences) paquete de software.
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Código Australiano para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7
ª edición), y después de la aprobación del Comité de Investigación infantil Murdoch Instituto de Ética Animal (aplicación#A583). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar las molestias en estos procedimientos mínimamente invasivos.
in vivo Los experimentos
gp130
ratones 757F /F se han descrito anteriormente [23]. Brevemente, los tumores antrales discretas desarrollan por 4 semanas de edad y crecen rápidamente hasta aproximadamente 12 semanas. Se recapitulan las características de desarrollo de tipo intestinal adenocarcinoma gástrico, incluyendo la invasión de la submucosa, pero no metastasise [24]. Los animales fueron alojados en una instalación SPF en el Instituto de Investigación Infantil Murdoch y confirmaron que estar libre de
Helicobacter pylori
. Se evaluaron tres grupos de ratones para el desarrollo de tumores: 1) 8 semanas de edad gp130
ratones 757F /F que no recibieron tratamiento (n = 10); 2) gp130
ratones 757F /F que recibieron WP1066 de 8 a 10 semanas de edad (n = 10); y 3) gp130
ratones 757F /F que recibieron vehículo DMSO de 8 a 10 semanas de edad (n = 8). Antes de la experimentación todos los animales fueron evaluados para el bienestar, se pesaron y volúmenes de tratamiento calculado en consecuencia. Los animales control recibieron volúmenes equivalentes de vehículo DMSO a los animales tratados con WP1066. Los ratones recibieron 2 inyecciones intra-peritoneales iniciales de WP1066 a 10 mg /kg cada 48 horas para aclimatarse a los efectos del tratamiento, a continuación, recibió 5 inyecciones de WP1066 a 20 mg /kg cada 48 horas para completar el régimen de 2 semanas. sitios de inyección intra-peritoneal se alternaron a través de cuatro cuadrantes del abdomen de los ratones. Al final del experimento, los ratones fueron sacrificados y estómagos resecados para la fotografía y el tejido colección.
macroscópicos e histológicos de Evaluación
Los estómagos fueron disecados rápidamente a lo largo de la curvatura menor, cubrió a cabo, fotografiado y fijado en el 4% de paraformaldehído tamponado antes de procesar. Secciones de parafina (4 m) se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). El análisis morfométrico se realizó utilizando el software ImageJ de código abierto (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Para mediciones de área, las imágenes de la mucosa gástrica se esbozaron manualmente con la herramienta de dibujo de software y el programa de cuantificación utilizado para generar mediciones
En vivo
inmunohistoquímica & amp.; La cuantificación
El análisis inmunohistoquímico se realizó con anticuerpos para Ki-67 (Pharmingen#550609) y se activa la caspasa 3 (Señalización Celular Tecnología#9961). La recuperación del antígeno se llevó a cabo por las secciones de ebullición durante 30 minutos en ácido cítrico 10 mM (pH 6,0). La tinción se completa con los anticuerpos apropiados especies específicas secundario biotinilado (Dako, Dinamarca), avidina y peroxidasa de rábano picante biotinilado macromolecular compleja (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3'-diaminobencidina (Sigma, St Louis, MI) y contratinción con hematoxilina. Para Ki-67 cuantificación, un observador ciego contado número de células teñidas por la glándula en múltiples secciones por animal usando ImageJ como antes. Los datos se expresaron como el número Ki-67 células positivas por glándula. Para caspasa 3 cuantificación, un observador ciego contó el número de células teñidas por área de mucosa en 4 áreas aleatorias de antro bien orientado por animal usando ImageJ como antes. Los datos se expresaron como el número caspasa 3 células positivas por unidad de superficie de la mucosa
Análisis morfométrico semi-cuantitativa de la inflamación
La inflamación se evaluó mediante microscopía de una manera ciega en H & amp;. E-manchado secciones. tejidos tumorales antrales se analizaron y un mínimo de 3 tiras por animal (n = 7) recibieron una puntuación semicuantitativa de acuerdo con el grado de células inflamatorias desde el mínimo hasta el máximo = 0 = 3. linfoplasmocítico y polimorfonucleares infiltrado se evaluaron de forma independiente. Los valores medios se compararon para el análisis estadístico.
Análisis en tiempo real (Q)-PCR
El ARN se extrajo con el reactivo Trizol (Life Technologies, VIC, Australia) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (3 g) se transcribió de forma inversa en ADNc usando Moloney virus de leucemia murina transcriptasa inversa (Promega, Madison, WI) cebado con 0,3 g de oligo (dT). cebadores Q-PCR fueron diseñados utilizando Primer Express (Applied Biosystems) (Tabla 1). SYBR química verde (Applied Biosystems) se utilizó con L32 como el normalizador. Las condiciones de PCR fueron 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 15 s; las reacciones se llevaron a cabo en una máquina Applied Biosystems AB7500 RT PCR. Los resultados fueron analizados utilizando el software detector de secuencia, y se determinaron diferencias veces en relación con el método ΔΔCt como se describe por el fabricante.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± error estándar de la media. Los valores obtenidos a partir del análisis cuantitativo de la expresión génica o el número de células teñidas se comparó entre las muestras por ANOVA, y donde se encontró una diferencia estadísticamente significativa grupos individuales se analizaron adicionalmente con el estadístico paramétrico o no paramétrico apropiado utilizando el paquete estadístico Sigmastat. La significación estadística se definió como p = 0.05.
Resultados
WP1066 Suprime rápidamente fosforilada Y (705) y STAT3 induce la fosforilación de ERK1 /2 en células AGS
El JAK- STAT vía y la vía ERK1 /2 son los dos principales vías de transducción de señales aguas abajo de gp130. Estas dos vías tienen efectos reguladores recíprocos e inverso el uno del otro, mejor demostrado por la regulación negativa de pSTAT3 después de ERK1 /2 activación [47].
WP1066 experimentos de dosis-respuesta se llevaron a cabo mediante el tratamiento de células AGS con 0 , 1, 2 o 5 M WP1066 de 60 min y la fosforilación de medición de JAK2, STAT3, ERK1 /2 y SHP-2. Como era de esperar, pJAK2 fue fuertemente inhibida por WP1066 en todas las concentraciones ensayadas y por & gt; 80% a 5 mM. 5 M WP1066 también dio la inhibición máxima de pSTAT3 y la activación recíproca de pERK1 /2 (Fig. 1A) con una reducción de STAT3 total al 5 micras o mayores concentraciones (datos no mostrados). Coincidente con el aumento de pERK, la activación pSHP2 era dependiente de la dosis después de la administración mejorada WP1066 (Fig. 1A).
A. Dosis-respuesta: células AGS se trataron con WP1066 en 0, 1, 2 y 5 M durante 60 min y los extractos de inmunotransferencia con anticuerpos específicos para (i) pJAK2 y JAK2; (Ii) pSTAT3 y STAT3; (Iii) pERK1 /2 y ERK1 /2; (Iv) pSHP2 y SHP2. Los datos también se expresó como una relación de la fosforilado al producto de proteína total en cada caso. Los resultados de 3 experimentos se muestran cocientes de DO como media ± error estándar (SE). se muestra la significación estadística para cada tratamiento en comparación con 0 M WP1066 si p & lt; 0,05. B. Tiempo-curso: células AGS se trataron como en Fig. 1A, pero con 5 M WP1066 de 0, 15, 30, 60, y 180 min. Los datos se trató como para la Fig. 1A.
Para los estudios de tiempo-por supuesto, las células AGS fueron tratados durante 0-360 minutos con 5 M WP1066 y la fosforilación de JAK2, STAT3, ERK1 /2 y SHP-2 fueron analizados por Western Blot ( la Fig. 1B). WP1066 tratamiento dio lugar a una rápida inhibición de la pJAK2, con una caída del 75% en 30 min y un 90% de disminución máxima de 60 minutos. Después, las células se recuperaron y se devuelven a la fosforilación basal JAK2 por 360 min. El patrón de disminución de la activación de STAT3 reflejaba la de la fosforilación de JAK2. Por el contrario, ERK1 /2 fosforilación se incrementó marcadamente en respuesta al tratamiento WP1066, con un aumento del 250% en 15 min, y un máximo incremento de 460% en 60 min, antes de volver a los niveles basales de 360 min. activación SHP2 siguió muy de cerca los cambios en la expresión de ERK con la inducción máxima a 60 min.
WP1066 Inhibe AGS Crecimiento a través de supresión de la proliferación e inducción de apoptosis
STAT3 activado es un conductor establecida de células de cáncer gástrico humano crecimiento y la proliferación [5], y prolongada activación de ERK1 /2 induce la apoptosis de las células epiteliales gástricas [25]. Después de haber demostrado que regula WP1066 STAT3 y la señalización ERK1 /2 de una manera recíproca, si la prueba también puede perturbar el crecimiento celular e inducir la apoptosis de las células AGS.
El tratamiento de células AGS con 5 M WP1066 (Fig. 2A ) resultó en una reducción sustancial en el número de células en relación al DMSO controles (DMSO; 100% ± 3,14 vs. WP1066; 36,02% ± 3,18, p & lt; 0,05). Para determinar si esta reducción en el número de células era debido a la proliferación alterada de células o apoptosis, o una combinación de ambos, CFSE y Anexina V tinción se realizó en las células tratadas. células AGS tratados con WP1066 se marcaron más intensamente con CFSE que los tratados con DMSO, la evidencia de reducción del número de divisiones celulares y por lo tanto la proliferación (Fig. 2B). Además, una mayor proporción de células AGS tratados con WP1066 se marcaron con anexina V (Figura 2C) en comparación con las células tratadas con DMSO, lo que demuestra que la apoptosis también inducida WP1066 en células AGS (WP1066; 1,3 veces mayor, p = 0,049).
proliferación: A. células AGS fueron tratados con WP1066 a las 5 M durante 18 horas, se tiñeron con azul células viables y de tripano contados. Los datos se expresan como el porcentaje de células viables en comparación con el vehículo solo. N = 3, media ± SE. seguimiento B. CFSE se utilizó para medir los cambios en la proliferación de células AGS después del tratamiento con WP 1066. Los datos de fluorescencia brutos recogidos se muestra en comparación con controles de DMSO durante un experimento representativo. Apoptosis: C. Las células AGS tratadas durante 24 horas con DMSO (control de método), WP1066 (5 mM) o etopósido (200 micras; control positivo) y las células adherentes se tiñeron con Anexina V después se contaron manualmente. Los datos se expresan como el cambio veces en comparación con vehículo DMSO a partir de un experimento representativo. * P = 0,047.
WP1066 Bloques gástrico tumor Crecimiento en gp130
757FF ratones por represión de la proliferación de células del tumor y el aumento de la apoptosis
gp130
ratones desarrollan 757FF distal tumores de estómago que se caracterizan por elevada gástrico IL-11 impulsado activación STAT3 [12], [13]. Desde pJAK2 y p-STAT3 son bloqueados por WP1066
in vitro
, hemos probado si WP1066 también bloquearía el desarrollo del tumor gástrico
in vivo
. El tratamiento de la gp130
ratones 757FF 3 veces por semana durante 2 semanas con /kg WP1066 reducido significativamente el crecimiento del tumor gástrico 10-20 mg por 47% a partir de 42,11 ± 3,21 mm
2 a 22.36 ± 3.64 mm
2 ( p & lt;. 0,05) (Fig 3A-D). los tumores tratados con DMSO no eran diferentes a los tumores observados en ratones de 8 semanas, la edad en que comenzó el tratamiento WP1066, confirmando que el crecimiento del tumor gástrico es relativamente estable a partir de 8-10 semanas [27], y que el tratamiento WP1066 realmente causa la regresión del tumor en lugar de estasis (Fig. 3A-D).
gp130
ratones 757FF (8 semanas de edad) fueron tratados ip con 10 mg /kg de WP1066 o DMSO dos veces con un intervalo de un día entre dosis, seguido de dosis de 20 mg /kg cada 2 días durante 2 semanas. tumores en ratones antrales 8 semanas sin tratar (A) y los controles del vehículo tratados con DMSO 10 semana (B) no eran diferentes en la zona media, sin embargo el tratamiento WP1066 resultó en tumores ~ 50% más pequeño (C). Esto fue confirmado por la morfometría cuantitativa (D), donde los tumores antrales fueron significativamente menores en los ratones WP1066 comparación con el 10 W.O. controles de DMSO y 8 W.O. ratones no tratados (n = 7-10; p & lt; 0,05). El efecto de WP1066 sobre la proliferación celular se evaluó por tinción de secciones con un anticuerpo para Ki-67. Hubo una disminución significativa en el número de Ki-67 células positivas por glándula en los WP1066 ratones tratados (F) en comparación con los controles (E) y cuantificado gráficamente (G). El número de células apoptóticas cuantificados después de la caspasa 3 tinción de secciones antrales de un control de DMSO (H) y WP1066 ratón (I), y se cuantificó contando las células teñidas /mm
2 de la mucosa gástrica (J).
Para determinar si la proliferación fue alterado en los tumores gástricos, Ki-67 células positivas /glándula se cuantificaron en la cohorte tratada. tratamiento WP1066 redujo significativamente la proliferación de células epiteliales gástricas (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 células teñidas /glándula, p & lt; 0.05; Fig. 3E-G) que demuestra que WP1066 puede inhibir el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la proliferación celular. Para evaluar los efectos de WP1066 sobre la apoptosis de las células tumorales, las secciones de la WP1066 o cohortes tratadas con DMSO se tiñeron con un anticuerpo contra la caspasa 3 escindida, un marcador de la muerte celular apoptótica (Fig. 3H, I). Había perfiles significativamente más apoptóticas en los tumores WP1066 tratados que en los controles, lo que demuestra un efecto pro-apoptótica clara de WP1066 (WP1066 25.25 ± 5.32 vs DMSO 2.65 ± 0.76 células teñidas /mm
2 mucosa, p & lt; 0,05; Fig. 3J ).
WP1066 se dirige específicamente a JAK2 y STAT3 fosforilación para suprimir la génesis tumoral gástrico en gp130
ratones 757FF
Debido a gp130
ratones desarrollan tumores 757FF en respuesta a la activación constitutiva de gp130 [20] , hemos probado si WP1066 suprimió las vías de señalización corriente abajo
in vivo.
tratamiento WP1066 durante 2 semanas resultó en una disminución del 25% en la cantidad relativa de STAT3 total en la mucosa antral en comparación con los grupos tratados con DMSO (Fig. 4A) . La cantidad de JAK2 totales, Akt y ERK1 /2 no fue cambiado por el tratamiento WP1066. Esto sugiere que el tratamiento crónico de gp130
ratones 757FF con WP1066 suprime la expresión de STAT3.
gp130
ratones 757FF (8 semanas de edad) se trataron como en Fig. 3 y antrales extractos cuantificados por Western blot para JAK2 totales, STAT3, ERK1 /2 y AKT (A) y pJAK2, pSTAT3, pERK1 /2 y pAKT (B). Las membranas se hibridaron simultáneamente con un anticuerpo GAPDH como control de carga. La intensidad de la señal se cuantificó por densitometría y se expresó como un porcentaje de la señal en relación con los controles estandarizados a la intensidad de la señal de GAPDH. n = 6-10; * Significativamente (p & lt; 0,05)
El análisis por inmunotransferencia de la activación de la señalización demostraron una reducción significativa en pJAK2 (80,12% ± 5,70 de control de DMSO), pY705 STAT3 (26,84% ± 7,2 de control de DMSO; Fig. . 4B) y pERK1 /2 (72.66% de control ± 5.23.of DMSO; Fig. 4B). la fosforilación de AKT no fue cambiada por el tratamiento WP1066. reducción de la activación de JAK2 y STAT3 es consistente con el
in vitro
datos y acciones conocidas de la WP1066.
WP1066 suprimió la respuesta inflamatoria en la mucosa antral de gp130
757FF ratones
Desde una respuesta inflamatoria crónica del estómago es crucial para el desarrollo del tumor [27], hemos probado si parte del modo de acción de WP1066 es suprimir la respuesta inflamatoria STAT3 mediada, que normalmente contribuye a la progresión del tumor. El análisis histológico reveló que la infiltración polimorfonuclear en el antro de ratones tratados WP1066 fue significativamente menor que en los ratones de control (Fig 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p & lt; 0,05), mientras que infiltrado linfoplasmocítico no fue diferente entre los dos grupos (Fig 5B;. DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p & gt; 0,05).
gp130
ratones 757FF (8 semanas de edad) se trató como para la Fig. 3, tenían tejido del estómago para histología antral tomada y la expresión de genes proinflamatorios por Q-PCR después de la extracción de ARNm. El tratamiento de gp130
ratones 757FF con WP1066 causó una reducción significativa (p & lt; 0,05) en el infiltrado polimorfonuclear (A) en el estómago antral, pero infiltrado lymphoplaysmocytic se mantuvo sin cambios (B). Expresión génica en relación con el ama de llaves GAPDH para IL-6 (C), IL-11 (D), IL-1 α (E), IL-1β (F) y la COX-2 (G), se cuantificó por el método ΔΔCT . Todo n = 8; * P & lt;. 0,05 en comparación con los controles de DMSO
Dado que la inflamación gástrica es típicamente mediado por un pequeño número de citoquinas y enzimas proinflamatorias clave, que mide la expresión de un grupo selecto de estos por Q- PCR en DMSO y estómagos WP1066 tratados. La expresión de todos los mediadores pro-inflamatorios con la excepción de IFN, TNF y iNOS se inhibió significativamente por el tratamiento WP1066 de la siguiente manera; IL-6 (Fig. 5C; 6,0 ± 2,6 veces), IL-11 (Fig 5D;. 8,7 ± 3,4 veces), IL-1α (Fig 5E;. 10,9 ± 4,3) veces), IL-1β (Fig 5F. ; 3 ± 0,9 veces) y COX2 (Fig 5G;. 2,94 ± 1,05). Por lo tanto la inhibición de la actividad STAT3 WP1066 y la progresión del tumor fue debido en parte a la infiltración de polimorfonucleares reducida y reduce la transcripción STAT3 dependiente de IL-6 pro-inflamatoria,, IL-1a, IL-1ß y COX2 genes IL-11.
WP1066 inhibió la expresión de anfirregulina en el antro Mucosa de gp130
Ratones 757FF
el efecto del tratamiento WP1066 en la expresión de ligandos de factores de crecimiento conocidos por jugar un papel en el crecimiento y la diferenciación del estómago y en el desarrollo de la gp130
se evaluó también tumores 757FF. WP1066 inhibió la expresión de anfirregulina (1,85 ± 0,60 veces, p & lt; 0,05), pero no HB-EGF (Fig. 6) en la mucosa antral de los ratones tratados. Además, el estómago proliferativa ligando y el gen STAT3 reguladas Reg1 mostró una tendencia inhibidora fuerte después del tratamiento WP1066 en comparación con el antro control de DMSO (Fig 6;. P = 0,069).
gp130
ratones 757FF ( 8 semanas de edad) se trataron como para la Fig. 5. ARNm para Reg1, anfirregulina y HB-EGF se analizaron mediante análisis Q-PCR y se cuantificó por el método ΔΔCT. ligandos de EGFR fueron regulados diferencialmente de modo que el ARNm anfirregulina se redujo significativamente en los ratones tratados WP1066 comparación con los controles (p & lt; 0,05), mientras que HB-EGF se mantuvo sin cambios. El ligando no REGI EGFR mostró una fuerte tendencia a la disminución en la expresión (p = 0,069). Todo n = 8; * Estadísticamente diferentes (p = 0.05).
Discusión
En este estudio hemos demostrado que inhibe WP1066 dosis-dependiente la ruta en células de cáncer gástrico humano (AGS) de señalización JAK2 /STAT3 , con la consiguiente reducción del 60% en la proliferación celular, y un menor aumento de la apoptosis. El mecanismo para esto es probablemente debido a la inhibición dual de las formas fosforiladas de JAK2 y STAT3 reduciendo así STAT3 actividad transcripcional, como se ha demostrado para varias líneas celulares de cáncer, incluyendo glioma [17], [28], [29], la leucemia mieloide [ ,,,0],30], y melanoma [20]. Por otro lado, la aplicación WP1066 resultó en un aumento recíproco en ERK1 /2 coincidente con un aumento de la activación pSHP2, la fosfatasa responsable de la activación de la vía de señalización de la quinasa Ras /MAP. Una observación similar con respecto a la activación de ERK se ha hecho para otras líneas celulares de cáncer derivadas de carcinoma renal [18], y glioma [28]. Por lo tanto, cruz de regulación de STAT3 y ERK mediada por la señalización aguas abajo de las citocinas IL-6 de la familia parece ocurrir comúnmente en unas gamas de tejidos y líneas celulares [31].
WP1066 también fue eficaz cuando se administra
in vivo, donde se bloqueó la activación de STAT3 (75%) en gp130
tumores antrales 757FF ratón, y también redujo la proteína total STAT3, lo que sugiere que puede disminuir la expresión de la
Stat3
en el gen estómagos de los ratones tratados. Esto es apoyado por la existencia de sitios de consenso para STAT3 activada vinculante para el
Stat3
promotor, con la activación de la
Stat3
gen mutante como se demuestra utilizando
Stat3
de promotor-indicador
H.