Extracto
Muchas líneas celulares derivadas de tumores, así como líneas celulares transformadas son mucho más sensibles a V inhibidores de la ATPasa que sus homólogos normales. No se conocen los mecanismos moleculares que subyacen a estas diferencias en la sensibilidad. Utilizando los datos globales de expresión génica, se muestra que las respuestas más sensibles a las células HeLa a dosis bajas de inhibidores de la V-ATPasa implican genes de respuesta a la disminución de hierro intracelular o disminuyendo el colesterol y que la sensibilidad a la absorción de hierro es un determinante importante de la sensibilidad V-ATPasa en varias líneas celulares de cáncer. Una de las líneas celulares más sensibles, melanoma deriva SK-Mel-5, sobre-expresa el transportador de eflujo ferroportina hierro y ha disminución de la expresión de proteínas implicadas en la absorción de hierro, lo que sugiere que suprime activamente hierro citoplasmática. SK-Mel-5 células han aumentado la producción de especies reactivas de oxígeno y se pueden tratar de limitar la producción adicional de ROS por el hierro
Visto:. Straud S, Zubovych I, JK De Brabander, Roth MG (2010) Inhibición La absorción de hierro es responsable de la sensibilidad diferencial a los Inhibidores V-ATPasa en varias líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 5 (7): e11629. doi: 10.1371 /journal.pone.0011629
Editor: Anthony Robert White, de la Universidad de Melbourne, Australia |
Recibido: 31 de diciembre de 2009; Aceptado 19 de junio de 2010; Publicado: July 16, 2010
Derechos de Autor © 2010 Straud et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas CA095471 y CA09349 del Instituto Nacional del cáncer (NCI), 5P30 AR41940 de los Institutos nacionales de Salud (NIH) y Grant I-1422 de la Fundación Robert A. Welch. La investigación se llevó a cabo en una instalación construida con el apoyo de las instalaciones de investigación del Programa de Mejoramiento Subvenciones C06-RR15437 del Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los inhibidores de la de tipo vacuolar (H +) - ATPasa (V-ATPasa) han sido investigados como agentes terapéuticos potenciales para el cáncer [1], [2] ya que muestran impresionante citotoxicidad diferencial para las 60 líneas celulares de la NCI COMPARAR panel. Además, las líneas celulares transformadas con oncogenes son más sensibles a los inhibidores de la V-ATPasa que son los de células no transformadas, líneas parentales [3], [4]. Muchas líneas celulares de cáncer de upregulate expresión de las subunidades V-ATPasa en comparación con los tejidos normales [1] y se cree V-ATPasas de desempeñar un papel en la metástasis [5], [6] y la quimiorresistencia [2], [7]. Sin embargo, los mecanismos fundamentales que determinan que las células cancerosas sean más sensibles a los inhibidores de la V-ATPasa son actualmente desconocidos. Este conocimiento es importante, ya que la inhibición de la propia V-ATPasa puede inhibir la transmisión sináptica [8]. Así, las proteínas implicadas en procesos celulares que son diferencialmente más sensibles a la inhibición de la V-ATPasa podrían ser dianas terapéuticas mejor que la propia V-ATPasa.
El V-ATPasa es un complejo grande, proteína que puede transportar protones a través de membranas en contra de un gradiente de pH y por lo tanto generar el medio ácido que se encuentra en los orgánulos endocítica, el aparato de Golgi y la red trans-Golgi [9]. Se compone de una ATPasa hexameric grande, citosólica, V
1, que se une a varios enlaces a un complejo de membrana integral, V
0. La hidrólisis de ATP por subunidades de V
1 se convierte en la rotación mecánica en V
0 que se mueve protones desde el citosol hacia el lado luminal de la membrana en la que V
0 reside. La actividad de la V-ATPasa es controlado por múltiples mecanismos de modo que cuando desmontado, V
1 no se hidroliza ATP y V
0 no gira y los protones de transporte [9]. Un número de inhibidores de la V-ATPasa son conocidos que tienen sitios de unión distintos [10].
Tanto en el secretora y los gradientes de vías endocítica de pH son esenciales para muchas funciones. El lumen del retículo endoplásmico es neutral y la del complejo de Golgi es ácida y esta diferencia se utiliza para regular la unión de ER chaperones escapado en el Golgi ácida por el receptor KDEL, que recicla para liberarlos en el ER neutral [11] . pH disminuye a través del complejo de Golgi, de modo que convertasas de prohormonas se activan en la cara de salida ácida de la red trans-Golgi y en vesículas secretoras, pero no antes en la vía de [12]. De manera similar, muchos proenzimas lisosomales son inactivos en el pH de la ruta secretora y se activan después de alcanzar el lisosoma, en donde el pH es por lo general por debajo de 5,0 [13]. En la vía endocítica, ciertos ligandos, tales como lipoproteínas de baja densidad (LDL), los receptores se unen a pH neutro en la superficie celular y se liberan cuando los receptores alcanzan endosomas ácidos [14]. De esta manera LDL se toma de manera eficiente por la célula y entrega su carga de colesterol a los lisosomas, mientras que el receptor recicla a la superficie celular para unirse más ligando. la absorción eficiente de hierro en las células también requiere un pH bajo en endosomas. La transferrina, el portador para el hierro extracelular, tiene una alta afinidad por el hierro y por su receptor de la superficie celular en el pH extracelular típica por encima de 7,0. El receptor de la transferrina se internaliza continuamente y recicla a la membrana plasmática, la realización de la transferrina a endosomas ácidos donde libera hierro. apotransferrina libre de hierro tiene una alta afinidad por el receptor a pH bajo y de baja afinidad a pH neutro. Por lo tanto, apotransferrina recicla con su receptor de nuevo a la membrana plasmática donde se libera y recupera alta afinidad por el hierro extracelular [15]. El pH bajo también se utiliza para establecer la identidad de los orgánulos endocítica. Ciertas proteínas citosólicas requieren para regular el tráfico de enlace de membrana a la cara citoplasmática de las membranas endosoma sólo cuando el pH interno del orgánulo es ácida [16]. También se requiere la acidificación de los lisosomas para el proceso de la autofagia [17]. Aunque normalmente se expresa a niveles bajos en la membrana plasmática, excepto en ciertas células de ácido secretoras, V-ATPasa es sobre-expresado en la membrana plasmática de algunas células cancerosas y puede desempeñar un papel regulador citosólica pH [5], [6], [18 ]. Cualquiera o todas estas funciones esenciales podrían ser más vulnerables a la inhibición de la V-ATPasa, en particular fondos de células de cáncer.
Para investigar la base de la sensibilidad diferencial de las células cancerosas a los inhibidores de la V-ATPasa, que han hecho uso de la observación de que las células responden a menudo al estrés hasta la regulación de los componentes críticos de las vías que son detectadas estar fallando, como por ejemplo la respuesta al fracaso del plegamiento de proteínas en el retículo endoplasmático [19]. Nuestra hipótesis es que una inhibición leve de la V-ATPasa revelará las funciones biológicas más sensibles para la enzima, que se indica por genes que primero aumentan la transcripción en respuesta a la inhibición. Probar esta hipótesis, hemos observado que las vías de regulación de hierro son más sensibles a la inhibición parcial de la V-ATPasa en las células HeLa y que algunas líneas celulares de cáncer más sensibles a los inhibidores de V-ATPasa se pueden hacer mucho más resistentes mediante la adición de hierro exógeno a el medio de cultivo. Esto sugiere que los componentes del metabolismo del hierro o el transporte pueden ser candidatos como dianas terapéuticas en ciertos tipos de cáncer, y estos tipos de cáncer se pueden identificar a través de su sensibilidad a los inhibidores de la V-ATPasa o por cambio de expresión de proteínas de transporte de hierro.
Resultados
para determinar qué rutas metabólicas se destacó por dosis bajas de inhibidores de la V-ATPasa, primero se determinó la respuesta a la dosis a dos inhibidores diferentes de la V-ATPasa en varias líneas celulares. Nos hubiera gustado encontrar una concentración de cada inhibidor que mostraría un efecto sobre el crecimiento, lo que indica que las células estaban respondiendo a los estímulos, pero que no era tan tóxico que la respuesta para la prevención o complicada por las células que mueren durante el experimento. Las líneas celulares analizadas tenían CI50 para bafilomycin A que osciló entre 10 nm y mayor de 10 micras y elegimos la línea celular moderadamente sensibles HeLa (IC50 = 150 nM) para nuestros experimentos, ya que su respuesta a la dosis relativamente poco profunda hecha para la inhibición del crecimiento más uniforme experimentos, lo que sugiere que los experimentos de expresión génica también serían más reproducible. También elegimos para comparar dos inhibidores de la V-ATPasa que actúan a través de mecanismos diferentes [20], bafilomycin A (BAF) y phenylsalicylihalamide (LX1077), para controlar los posibles efectos fuera de la meta de cada compuesto. Las concentraciones de cada compuesto que inhibe el crecimiento celular de aproximadamente 25% después de 48 horas (Figura 1) se seleccionaron para los experimentos de expresión génica. Las células HeLa se cultivaron durante una noche y luego las muestras se trataron con 15 nM Baf para 6, 12, o 24 horas, o 200 LX1077 nM durante 12 y 24 horas, y el ARN se recogió y se procesaron para el análisis por microarray. Como controles, las muestras de células HeLa tratadas por el mismo intervalo de 0,1% con DMSO (la concentración final del diluyente para Baf o LX1077 en muestras experimentales), se llevaron a cabo en paralelo con cada condición experimental. Cada condición experimental se repitió en un experimento independiente llevado a cabo en un día diferente.
Las células HeLa se cultivaron en un medio que contiene bafa o LX1077 a las concentraciones que se muestran durante 48 horas y el número de células se calcularon. Los datos se normalizan para los controles tratados con 0,1% de DMSO. Los datos son promedios de muestras por triplicado y las barras de error son SEM.
dos vías principales para la absorción de nutrientes en las células dependen de la acidez en los endosomas suministrados por la V-ATPasa. La inhibición de la V-ATPasa interferirá con la entrega de hierro en la célula mediante la prevención de la liberación de hierro de la transferrina y también evita la absorción de colesterol por inhibición de la liberación de LDL de su receptor. Por lo tanto se trataron células HeLa durante 6 o 12 horas con deferoxamina (DFO) a hierro quelato y por separado con un medio que carece de LDL para imitar la inhibición de la absorción del colesterol exógeno a través del receptor LDL. Los controles fueron pareados muestras cultivadas en medio de cultivo normal. Estas muestras se procesaron para microarrays exactamente como las muestras tratadas con inhibidores de la V-ATPasa. De esta manera podemos identificar todos los genes de responder por el aumento de la transcripción cuando el hierro se captación deficiente o LDL fue bloqueado. Los datos fueron procesados por el Fondo para el núcleo de matriz de UT Southwestern ADN Micro mediante el software GCOS con la normalización y experimentales muestras MAS5 se compararon con las muestras de DMSO tratados, o, por el DFO o las bajas de LDL, las muestras cultivadas en medio plazo normal, al mismo tiempo, para calcular la magnitud del cambio.
los genes fueron considerados para mostrar aumentado significativamente la expresión si ambas muestras en un punto de tiempo, ya sea con Baf o LX1077 tuvieron un valor P cambio de menos de 0.002 y la media de las dos muestras se incrementó más de 2 veces. En la mayoría de los casos, Baf indujo la transcripción más de LX1077, aunque los genes que responden a Baf también respondieron a LX1077. Los genes que el aumento de la transcripción temprana se muestran en las Tablas S1, S2 y la Tabla 1. Tabla S1 presenta 47 genes que el aumento de la expresión cuando las células HeLa fueron tratados con inhibidores de la V-ATPasa o con medio bajo colesterol y representan la respuesta a la inhibición de la V-ATPasa esto es debido al bloqueo de entrega de colesterol exógeno. La respuesta de la mayoría de estos genes es más rápida en presencia de los inhibidores de la V-ATPasa de lo que es medio LDL falta, tal vez porque medio LDL carente no bloquea la entrega de colesterol a partir de las partículas de LDL que son o bien unidos a su receptor en el superficie de la célula o ya liberado en la vía endocítica en el momento se añadió el medio deficiente en LDL. La mayoría de los genes se muestra en la Tabla S1 función en vías de biosíntesis de lípidos y 23 son conocidos objetivos de SREBP1 o 2 [21]. Con la excepción de EGLN1 y STARD4, ninguno de los genes que aumentan la transcripción temprana en respuesta a bajo responden LDL a la DFO quelante del hierro. EGLN1 codifica una prolilhidroxilasa dependiente del hierro que reprime la actividad de HIF-1α en condiciones de normoxia [22] y no se sabe que es sensible a la actividad de la ruta biosintética del colesterol. Sin embargo, en la levadura y los mamíferos existe diafonía entre la biosíntesis del colesterol y las vías de adaptación a la hipoxia [23], [24]. STARD4 codifica una proteína de transferencia de colesterol citosólica que es un objetivo SREBP [21] y también está regulada positivamente por el estrés ER [25] y podría ser única upregulated indirectamente por el quelante del hierro. Curiosamente, el aumento de la transcripción de INSIG1, que codifica un regulador negativo de los factores de transcripción SREBP que controlan la biosíntesis del colesterol, es una de las respuestas más rápidas a los inhibidores de la V-ATPasa. Esto es posiblemente un mecanismo de retroalimentación negativa para limitar la respuesta transcripcional vez que las vías metabólicas de lípidos han aumentado la producción de colesterol endógeno [26].
Tabla S2 enumera 64 genes que aumentaban la transcripción de más rápido cuando se quelatado de hierro y también responder a la inhibición de la V-ATPasa. Estos son los genes en las vías que, presumiblemente, responden a la inhibición de la liberación de hierro de la transferrina en endosomas cuando se inhibe la V-ATPasa. Al menos 29 de estos genes son conocidos objetivos de HIF-1α y responder a la hipoxia. Como era de esperar, estos genes funcionan en muchas vías. La aldolasa C es un objetivo HIF-1α [27] y está fuertemente regulada positivamente por los inhibidores de V-ATPasa. A pesar de que no detectó un aumento temprano en la aldolasa C en las células tratadas con medio LDL bajo, aldolasa C es también un objetivo conocido de SREBPs [21]. Aldolasa C se une a la V-ATPasa [28] y en la levadura es responsable de la regulación de la glucosa de la actividad V-ATPasa [29], [30]. Desde aldolasa C responde a la hipoxia en las células epiteliales del pulmón y a los inhibidores de V-ATPasa en las células HeLa, mientras que el más abundante enzima glicolítica aldolasa A no lo hace, es posible que una función importante de la aldolasa C en respuesta a la falta de hierro o hipoxia es para regular la V-ATPasa como parte del mecanismo para asegurar la homeostasis del hierro. HIF-1α es reprimida principalmente por ser hidroxilado en prolina por prolyhydroxylases dependientes de hierro, que se dirige para la degradación [31]. Por inmunotransferencia, se encontró que la incubación de células HeLa en 15 nM Baf para 1 hr estabilizado HIF-1α (datos no presentados), lo que sugiere que las vías reguladas por HIF-1α están entre las más sensibles a la inhibición de la V-ATPasa. Por lo tanto, los inhibidores de la V-ATPasa proporcionan un medio más eficaz para enganchar las vías de HIF-1a experimentalmente.
La Tabla 1 presenta 7 genes que el aumento de la transcripción en respuesta a los inhibidores de V-ATPasa, pero no en células HeLa tratadas con bajo LDL medio o con el quelante de hierro. Estos son candidatos para vías que detectan la falta de actividad V-ATPasa de forma independiente del efecto sobre la transferrina o LDL. Aparte de CLCN6, estos genes no están fuertemente regulados por incremento y varios de ellos están implicados en el control del ciclo celular y el crecimiento y pueden ser una primera parte de la inhibición del crecimiento que se producirá después de la incubación más largo en los inhibidores. CLCN6 es un canal de cloruro que se encuentra en neuronas y células epiteliales [32], [33], y se localiza en los endosomas tardíos [33]. Los canales de cloruro en endosomas trabajan en concierto con V-ATPasa y la regulación al alza de este modo CLCN6 puede ser una respuesta a la pérdida de la función endosoma tardío. SREBF2 (SREBP2) es un regulador importante de la biosíntesis de colesterol y es principalmente regulada post-transcripción por el tráfico de membrana y la proteólisis [34]. El aumento de la transcripción modesto es probable equilibrado por el aumento de la expresión del inhibidor de la activación de SREBP, INSIG1.
Tabla 2 presenta los resultados de tomar un análisis menos restrictiva de los genes que cambian en las células HeLa tratadas con 15 nM Baf durante 6 horas. Todos los genes que mostraron un cambio estadísticamente significativo (cambio de valor de P & gt; 0,00025), independientemente de la dirección del cambio se analizaron con Ingenuity Pathways para determinar qué vías canónicas en la base de datos ingenio fueron enriquecidos en los genes que se han cambiado en respuesta a Baf. Rutas que respondieron de manera significativa a Baf contenían muy pocos genes que disminución de la expresión, lo que confirma nuestra hipótesis de que la respuesta temprana sería el aumento de la expresión génica. Con mucho, las vías más afectadas de manera significativa fueron la biosíntesis de esteroides, seguidos por la glucólisis, y los genes implicados en su mayor parte también identificados por nuestro análisis más restrictiva.
Después de intervalos más largos de tratamiento con inhibidores de la V-ATPasa, 52 genes que habían aumentado en respuesta a las 12 horas en un medio de cultivo bajo LDL también mostraron una mayor expresión en las células tratadas durante 24 horas con los inhibidores de la V-ATPasa (Tabla S3). Ocho de los genes de respuesta de colesterol que se upregulated anterior ya no aumentaron la proporción y 15 genes de respuesta de colesterol nueva indicaron un aumento en la transcripción, con 6 de estas proteínas que codifican implicados en las vías de biosíntesis de lípidos. 104 genes "de hierro de respuesta" (Tabla S4) se incrementaron en las células tratadas con inhibidores de la V-ATPasa durante 24 horas, incluyendo un número de genes que codifican enzimas glicolíticas o represores de la función mitocondrial, factores de transcripción y proteínas que regulan el crecimiento celular. STXBP1, que codifica el regulador Munc-18 de fusión de la membrana, mostró modesto aumento en respuesta a cualquiera de agotamiento de colesterol o de hierro y un aumento más fuerte en las células tratadas con inhibidores de la V-ATPasa. Este es uno de los pocos genes que codifican proteínas que regulan el tráfico de membrana que incrementa en respuesta a la inhibición de la V-ATPasa (HIP1R, SV2A y OPTN fueron los otros). Sesenta y dos genes aumento de la expresión al menos dos veces en respuesta a la inhibición de la V-ATPasa durante 24 horas, pero no responden al colesterol medio deficiente o DFO (Tabla S5). Este conjunto de genes se analizó utilizando el software Ingenuity Pathways para identificar las vías metabólicas en las que los genes estaban reguladas al alza de forma significativa (Figura 2). Con mucho, la respuesta más significativa fue en genes implicados en la biosíntesis de lípidos y esteroides.
Los genes en el cuadro S4 se analizaron con Ingenuity Pathways asignarlos a las vías canónicas. El porcentaje de genes en la vía en este conjunto de datos, y la importancia del cambio se muestran.
Como era de esperar, si se consideran tanto los aumentos y disminuciones en la expresión génica, después de 24 horas en Baf hay una respuesta complicado que implica una serie de vías que controlan el crecimiento y la respuesta al estrés (Tabla S6). El más importante de ellos es la respuesta al estrés oxidativo NRF2 mediada, lo que sugiere que la inhibición de la V-ATPasa aumenta especies reactivas del oxígeno. Como componentes importantes de la vía de la respiración mitocondrial requieren hierro, y la inhibición de la fosforilación oxidativa pueden producir ROS, los cambios en las rutas mediadas NRF2 podría ser una consecuencia secundaria de la inhibición de la importación de hierro de la transferrina.
Nuestra intención original en la consecución de estos estudios era investigar las causas de la respuesta diferencial a los inhibidores de la V-ATPasa observados en las células cancerosas. Debido a que las principales respuestas inmediatas a la inhibición de la V-ATPasa fueron a la falta de hierro o el colesterol, se investigó si estos eran responsables de la hipersensibilidad de algunas células cancerosas a los inhibidores de la V-ATPasa (Figura 3). Se midió la dosis-respuesta de cáncer cervical derivadas de HeLa, líneas celulares de melanoma derivadas pequeña no línea de cáncer de pulmón de células H1299, cáncer de mama MCF-7 y Morris Hepatoma (MH) las células SK-MEL-5 y SK-MEL-28, a Baf en presencia o ausencia de 150 mM de citrato de hierro. Baf tenía concentraciones de IC50 muy similares para HeLa, MCF7 y H1299. Tanto las células MH y SK-Mel-5 eran 10 veces más sensible que la HeLa, y SK-Mel-28 fueron muy insensibles (Figura 3). Para Hela, SK-Mel-5 y SK-Mel-28 también a prueba el efecto de la adición de colesterol entregado en células con metil-β-ciclodextrina, lo que añade colesterol a la membrana plasmática [26]. La adición de hierro al medio de células HeLa hizo 20 veces más resistente a la inhibición del crecimiento causada por 20 a 200 nM bafilomicina, pero proporcionan poca protección a los efectos citotóxicos observados a concentraciones más elevadas (Figura 3). El colesterol fue de protección para las células HeLa, pero no por las células SK-Mel-5 células Baf-sensibles o resistentes Baf SK-Mel-28 (Figura 4). Esto indica que los efectos citostáticos de los inhibidores de V-ATPasa en las células HeLa son en gran parte debido a la inhibición de la absorción de hierro y el colesterol, pero los efectos citotóxicos se deben a una alternativa, y todavía desconocido, función. Complementando H1299, MCF7 o la línea celular de melanoma más sensible SK-Mel-5 con hierro los protegía a concentraciones más bajas de Baf similares a las células HeLa (Figura 3). De hecho, las células MCF7 o SK-Mel-5 tratados con hierro y bafilomicina tenían una respuesta a la dosis notablemente similar a las células HeLa tratadas con bafilomicina solo, lo que sugiere que estas líneas celulares eran particularmente sensibles a la inhibición de la absorción de hierro. Ni el hierro ni el colesterol tenían ningún efecto protector sobre la línea celular altamente resistente la línea celular MH bastante sensible SK-Mel-28 o.
La dosis-respuesta de seis líneas celulares de cáncer a Baf en presencia o ausencia de se determinó 150 mM citrato de hierro tal como se describe en la leyenda de la figura 1.
las curvas de dosis-respuesta de células HeLa, SK-MEL-5 y SK-MEL-28 células a Baf en la presencia o ausencia de colesterol exógeno entregado a las células por metil-β-ciclodextrina se determinó como se describe en la leyenda a la figura 1.
para investigar el mecanismo de la citotoxicidad inducida por Baf en SK-Mel-5 y HeLa células , se trataron células de cada línea con 0 a 1000 nM Baf durante 24 horas y luego se investigó la escisión de PARP o la caspasa 3 como señales para la inducción de la apoptosis (Figura 5). En ambas líneas celulares Baf indujo apoptosis después de 24 horas; sin embargo, la concentración requerida era más de 20 veces menor para SK-Mel-5 que las células HeLa, muy similares a las diferencias en las dosis letales para las dos líneas celulares. Por lo tanto, la citotoxicidad resultante de la inhibición de la V-ATPasa en la línea celular hipersensible SK-Mel-5 es a través de la inducción de la apoptosis.
HeLa y SK-Mel-5 células se trataron con las concentraciones indicadas de Baf para 24 horas y después se prepararon para la inmunotransferencia con anticuerpos para escindido PARP o la caspasa 3. escinden las proteínas escindidas aparecen en concentraciones mucho más bajas de Baf en SK-MEL-5 células en comparación con HeLa, con la diferencia de concentración entre la aparición de la proteína similar a la escindido las diferencias en las dosis letales para las dos líneas celulares. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de dos experimentos independientes.
Tanto SK-Mel-5 células y células MCF7 fueron más sensibles a Baf que las células HeLa y esta diferencia en la sensibilidad fue abolida por la suplementación del medio de cultivo con hierro (Figura 3). De este modo se determinó la expresión de proteínas implicadas en la absorción de hierro, de almacenamiento o de flujo de salida en estas líneas celulares y células HeLa (Figura 6). SK-Mel-5 células expresan el receptor de transferrina menos que cualquiera de las otras dos líneas de células y niveles muy bajos de DMT1, el transportador responsable de hierro móvil a través de la membrana del endosoma al citoplasma. Sorprendentemente, SK-Mel-5 células expresan altos niveles de la plancha transportador de eflujo, ferroportina, que transporta el hierro a través de la membrana plasmática y fuera de la célula. Ferroportin no se detectó en cualquiera de las otras dos líneas celulares. SK-Mel-5 células expresaron menos ferritina de células HeLa, de acuerdo con tener bajos niveles de hierro citoplasmática. En conjunto, este patrón de expresión sugiere que SK-Mel-5 células se mantienen activamente niveles relativamente bajos de hierro citoplásmicos. En contraste, las células MCF7 tenían niveles de receptor de transferrina similar a las células HeLa, el aumento de expresión de DMT1 y niveles muy bajos de la proteína de almacenamiento de hierro, ferritina. Este es un patrón de expresión compatibles con una célula que tiene niveles bajos de hierro citoplasmáticos y ha upregulated mecanismos de transporte de hierro en respuesta. Por lo tanto, SK-MEL-5 células y células MCF7, aunque ambos hipersensibles a Baf debido a la inhibición de la absorción de hierro, diferían en los mecanismos moleculares que subyacen a esta vulnerabilidad.
La expresión de receptor de transferrina 1, ferritina y ferroportina en células HeLa y SK-Mel-5 en presencia o ausencia de DFO se midió por inmunotransferencia. En relación con las células HeLa, SK-Mel-5 han disminución de la expresión de receptor de transferrina y ferritina y un gran aumento en la expresión de la proteína de eflujo ferroportina hierro. TfR, receptor de transferrina. DMT1, metal divalente transportador 1. FPN1, ferroportina 1. FTH, cadena pesada de ferritina H. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de dos experimentos independientes.
Las diferencias en la expresión del receptor de la transferrina y la ferroportina en SK-Mel-5 células no se debe a una incapacidad para regular estas proteínas en respuesta al hierro. Cuando SK-Mel-5 células o células HeLa fueron tratadas con DFO para quelar hierro, tanto la expresión upregulated de receptor de transferrina (Figura 7). En respuesta a DFO, la expresión del receptor de transferrina en células SK-Mel-5 células era muy similar a la de HeLa, lo que indica que los mecanismos para expresar el receptor en respuesta a hierro estaban intactos en SK-Mel-5 células. DFO tratamiento disminuyó la expresión de ferroportina y ferritina en SK-Mel-5 células, como cabría esperar de una célula se esfuerza por mantener los niveles de hierro celulares. Por lo tanto, los mecanismos para la regulación de estas proteínas por el hierro eran también intacto en SK-Mel-5 células. Cuando SK-Mel-5 células fueron tratadas con Baf, sino que también aumentaron la expresión del receptor de la transferrina y la disminución de la ferritina. Sin embargo, la expresión de la ferroportina se incrementó significativamente. Puesto que el hierro quelantes disminución de la expresión ferroportina en-5 SK-Mel células, esta respuesta se debió a algún otro efecto de la inhibición de la V-ATPasa.
Tratamiento de HeLa o SK-MEL-5 células con 100 M DFO para 24 hrs resultó en un aumento de la expresión del receptor de transferrina en ambas líneas celulares, y una disminución en la ferroportina y ferritina en SK-Mel-5 células. tratamiento Baf tuvo un efecto similar, con la excepción de que la expresión ferroportina en SK-Mel-5 células se incrementó en Baf. Las células HeLa no expresó ferroportina y SK-Mel-5 células tenían muy baja expresión de DMT1. TfR, receptor de transferrina. DMT1, metal divalente transportador 1. FPN1, ferroportina 1. FTH, cadena pesada de ferritina H. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de dos experimentos independientes.
Una posible razón de una célula a deprimir de forma activa los niveles de hierro citoplasmáticos sería para proteger contra la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por hierro. Para investigar si SK-Mel-5 células podrían estar produciendo más ROS, etiquetamos células SK-MEL-5 y HeLa con colorantes que aumentan la fluorescencia en presencia de ROS. Las células se fotografiaron con idénticos ajustes de la cámara y las intensidades de fluorescencia de las células fueron medidos utilizando el software Image J. SK-Mel-5 células producidas significativamente más ROS que las células HeLa, medidos con ambos colorantes (Figura 8).
A. Las células se marcaron con la sonda sensible H2O2 DCF, o la sonda sensible superóxido DHE, como se describe en los métodos. Las células se fotografiaron con ajustes de la cámara idénticos. B. Las células fluorescentes se describen en J de la imagen y se midió la fluorescencia dentro de las células individuales y se representan con GraphPad Prism.
Desde 5-SK-Mel células parecían tener niveles bajos de hierro intracelular y eran hipersensibles a Baf, lo que disminuiría aún más la absorción de hierro, se determinó la sensibilidad de SK-Mel-5 células al quelante del hierro DFO (Figura 9). Como era de esperar, SK-Mel-5 células eran hipersensibles a DFO en comparación con las células HeLa. De hecho, DFO fue sólo citostático para las células HeLa, mientras que fue citotóxica para SK-Mel-5. La adición de hierro exógeno al medio de cultivo de células de SK-Mel-5 o HeLa células no tuvo efecto sobre el crecimiento celular (datos no presentados).
Las células se trataron con las concentraciones de DFO se muestran como se describe en Métodos y después de se contaron las células 72 horas. Dos pocillos para cada concentración fueron contados, y el número promedio de dos experimentos independientes se graficaron +/- SEM, n = 2.
Tres observaciones sugieren que la expresión de la ferroportina puede ser inducida por ROS en SK- células Mel-5. SK-Mel-5 células tenían tanto el aumento de la producción de ROS y el incremento en la expresión ferroportina. Una de las principales vías inducidos por el tratamiento Baf de células HeLa durante 24 horas fue la respuesta antioxidante mediada por NRF2, lo que sugiere que el tratamiento Baf podría aumentar ROS. Baf inducida en lugar de la expresión ferroportina reprimido en células SK-Mel-5 células, mientras que reducir los niveles de hierro con DFO disminución de la expresión ferroportina. Si la expresión ferroportina fue inducida por ROS, a continuación, el tratamiento de células SK-MEL-5 con el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) se esperaría para disminuir la expresión ferroportina. Cuando SK-Mel-5 las células fueron tratadas durante 48 horas con concentraciones crecientes de NAC, la expresión ferroportina se redujo (Figura 10). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que el 5-SK-Mel células son vulnerables a la inhibición de la absorción de hierro debido a que mantienen bajas reservas de hierro, tal vez para protegerse de la generación de niveles tóxicos de ROS.
SK-Mel-5 células fueron tratados con NAC como se describe en los métodos y luego procesados por inmunotransferencia con anticuerpos contra las proteínas que se muestran. TfR, receptor de transferrina. FPN1, ferroportina 1. FTH, cadena pesada de ferritina H. Las inmunotransferencias se muestran son representativos de dos experimentos independientes.
Discusión
A pesar de una serie de líneas celulares derivadas de tumores o líneas celulares transformadas por oncogenes son altamente sensibles a los inhibidores de la V-ATPasa, problemas de toxicidad en animales, particularmente neurotoxicidad, han impedido el desarrollo de estos inhibidores como agentes anti-cáncer. El problema obvio es que la V-ATPasa es una enzima importante responsable de muchos procesos celulares fundamentales y la inhibición de que tendrá muchos efectos en muchos tipos de células. Esto a su vez sugiere que la hipersensibilidad de las células cancerosas a los inhibidores de V-ATPasa debe ser debido a una vulnerabilidad en uno o más de los muchos procesos que requieren la V-ATPasa y que la identificación de estas vulnerabilidades podría revelar dianas terapéuticas que pueden ser explotados con menos tóxico efectos sobre los tejidos normales. Nuestros datos muestran que la inhibición de la absorción de hierro por los inhibidores de V-ATPasa es un determinante importante de la sensibilidad diferencial de líneas celulares de cáncer a estos inhibidores, lo que sugiere que los mecanismos que controlan los niveles intracelulares de hierro pueden ser objetivos terapéuticos útiles para ciertos tumores.